百里醌對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制

鐘甫華 江彬鋒 曾宇晴 黃愷 陸建偉

●論 著

百里醌對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制

鐘甫華 江彬鋒 曾宇晴 黃愷 陸建偉

目的 探索關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射百里醌對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 選用新西蘭大白兔構(gòu)建動物模型，分為百里醌組、骨關(guān)節(jié)炎組和假手術(shù)組各20只，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)大白兔6min內(nèi)步行距離。術(shù)后9周處死動物取左膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行大體組織學(xué)Gross評分，切片行蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅染色后進(jìn)行組織病理學(xué)Mankin評分，采用RT-PCR檢測3組大白兔關(guān)節(jié)軟骨中基底金屬蛋白酶-13（MMP-13）、基底金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和2型膠原（CollagenⅡ）等靶基因表達(dá)水平。 結(jié)果 百里醌組大白兔的行走距離明顯大于骨關(guān)節(jié)炎組（P＜0.05）；而Gross評分、Mankin評分均低于骨關(guān)節(jié)炎組（均P＜0.05）。與骨關(guān)節(jié)炎組比較，百里醌組MMP-13mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)水平明顯上升（均P＜0.05）。 結(jié)論 百里醌對兔骨關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，可以減少疼痛，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。百里醌可能通過下調(diào)MMP-13mRNA表達(dá)，上調(diào)TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。

百里醌 骨關(guān)節(jié)炎 動物模型

骨關(guān)節(jié)炎是一種多見于中老年人的退行性疾病，它是機(jī)械性因素和生物性因素相互作用的結(jié)果。該病主要表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞與基質(zhì)形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物力學(xué)的改變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨軟化和纖維化、軟骨下骨硬化，形成骨贅和軟骨下骨囊腫[1]。骨關(guān)節(jié)炎的典型臨床特征是關(guān)節(jié)疼痛、運(yùn)動受限、捻發(fā)音、關(guān)節(jié)滲液和關(guān)節(jié)炎癥。目前主要應(yīng)用非甾體抗炎藥、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射類固醇激素或透明質(zhì)酸鈉等藥物治療[2]，但這些藥物只能起到緩解癥狀的作用，并不能從根本上延緩關(guān)節(jié)軟骨的漸進(jìn)性退變。因此，尋找能阻斷骨關(guān)節(jié)炎自然病程的藥物已成為研究的熱點(diǎn)[3]。近年來的研究表明骨關(guān)節(jié)炎的主要病理學(xué)特征是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、2型膠原（CollagenⅡ）]漸進(jìn)性丟失是骨關(guān)節(jié)炎早期伴軟骨退變的一種最主要的病理學(xué)變化[4-8]。百里醌是一種從中東國家的黑種草籽油中分離出來的主要有效單體，除了具有強(qiáng)大的抑瘤作用（抑制乳腺癌[9]、胰腺癌[10]和前列腺癌[11]等腫瘤細(xì)胞的生長）外，還能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生長[12]。有文獻(xiàn)報道百里醌能調(diào)控機(jī)體中與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)的信號通路，有望成為治療骨關(guān)節(jié)炎的有效藥物[13]。故本研究選擇新西蘭大白兔建立骨關(guān)節(jié)炎動物模型，使用百里醌進(jìn)行治療，以觀察對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 百里醌10g（CAS 490-91-5，上海阿拉丁公司）溶于磷酸鹽緩沖液（500g，17 202，美國Sigma公司）中，制備成100μmol/L的百里醌溶液；番紅染色劑（25g，39 955，美國Sigma公司）；Trizol試劑（100ml，T9424,美國Sigma公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（000000010109118001，美國Sigma公司）；PCR試劑（XNAB2-1KT，美國Sigma公司）；熒光定量PCR儀器（QuantStudio 7，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性新西蘭大白兔60只，體重2.5～ 3.0kg，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。開始實(shí)驗(yàn)前，所有大白兔先在動物房適應(yīng)1周。隨機(jī)分為3組，每組20只。（1）百里醌組：所有大白兔用25%氨基甲酸乙酯（4ml/kg，上海瑞生物技術(shù)公司）作靜脈麻醉，經(jīng)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，直視下切斷前交叉韌帶，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合關(guān)節(jié)腔；分籠飼養(yǎng)；術(shù)后3d，每天予肌肉注射青霉素40萬U；膝關(guān)節(jié)（踝關(guān)節(jié)以上3cm、腹股溝以下1.5cm處）彎曲30°～40°，用石膏綁帶制動4周；足背動脈可及。成功構(gòu)建模型后每3d檢測松緊度并適當(dāng)調(diào)整；分籠飼養(yǎng)，禁止隨機(jī)移動。術(shù)后4周開始在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射預(yù)先配置好的百里醌溶液0.1ml，每周連續(xù)注射5d，共5周。（2）骨關(guān)節(jié)炎組：相同方法建模、固定及飼養(yǎng)。術(shù)后4周開始在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液0.1ml，每周連續(xù)注射5d，共5周。（3）假手術(shù)組：采用相同的手術(shù)入路暴露關(guān)節(jié)腔，顯露前交叉韌帶后不切斷，逐層縫合切口；術(shù)后固定、飼養(yǎng)方法同上。關(guān)節(jié)腔內(nèi)不注射任何藥物。

1.3 方法

1.3.1 疼痛相關(guān)行為學(xué)評估 將實(shí)驗(yàn)大白兔放進(jìn)測試屋適應(yīng)30min后，再放進(jìn)一個有機(jī)玻璃方形空間內(nèi)自由行走，并對其進(jìn)行視頻錄像。骨關(guān)節(jié)炎的疼痛相關(guān)行為學(xué)評估結(jié)果用大白兔6min內(nèi)步行距離表示。

1.3.2 大體組織學(xué)評分 術(shù)后9周所有大白兔在25%氨基甲酸乙酯靜脈麻醉下，耳緣靜脈注射20ml空氣處死。行大腿內(nèi)側(cè)切口，在膝關(guān)節(jié)上方0.5cm處分離股四頭肌。取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，包含股骨髁。依照實(shí)驗(yàn)盲法的原則，由高年資的病理科和骨科各1位醫(yī)師在手術(shù)顯微鏡下觀察股骨髁軟骨表面退變情況，按照Gross評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評分：關(guān)節(jié)面完整，色澤如常為0分；關(guān)節(jié)面粗糙，有小裂隙且色澤灰暗為1分；關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表層或中層為2分；關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層為3分；軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露為4分。

1.3.3 組織學(xué)檢查 取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨，在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗干凈；在甲醛溶液中固定24h，使用快速脫鈣液（RLG3801，中國上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司）脫鈣2d；石蠟包埋，5μm厚切片；分別作HE染色、番紅染色。依據(jù)盲法原則，由高年資病理科和骨科各1位醫(yī)師根據(jù)Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)對軟骨切片進(jìn)行定量評分；若兩者評分結(jié)果不一致，則共同討論并達(dá)成共識。

1.3.4 RT-PCR檢測靶基因mRNA表達(dá)水平 取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨組織10mg置于1m l Trizol中勻漿并提取總的RNA。取2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。每個樣本重復(fù)3次，以18S核糖體RNA為內(nèi)參。使用試劑盒行PCR擴(kuò)增反應(yīng)（5ng cDNA，45個循環(huán)：95℃10s，60℃25s）?；|(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）、基底蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、Aggrecan、CollagenⅡ、18S引物設(shè)計(jì)和合成均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，具體引物見表1。運(yùn)用2-△△Ct來分析基因相對表達(dá)水平，△△Ct=（Ct靶基因-Ct內(nèi)參）百里醌治療組-（Ct靶基因-Ct內(nèi)參）對照組。

表1 各基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 疼痛相關(guān)行為學(xué)評估結(jié)果 百里醌組大白兔的行走距離為（962±22）cm，明顯大于骨關(guān)節(jié)炎組的（590± 22）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 大體標(biāo)本觀察結(jié)果 假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，未見關(guān)節(jié)液明顯增多及滑膜明顯增生；百里醌組關(guān)節(jié)液增多，滑膜增生較明顯，關(guān)節(jié)周圍韌帶及軟組織無明顯增生、增厚，關(guān)節(jié)軟骨色澤變暗，軟骨表面小面積糜爛和潰爛，關(guān)節(jié)周圍偶見小型骨贅可見；骨關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)液明顯增加且色澤渾濁，關(guān)節(jié)囊、韌帶及滑膜增生、肥厚，關(guān)節(jié)軟骨色澤變暗，可見較深的潰瘍，部分可見軟骨下骨質(zhì)暴露。百里醌組大白兔股骨髁關(guān)節(jié)軟骨Gross評分低于骨關(guān)節(jié)炎組（P＜0.05）；但與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果 百里醌組Mankin評分低于骨關(guān)節(jié)炎組（P＜0.05），見圖3。HE染色：假手術(shù)組關(guān)節(jié)表面光滑完整，關(guān)節(jié)軟骨層次完整，無炎性細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組比較，骨關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)軟骨的層次結(jié)構(gòu)受到破壞，部分被增生組織替代；百里醌組軟骨上層中度組織失衡，但中、下層可見正常的軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨組織，見圖4。番紅染色：假手術(shù)組軟骨組織分層正常，潮線完整；百里醌組軟骨組織分層無明顯破壞，表層略不平整，潮線基本完整，偶見少量簇聚細(xì)胞，染色輕度減退，特別是軟骨表層明顯；骨關(guān)節(jié)炎組可見表面纖維化，細(xì)胞排列紊亂，潮線不規(guī)則，簇聚細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加，染色不均勻褪色，見圖5。

圖1 3組大白兔疼痛相關(guān)行為學(xué)評估結(jié)果（與骨關(guān)節(jié)炎組比較，*P＜0.05）

圖2 3組大白兔股骨髁關(guān)節(jié)軟骨Gross評分（與骨關(guān)節(jié)炎組比較，*P＜0.05）

圖3 3組大白兔股骨髁關(guān)節(jié)軟骨切片Mankin評分（與骨關(guān)節(jié)炎組比較，*P＜0.05）

圖4 3組大白兔股骨髁關(guān)節(jié)軟骨切片HE染色結(jié)果（a：假手術(shù)組；b：骨關(guān)節(jié)炎組；C：百里醌組；×100）

圖5 3組大白兔股骨髁關(guān)節(jié)軟骨切片番紅染色結(jié)果（a：假手術(shù)組；b：骨關(guān)節(jié)炎組；c：百里醌組；×100）

2.4 3組關(guān)節(jié)軟骨靶基因mRNA表達(dá)水平比較 與骨關(guān)節(jié)炎組比較，百里醌組MMP-13mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)水平明顯上升（均P＜0.05），見圖6。

3 討論

兔骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨損傷、滑膜炎病程進(jìn)展較大型動物更為迅速[14]，適用于抗骨關(guān)節(jié)炎藥物的實(shí)驗(yàn)探索。目前有研究推崇的兔骨關(guān)節(jié)炎模型是膝關(guān)節(jié)固定制動的，即利用石膏綁帶制動膝關(guān)節(jié)，在彎曲位置容易誘發(fā)關(guān)節(jié)炎；其機(jī)制是關(guān)節(jié)和肌肉的攣縮、負(fù)重表面積的增加以及軟骨生物力學(xué)的改變均會導(dǎo)致軟骨退變[15]。Okazaki等[16]發(fā)現(xiàn)造模1周后關(guān)節(jié)軟骨就發(fā)生退變；Kojima等[17]發(fā)現(xiàn)造模后完全屈曲石膏制動4周，出現(xiàn)了不可逆的軟骨病變。因此，相比于藥物注射、創(chuàng)傷誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎模型，離斷前叉后膝關(guān)節(jié)制動方法誘導(dǎo)的軟骨改變更符合膝骨關(guān)節(jié)的自然病程。本研究在離斷膝前叉韌帶后制動4周引起膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變符合典型的膝骨關(guān)節(jié)炎病變。由于股骨內(nèi)髁是膝關(guān)節(jié)著力的主要部位，該部位的軟骨退變形態(tài)最能體現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的病變特征；因此，筆者采集股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)評估。

圖6 3組大白兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-13、TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)水平（與骨關(guān)節(jié)炎組比較，*P＜0.05）

本研究采取宏觀形態(tài)學(xué)（Gross評分）與微觀形態(tài)學(xué)（Mankin評分）相結(jié)合的軟骨評分系統(tǒng)來評價百里醌對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。本研究結(jié)果證實(shí)百里醌組Gross評分、Mankin評分均低于骨關(guān)節(jié)炎組；這說明經(jīng)前交叉韌帶離斷術(shù)且4周制動飼養(yǎng)后，大白兔關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了典型的降解破壞形態(tài)特征，而百里醌在一定程度上延緩了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，對關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)具有保護(hù)作用。番紅特異性結(jié)合基質(zhì)中蛋白多糖的著色深淺可以反映軟骨蛋白多糖含量，本研究番紅染色結(jié)果顯示百里醌組軟骨細(xì)胞仍在旺盛地合成基質(zhì)，提示百里醌組軟骨細(xì)胞受到百里醌的保護(hù)作用，并且產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)合成能力，可以延緩蛋白多糖的丟失。RT-PCR檢測結(jié)果顯示與骨關(guān)節(jié)炎組比較，百里醌組關(guān)節(jié)軟骨MMP-13mRNA表達(dá)水平明顯降低，而TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)水平明顯上升；這與組織病理學(xué)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了百里醌對軟骨基質(zhì)的保護(hù)作用。軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)主要由CollagenⅡ、Aggrecan組成，而MMP家族是分解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)最重要的因子。目前有研究表明百里醌能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平從而抑制腫瘤細(xì)胞的血管化[18]。而本研究結(jié)果提示百里醌對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用可能通過下調(diào)MMP-13mRNA表達(dá)，上調(diào)TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

目前治療骨關(guān)節(jié)炎的主要藥物有非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥、阿片類藥物、透明酸鈉的替代療法、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素等。以上藥物均有緩解骨關(guān)節(jié)炎的作用，但無法緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變性病變，多數(shù)骨關(guān)節(jié)炎晚期患者因無法忍受關(guān)節(jié)疼痛、肢體活動障礙而接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)。因此，理想的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物不僅能緩解關(guān)節(jié)代謝過程中的炎性介質(zhì)，還能改善關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)。本研究證實(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射百里醌對關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)具有保護(hù)作用，可以減少疼痛，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展；可能通過下調(diào)MMP-13mRNA表達(dá)，上調(diào)TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達(dá)的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用，為臨床藥物治療骨關(guān)節(jié)炎提供了一種新思路。

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Protective effects of thymoquinone on cartilage in rabbit osteoarthritis model

ZHONG Fuhua, JIANG Binfeng, ZENG Yuqing, et al.Departments of Orthopedics, Zhejiang Provincial Tongde Hospital, Hangzhou 310012, China

To evaluate the effects of intra- articular injection of thymoquinone on cartilage in rabbit osteoarthritis model. Methods Sixty New Zealand rabbits were randomly divided into treatment group, model group and control group with 20 in each group. Knee osteoarthritis model was established in thymoquinone and model groups, and sham operation was performed in control group, intraarticular injection of thymoquinone was given to treatment group. The walking distance within 6min was observed and recorded. Rabbits were sacrificed and samples of left knees were collected 9 wks after operation. Gross scores, HE staining, safranin O staining and Mankin score were evaluated. Real- time polymerase chain reactive (PCR) was performed to analysis the mRNA level of MMP- 13, TIMP- 1, aggrecan, collagen Ⅱ in cartilage tissue. Results Compared with model group, the thymoquinone group showed better pain related behavior scores (P＜0.05). Gross score and Mankin score showed that the cartilage lesions of thymoquinone group were less severe than that of model group. The expression of mmp- 13mRNA was lower and the expressions of timp- 1, aggrecan and collagen II mRNA were higher in thymoquinone group than those in model group(P＜0.05). Conclusion Thymoquinone shows protective effects on cartilage, and can delay the disease progress and improve the pain related behavior scores in rabbit osteoarthritis model, which may be associated with down- regulation of mmp- 13 expression and up- regulation of timp- 1, aggrecan, collagenⅡexpression.

Thymoquinone Osteoarthritis Animal model

2016-12-18）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-2129

浙江省公益性應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37131)

310012杭州，浙江省立同德醫(yī)院骨科

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