利用ITS-RFLP標(biāo)記輔助篩選白靈側(cè)耳與杏鮑菇雜交菌株

譚 笑，滕立平，滕 星，鳳 鵬，楊大海，李啟云，溫嘉偉，

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

利用ITS-RFLP標(biāo)記輔助篩選白靈側(cè)耳與杏鮑菇雜交菌株

譚 笑1，2，3，滕立平3，滕 星2，鳳 鵬2，楊大海2，李啟云2，溫嘉偉2，3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

為提高白靈側(cè)耳菌株、杏鮑菇菌株及其雜交菌株篩選效率及鑒定的準(zhǔn)確性，利用ITS-RFLP標(biāo)記輔助單核雜交技術(shù)對白靈側(cè)耳與杏鮑菇的雜交菌株進(jìn)行了篩選.對5份白靈菇菌株和4份杏鮑菇菌株進(jìn)行了種間配對雜交，根據(jù)親本菌株交配型將其分成7個組合進(jìn)行雜交.結(jié)果表明：9份親本材料共具有6個A因子和7個B因子.利用該技術(shù)對雜交處理后的菌株樣品進(jìn)行篩選，獲得了3份雜交菌株11D、53D、70D，其中雜交菌株11D與53D的菌絲生長速度與親本菌株相比較差異顯著；雜交菌株70D的菌絲生長速度與親本菌株XB130DB相比較差異顯著，而與親本菌株BL130DB在菌絲生長速度上差異不顯著.

分子標(biāo)記；雜交菌株；交配型

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)和白靈側(cè)耳(Pleurotuseryngiivar.tuoliensisC.J.Mou)(亦稱白靈菇)是親緣關(guān)系相近的兩種側(cè)耳屬食用菌新品種，也是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的大型珍稀食用菌品種[1].

核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列標(biāo)記的建立在保護(hù)菌種知識產(chǎn)權(quán)上有著重要的意義；同時，對于食用菌菌株是否發(fā)生變異，以及作為雜交育種材料時雜交菌株的分子標(biāo)記鑒別等也有重要的作用.王波、姚一建等[2]對白靈菇原基組織分離菌株P(guān)n622進(jìn)行了ITS 4&5序列分析，建立了ITS序列分子標(biāo)記；姜超、馮志勇等[3]采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)兩種分子標(biāo)記技術(shù)，系統(tǒng)分析了包括中國白靈菇商業(yè)菌株和歐洲Pleurotusnebrodensis菌株在內(nèi)的34株側(cè)耳屬菌株的DNA多態(tài)性.限制性片斷長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RELP)作為一種分子標(biāo)記技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地鑒別品種，有效評價種間遺傳多樣性，利用限制性內(nèi)切酶對食用菌菌株進(jìn)行處理，通過得到的酶切片段差異能夠?qū)κ秤镁M(jìn)行分類.杏鮑菇與白靈菇在菌絲體生長階段、原基分化前期的相似特性及子實體分化形成過程中相近的農(nóng)藝性狀使得生產(chǎn)中極易造成菌種資源混亂、產(chǎn)品農(nóng)藝性狀混淆等問題.本研究利用白靈菇及杏鮑菇ITS保守區(qū)域構(gòu)建了一套ITS-RFLP標(biāo)記輔助檢測方法，可在菌絲體階段準(zhǔn)確、快速地鑒定白靈菇菌株、杏鮑菇菌株及白靈菇與杏鮑菇雜交菌株[4].

1 材料與方法

1.1 材料

供試親本菌株由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物平臺菌種資源庫提供，共9份親本菌株：BL130DA，BL130DB，BL130LA，BL130LB，BL140Z，XB120DA，XB130DA，XB130DB，XB140Z1(見表1)；其他材料為PDA固體培養(yǎng)基、DNA提取試劑盒、Dra-I酶、Xsp-I酶.

表1 親本菌株信息

1.2 方法

1.2.1 親本菌株的培養(yǎng)

無菌條件下，將單孢分離純化后的親本菌株轉(zhuǎn)接到低糖PDA固體培養(yǎng)基中(葡萄糖5%，瓊脂粉4%)培養(yǎng)，菌塊大小1 cm×1 cm，18℃避光培養(yǎng)5～7 d，待菌株活化，菌絲體長度3～5 cm時，顯微鏡下標(biāo)記單核區(qū)域用于挑取.

1.2.2 單核菌絲體的標(biāo)記及挑取

顯微鏡4×40倍下觀察親本菌株生長狀態(tài)，選取單個視野下只具有單核的菌絲區(qū)域標(biāo)記[5]，無菌條件下，利用接種工具將標(biāo)記的菌塊挑出置于新的PDA培養(yǎng)基中，菌塊不大于0.5 cm×0.5 cm，18℃避光培養(yǎng)備用.

1.2.3 親本菌株交配型的確定

將已選出的單核親本菌株進(jìn)行隨機(jī)配對組合，分別接入PDA平板培養(yǎng)基中，菌株間距1.0 cm，22℃恒溫避光培養(yǎng)，7～10 d后觀察拮抗菌絲體鎖狀聯(lián)合情況，選取基準(zhǔn)交配型，所有單核菌株分別與交配型基準(zhǔn)株交配，確定其交配型.[6]

1.2.4 雜交菌株的培養(yǎng)

將交配型不同的親本菌株進(jìn)行配對組合，同一組合的親本單核菌株挑取到PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組各進(jìn)行3次重復(fù)處理，22℃恒溫避光培養(yǎng)，7～10 d后挑取拮抗菌絲體轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，22℃恒溫、避光、震蕩培養(yǎng)7～10 d后，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.5 菌株DNA的提取及純化

提取：將供試菌株研磨至粉末狀后裝入離心管中，加入1 mL SDS-DNA提取液，37℃水浴30 min后加入200 μL 5 mol/L的NaCl，充分混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入500 μL Tris飽和酚混勻；12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入500 μL 氯仿、異戊醇混合液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，充分混勻；12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混合均勻后靜置30 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用預(yù)冷的75%乙醇洗滌，室溫沉淀20 min；12 000 r/min離心3 min，反復(fù)洗滌離心3次后，棄上清液，干燥后的沉淀物按量加TE溶解，-20℃下保存?zhèn)溆?

純度檢測利用紫外吸收檢測法：利用無菌水在260 nm和280 nm兩個波長下將分光光度計校零；將DNA樣品2 μL，用水稀釋100倍，轉(zhuǎn)入石英比色杯中，在260 nm和280 nm處分別讀取樣品光密度值.

1.2.6 ITS序列的擴(kuò)增

以ITS1G(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，利用2×Taq PCR MasterMix對模板進(jìn)行ITS序列的擴(kuò)增，按以下條件設(shè)置：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s；72℃后延伸5 min.其中變性、復(fù)性、延伸重復(fù)進(jìn)行35個循環(huán).

1.2.7 ITS-RFLP檢測

利用Dra-I和Xsp-I限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增出的ITS序列進(jìn)行酶切處理(ITS產(chǎn)物6 μL，Dra-I或Xsp-I酶0.6 μL，buffer 1.0 μL，ddH2O 2.4 μL)，處理時間4 h，處理溫度37℃.酶切反應(yīng)完成后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

1.2.8 雜交菌株與親本菌株菌絲生長速度的比較

將大小為1 cm×1 cm的雜交菌株菌塊與親本菌株菌塊分別轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中，每份材料3次重復(fù)，22℃避光培養(yǎng)，每天記錄菌絲生長速度，待長滿平板后計算平均值，利用新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析比較差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 親本交配型及單核雜交

本試驗通過對不同親本的單核菌株進(jìn)行交配，以BL130DA菌株為基準(zhǔn)交配型A1B1的交配因子，可與之形成鎖狀聯(lián)合進(jìn)行配子融合的交配型為A2B2.以此類推，BL130DB菌株的交配型為A1B2，與形成鎖狀聯(lián)合并進(jìn)行配子融合的交配型為A2B1.結(jié)果表明，供試9份親本菌株的交配因子是不同的，其中存在6個特異的A因子和7個特異的B因子(見表2)，分別占供試單核體數(shù)的67%和74%.在9個親本菌株中，A，B因子的重復(fù)頻率分別為13.2%和31.4%，A因子的A1，A2，A3各出現(xiàn)3次，A4出現(xiàn)4次，A5，A6各出現(xiàn)2次.B因子的B1，B3，B4出現(xiàn)3次，B2，B5，B7各出現(xiàn)2次，B6出現(xiàn)1次.根據(jù)本實驗中9份親本菌株間交配型的特異性，選出7組交配型可用于進(jìn)行雜交試驗的親本組合(見表3).7份親本組合的21個雜交處理，經(jīng)培養(yǎng)后13個處理的PDA平板內(nèi)出現(xiàn)菌絲拮抗現(xiàn)象，8個處理的PDA平板中無菌絲拮抗出現(xiàn)，出現(xiàn)拮抗菌絲的平板說明挑取轉(zhuǎn)接到平板內(nèi)培養(yǎng)的兩個親本單核菌絲體均復(fù)活生長，通過對13個拮抗菌絲體(包括11D、53D、70D)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測確定是否進(jìn)行了核融合.

表2 親本菌株的交配型不親和性因子

表3 親本交配型及雜交組合

2.2 ITS-RFLP輔助單核雜交法選育白靈菇雜交菌株

2.2.1 菌株DNA的提取

利用SDS法提取供試親本菌株與雜交處理材料的DNA，通過優(yōu)化酶解的時間、抽提試劑配比及沉淀過程的溫度和時間，可高效將菌株的核酸與多糖、蛋白等物質(zhì)分離，得到的菌株DNA樣品經(jīng)過紫外分光光度計檢測D(λ)值，均可用于PCR擴(kuò)增及酶切處理，如圖1所示.本研究提取的親本DNAD(λ)值，均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)值1.81±0.03以內(nèi)(見表4)，因此該方法提取的DNA樣本質(zhì)量可保證后續(xù)的ITS檢測及酶切試驗進(jìn)行.

M：Marker;1：BL130DA；2：BL130DB；3：XB130DA；4：XB130DB；5：XB140Z1；6：11D；7：53D；8：70D

測定項目BL130DAXB130DAXB140Z1BL130DBXB130DB11D53D70DD(260)1.021.071.041.010.991.031.021.05D(280)0.560.590.580.560.540.560.560.58D(260)/D(280)1.821.811.791.801.831.801.821.81

2.2.2 ITS序列的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增序列經(jīng)凝膠電泳檢測，得到的片段大小在600～700 bp之間(見圖2)，純化后進(jìn)行測序(由上海華大公司完成)，與NCBI中Genebank數(shù)據(jù)庫比對分析，親本白靈菇與杏鮑菇比對結(jié)果與數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)同源性達(dá)95%以上，而雜交菌株序列則需要通過限制性內(nèi)切酶的酶切進(jìn)行驗證.

M：Marker；1：BL130DA；2：BL130DB；3：XB130DA；4：XB130DB；5：XB140Z1；6：11D；7：53D；8：70D

2.2.3 ITS-RFLP檢測

為保障實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，ITS擴(kuò)增產(chǎn)物分別用兩種不同酶(Dra-I和Xsp-I)進(jìn)行酶切驗證，凝膠電泳成像后，同時具有兩個親本白靈菇與杏鮑菇遺傳信息的確認(rèn)為雜交菌株，如圖3所示.檢測結(jié)果表明13份供試菌株樣品中，有3份為雜交菌株，編號為11D、53D、70D.

M：Marker；1：BL130DA(Dra-I酶處理)；2：53D(Dra-I酶處理)；3：XB140Z1(Dra-I酶處理)；4：BL130DA(XspI酶處理)；5：53D(Xsp-I酶處理)；6：XB140Z1(XspI酶處理)11D；7：53D(ITS).

2.2.4 雜交菌株與親本菌株菌絲生長速度的比較

試驗結(jié)果表明，得到的3份雜交菌株11D和53D的生長速度均高于親本白靈菇而低于親本杏鮑菇，雜交菌株70D的生長速度和其親本白靈菇速度相同而低于親本杏鮑菇(見圖4).通過新復(fù)極差法(SSR)對雜交菌株與親本菌株菌絲生長速度進(jìn)行差異比較，其中第一組(BL130DA，11D，XB130DA)雜交菌株與親本比較結(jié)果為：當(dāng)V=6，P=3時，R0.05=0.009 9，R0.0，1=0.010 4，yXB130DA-y11D=0.144(cm/d)，y11D-yBL130DA=0.149(cm/d)，雜交菌株11D的菌絲生長速度與親本菌株相比較差異顯著，其菌絲生長速度高于親本菌株BL130DA，而低于XB130DA；第二組(BL130DA，53D，XB140Z1)雜交菌株與親本比較結(jié)果為：當(dāng)V=6，P=3時，R0.05=0.011 0，R0.0，1=0.010 4，yXB140Z1-y53D=0.115(cm/d)，y53D-yBL130DA=0.254(cm/d)，雜交菌株53D的菌絲生長速度與親本菌株相比較差異顯著，其菌絲生長速度高于親本菌株BL130DA，而低于XB140Z1；第三組(BL130DB，70D，XB130DB)雜交菌株與親本比較結(jié)果為：當(dāng)V=6，P=3時，R0.05=0.021 7，R0.0，1=0.035 7，yXB130DB-y70D=0.275(cm/d)，y70D-yBL130DB=0.023 4(cm/d)，雜交菌株70D的菌絲生長速度與親本菌株XB130DB相比較差異顯著，而與親本菌株BL130DB在菌絲生長速度上差異不顯著.如果雜交菌株其他農(nóng)藝性狀符合商品化栽培要求，其優(yōu)勢可體現(xiàn)在生長周期較白靈菇縮短、不易感染雜菌等方面.[7]

圖4 雜交菌株與親本菌株生長速度

3 討論

圖5 四極性真菌交配型配對概率

(1) 白靈菇與杏鮑菇均屬四極性多等位基因異宗配合的真菌，其交配型系統(tǒng)由A，B兩對不親和性因子控制，這些因子位于分開的染色體上，減數(shù)分裂時獨立分離，每一個因子都有許多等位基因.它們的孢子有性世代分為質(zhì)配、核配和減數(shù)分裂三個階段.通過減數(shù)分裂能形成4種不同交配型A1B1，A2B2，A1B2，A2B1的孢子，一般1個交配型只能與4個交配型中的1個交配(即只有A≠B時)，形成子實體.[8-9]二者進(jìn)行交配型的配對從而進(jìn)入有性生殖階段，而形成可發(fā)育的合子的概率約為25%(見圖5)[10-11].

(2) 借助單核化方法可以從一個雙核體中重新找到組成該雙核體的兩個單核成員.現(xiàn)有的單核化方法主要有4種：機(jī)械處理、化學(xué)處理、原生質(zhì)體法及菌絲饑餓法.其中機(jī)械處理法得到的細(xì)胞存活量較?。换瘜W(xué)處理法使用的藥劑有毒性殘留[12]；原生質(zhì)體法在制備原生質(zhì)體過程中菌絲體的菌齡、狀態(tài)與酶用量對原生質(zhì)體質(zhì)量都有影響，操作步驟復(fù)雜不易得到高質(zhì)量的原生質(zhì)體[13].因此，本研究采用菌絲饑餓法將7對雜交組合的親本材料進(jìn)行了菌絲饑餓處理，采用少糖、低溫的處理方法抑制菌絲體中核的發(fā)育.通過鏡檢標(biāo)記單核菌絲區(qū)域后挑取到新的PDA培養(yǎng)基中重新培養(yǎng).白靈菇與杏鮑菇均屬異宗結(jié)合，其營養(yǎng)親和系統(tǒng)與交配型系統(tǒng)彼此獨立存在，來自于兩個不同親本的單核體是否融合正?？赏ㄟ^出菇實驗進(jìn)行驗證.但出菇實驗的周期較長，不利于生產(chǎn)實際操作.我們通過ITS-RFLP的檢測方法驗證菌株初期的雜交，可有效縮短檢測雜交菌株的周期，加速育種效率.ITS-RFLP分子標(biāo)記檢測法是建立在ITS鑒定真菌物種及屬內(nèi)物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析上開發(fā)出的一種新方法，它是根據(jù)ITS擴(kuò)增序列的兩個特性作為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計的[14].首先rDNA上的5.8S，18S和28S rRNA基因上具有的極大保守性，即存在著廣泛的異種同源性區(qū)域擴(kuò)增[15]；其次，絕大多數(shù)真核生物在此區(qū)域都表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使親緣關(guān)系接近的兩個物種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異[16]，因此基于以上兩個特性，我們通過擴(kuò)增后的ITS序列片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的篩選，篩選出的Dra-I和Xsp-I均可用于區(qū)分白靈菇、杏鮑菇菌株.

(3) 分子標(biāo)記技術(shù)目前在食用菌中得到廣泛的應(yīng)用，包括香菇、雙孢菇、平菇等推廣較好的食用菌菇種都已經(jīng)開始利用分子標(biāo)記的方法進(jìn)行農(nóng)藝性狀及理化性質(zhì)等方面的標(biāo)記，而食用菌由于菇種繁多，不同菇種的栽培料配方、生活史及生長條件都存在較大差異，使得食用菌育種工作量巨大且煩瑣，因此開發(fā)更多與蘑菇農(nóng)藝性狀、生理特性等相關(guān)的分子標(biāo)記并進(jìn)行精細(xì)定位，不僅可以在人工育種中快速利用優(yōu)良性狀，同時可以縮短人工育種的周期，提高育種效率，也可以為利用生物信息學(xué)研究蘑菇的遺傳機(jī)理提供豐富的菌種資源[17-18].

本實驗的創(chuàng)新點在于將傳統(tǒng)單核菌株雜交技術(shù)與現(xiàn)代分子標(biāo)記方法相結(jié)合進(jìn)行菌株的篩選，為白靈菇或杏鮑菇品種選育提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法和依據(jù)，提高了育種效率，同時也為鑒定白靈菇與杏鮑菇菌種的真實性提供了可靠的檢測方法.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Breeding selection hybrid strains ofP.eryngiivar.tuoliensisandPleurotuseryngii
by ITS-RFLP molecular marker assisted monokaryogenesis hybrid method

TAN Xiao1，2，3，TENG Li-ping3，TENG Xing2，F(xiàn)ENG Peng2，YANG Da-hai2，LI Qi-yun2，WEN Jia-wei2，3

(1.Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130124，China;3.Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin，China Xinjiang Production & Construction Corps，Alaer 843300，China)

Using ITS-RFLP markers assisted monokaryogenesis hybrid method for screening test the hybrid strains ofP.eryngiivar.tuoliensisC.J.Mou strains andPleurotuseryngii.This method can improve efficiency and accuracy for screening the hybrid strains.This test intraspecific hybrid between fiveP.eryngiivar.tuoliensisC.J.Mou strains and fourPleurotuseryngiistrains，and divided seven hybrid combinations according to the parent strain mating type .The results show that nine parent strains have six factor A and seven factor B，hybrid samples for this method testing has three hybrid strains:11D，53D and 70D.Hybrid strains 11D and 53D has significant difference on hypha growth rate which compared with the parent strains.The hybrid strains 70D has only significant difference on hypha growth rate which compared with the parental strain XB130DB，but no significant difference compared with the parental strain BL130DB.

molecular marker；hybrid strains；mating type

1000-1832(2017)02-0105-06

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.02.020

2016-09-28

省部共建國家重點實驗室培育基地開放課題(BRYB1403)；吉林省重點科技攻關(guān)項目(20150204061NY).

譚笑(1988—)，男，碩士研究生；通訊作者：溫嘉偉(1980—)，男，博士，副研究員，主要從事食用菌研究.

S 182，S 646 [學(xué)科代碼] 210·2070

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