魚腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表達與純化

王小琴，李至敏，雷國風(fēng)，李志敏,3*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045)

魚腥藻PCC 7120中all3556蛋白的表達與純化

王小琴1，李至敏2，雷國風(fēng)1，李志敏1,3*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045)

琥珀酸半醛脫氫酶在生物體中發(fā)揮重要的生理功能。通過BLAST序列分析，發(fā)現(xiàn)魚腥藻PCC 7120中all3556基因編碼琥珀酸半醛脫氫酶。實驗通過常規(guī)PCR從魚腥藻PCC 7120基因組中克隆了all3556基因，將該基因構(gòu)建到pET-28a載體上并在大腸桿菌BL21(DE3)菌體中表達。經(jīng)過SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明：all3556蛋白可以在該表達體系中高效可溶性表達。利用鎳親和層析純化方法得到了純度大于95%的all3556蛋白，蛋白收率約為27 mg/g菌體。研究為進一步闡明all3556蛋白的催化功能及機制奠定了重要基礎(chǔ)。

魚腥藻PCC 7120；all3556蛋白；蛋白表達與純化

藍藻，又名藍綠藻、藍細菌，是目前發(fā)現(xiàn)的最早的光合釋氧生物[1]。目前已知的藍藻種類超過2000種，在地球上的分布十分廣泛，遍及世界各地[2]。魚腥藻PCC 7120是一種在化合態(tài)氮缺乏時能夠形成異型細胞進行固氮生長的絲狀藍細菌[3]。自從2001年其全基因組序列測序完成后[4]，魚腥藻PCC 7120已經(jīng)成為藍藻研究的模式生物之一。

由于在藍藻中沒有檢測到α-酮戊二酸脫氫酶[5]，長久以來藍藻都被認為不具備完整的三羧酸循環(huán)[6]。2011年的研究發(fā)現(xiàn)：在聚球藻PCC 7002中存在α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶[7]，這2個酶的作用是將α-酮戊二酸經(jīng)過琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化成琥珀酸，從而使得藍藻的三羧酸循環(huán)變得完整[8-9]。在聚球藻PCC 7002中編碼琥珀酸半醛脫氫酶的基因是a2771基因。通過BLAST序列分析，本研究組發(fā)現(xiàn)在魚腥藻PCC 7120中存在一個與a2771基因高度同源的all3556基因(堿基序列同源性為64.6%)，同時all3556和a2771蛋白的氨基酸序列同源性達到65.5%。因此，all3556蛋白也極有可能是琥珀酸半醛脫氫酶。

琥珀酸半醛脫氫酶(Succinic Semialdehyde Dehydrogenase,SSADH,EC 1.2.1.79)是一類NAD(P)+依賴型的氧化還原酶，催化琥珀酸半醛到琥珀酸的氧化反應(yīng)，廣泛存在于從細菌到哺乳動物等各種生物體內(nèi)。在細菌中，SSADH對于維持細胞內(nèi)的碳氮代謝平衡至關(guān)重要[10]。在真核生物中，SSADH在γ-氨基丁酸(GABA)代謝旁路途徑發(fā)揮著重要作用[9,11-12]。在正常生理狀態(tài)下，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA在GABA轉(zhuǎn)氨酶作用下將氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上，生成谷氨酸和琥珀酸半醛，琥珀酸半醛經(jīng)SSADH催化生成琥珀酸從而進入三羧酸循環(huán)。對于人類而言，SSADH缺乏癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，會導(dǎo)致精神運動性阻滯、語言遲緩、行為障礙和驚厥等多種疾病[13-14]。在植物中SSADH缺失表現(xiàn)為不同的發(fā)育和表型變化等[15-16]。

由于SSADH廣泛存在于各種生物體內(nèi)，不同來源的SSADH在底物催化活性及NAD(P)+輔因子偏好性上有所差別。因此為了深入研究來源于魚腥藻PCC 7120的SSADH的催化機制，本研究首先從魚腥藻PCC 7120基因組中擴增all3556基因，將其連接到pET-28a載體后，通過大腸桿菌表達純化得到all3556蛋白。初步試驗表明：all3556蛋白是一個琥珀酸半醛脫氫酶，能夠催化琥珀酸半醛到琥珀酸的轉(zhuǎn)化(未發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究為進一步闡明all3556蛋白的催化功能及機制奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達載體pET-28a為本實驗室保存；魚腥藻PCC 7120基因組來自中科院青島生物能源與過程研究所呂雪峰研究員實驗室。

1.2 工具酶和主要試劑

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自NEW ENGLAND BioLabs公司；T4 DNA連接酶，5K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Protein Marker購自Thermo scientific公司；2×Taq Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA購自QIAGEN公司；所用引物、質(zhì)粒測序由上海祥音生物科技有限公司合成和完成；其他主要試劑均為分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的基因的PCR擴增 以魚腥藻PCC 7120基因組(1 μL)為擴增模板，all3556-NdeⅠ(0.5 μL)和all3556-XhoⅠ(0.5 μL)為上下游引物(表1)，引物終濃度為0.2 pmol/μL。加入2×Taq Mix 25 μL后加滅菌水23 μL至總體積50 μL。擴增反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保溫。

表1 PCR引物序列

注：斜體為相應(yīng)酶切位點。

1.3.2 pET28a-all3556重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收的all3556基因片段。酶切反應(yīng)體系如下：目的基因片段30 μL(約1 μg)，10×CutSmart緩沖液5 μL，NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶各1 μL，加滅菌水至50 μL。將反應(yīng)體系置于37 ℃培養(yǎng)箱中2 h后用瓊脂糖凝膠回收酶切片段。用同樣的方法酶切pET-28a載體。之后于16 ℃金屬浴恒溫下用T4 DNA連接酶過夜連接酶切all3556基因片段與pET-28a線性片段(目的片段與載體片段的摩爾比為3∶1)。連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(50 μL)后，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽性克隆。將經(jīng)菌落PCR驗證正確的陽性克隆搖菌后送檢測序。

1.3.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-all3556轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基上于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)。將單克隆菌落加入到10 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃，180 r/min下過夜培養(yǎng)。然后按1%接種量將過夜培養(yǎng)液加入至1000 mL LB液體培養(yǎng)基中(含有50 μg/mL卡那霉素)進行菌體擴大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600至0.6時加入IPTG(終濃度0.2 mmol/L)于20 ℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 all3556重組蛋白的分離純化 離心得到的菌體用10倍體積的binding buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液)重懸，于冰水浴中超聲破碎27 min(超聲工作2 s，間歇8 s，有效功率4%)。菌體裂解液于12000 r/min，4 ℃下離心30 min得到菌體上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，將Ni-NTA樹脂和過濾后的上清液混合于燒杯中磁力攪拌1 h，重新裝柱后使用咪唑進行濃度梯度洗脫，分別收集每個濃度的流出液，用SDS-PAGE檢測目的蛋白。合并含有目的蛋白的洗脫液后，于4 ℃下采用10K密理博超濾離心管脫鹽濃縮，然后用Bradford方法對目的蛋白進行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-all3556表達載體的構(gòu)建與鑒定

用魚腥藻PCC 7120基因組作為模板，經(jīng)PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳后獲得約1.4 kb大小的DNA條帶，該基因片段與all3556基因理論大小(1368 bp)相吻合(圖1)。將雙酶切后的目的基因片段和pET-28a載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆搖菌后提取質(zhì)粒。對提取的pET28a-all3556質(zhì)粒進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，可見與目的片段大小相符的條帶(圖2)。將該質(zhì)粒進行DNA測序，測序結(jié)果表明：該基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的all3556基因序列完全一致。因此，構(gòu)建得到了pET28a-all3556表達載體。

M：DNA marker；1、2：PCR產(chǎn)物

M:DNA marker；1：雙酶切產(chǎn)物；2：陽性克隆質(zhì)粒

2.2 all3556重組蛋白的誘導(dǎo)表達

含有pET28a-all3556表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌液在20 ℃，180 r/min 培養(yǎng)條件下經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)24 h后的表達情況如圖3所示。all3556基因的堿基數(shù)為1368 bp，編碼一個含有455個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其分子量為48821.75 Da，與圖3中泳道1～4中約50 kDa的條帶相一致。泳道1～3為細胞破碎液，加樣體積分別為2、4、8 μL。泳道4為細胞破碎液離心后上清液，加樣體積為8 μL。由圖3可知，all3556重組蛋白的表達量較高。另外由于泳道4的目的蛋白量接近于泳道3的目的蛋白量，因此all3556重組蛋白的溶解性非常好。

2.3 all3556重組蛋白的分離純化

將含有目的蛋白的上清液與Ni-NTA溫和攪拌1 h后裝柱，用含有20～200 mmol/L咪唑的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)進行洗脫。親和層析純化如圖4所示，當(dāng)咪唑濃度增加到60 mmol/L時，少量all3556蛋白被洗脫。大部分all3556蛋白在咪唑濃度為200 mmol/L時被洗脫。合并圖4中泳道6～8的洗脫液后脫鹽濃縮，得到純度大于95%的蛋白。用Bradford方法對濃縮后的蛋白進行濃度測定，最終得到蛋白濃度為35 mg/mL，蛋白收率約27 mg/g菌體。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1：2 μL細胞破碎液；2：4 μL細胞破碎液；3：8 μL細胞破碎液；4：8 μL離心后上清液

M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1：離心后上清液；2：流穿液；3～9：咪唑洗脫液(咪唑濃度分別為20、40、60、100、200、200、200 mmol/L)

圖4 all3556重組蛋白的親和層析純化后電泳

3 結(jié)論與討論

本文通過BLAST序列分析發(fā)現(xiàn)魚腥藻PCC 7120中all3556蛋白與聚球藻PCC 7002中a2771蛋白的氨基酸序列同源性達到65.5%，而a2771蛋白已被證實為琥珀酸半醛脫氫酶[7,17-18]，是聚球藻PCC 7002三羧酸循環(huán)中的一個關(guān)鍵酶[7]，因此推測all3556蛋白為琥珀酸半醛脫氫酶。

本研究通過常規(guī)PCR技術(shù)從魚腥藻PCC 7120基因組中成功克隆得到all3556基因，然后將其連接到pET-28a載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆經(jīng)測序正確后得到表達質(zhì)粒pET28a-all3556。表達質(zhì)粒pET28a-all3556轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞后得到表達菌株。研究表明：pET28a-all3556重組子在大腸桿菌BL21(DE3)中能高效表達并且表達的蛋白大部分為可溶性蛋白。破碎菌體后通過Ni親和層析方法獲得純度較高的all3556蛋白，蛋白收率達到27 mg/g菌體。SDS-PAGE測得的all3556蛋白的分子量約為50 kDa，與all3556蛋白的理論分子量(48821.75 Da)比較接近。正在測試的試驗數(shù)據(jù)表明：當(dāng)用NADP+作輔因子時，all3556蛋白可以催化琥珀酸半醛到琥珀酸的轉(zhuǎn)化。當(dāng)用pH 8.5、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液時，all3556蛋白的催化活性最高，其Km為0.01 mmol/L(琥珀酸半醛為反應(yīng)底物)，kcat為0.4 s-1(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此all3556蛋白是一個琥珀酸半醛脫氫酶。對all3556蛋白的詳細酶動力學(xué)參數(shù)及結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的測定正在進行中。

聚球藻PCC 7002中a2770和a2771基因分別編碼α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶[7]，這2個酶使得聚球藻PCC 7002的三羧酸循環(huán)變得完整。研究發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)海洋藍藻外，大部分藍藻都存在與a2770、a2771同源性較高的基因[7]。在魚腥藻PCC 7120中與a2770、a2771同源的基因分別是all3555、all3556，其基因同源性分別為77.3%、65.3%?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明：all3556蛋白是琥珀酸半醛脫氫酶。因此為了證實魚腥藻PCC 7120中三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，all3555基因是否編碼α-酮戊二酸脫羧酶值得研究。

致謝：本課題研究得到了教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目的支持，謹致謝意!

[1] Falcon L I, Magallon S, Castillo A. Dating the cyanobacterial ancestor of the chloroplast[J]. The ISME Journal, 2010, 4(6): 777-783.

[2] Stanier R Y, Cohen-Bazire G. Phototrophic prokaryotes: the cyanobacteria[J]. Annual Review of Microbiology, 1977, 31(1): 225-274.

[3] Shi Y, Zhao W, Zhang W, et al. Regulation of intracellular free calcium concentration during heterocyst differentiation byHetRandNtcAinAnabaenasp. PCC 7120[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2006, 103(30): 11334-11339.

[4] Kaneko T, Nakamura Y, Wolk C P, et al. Complete genomic sequence of the filamentous nitrogen-fixing cyanobacteriumAnabaenasp. strain PCC 7120[J]. DNA Research, 2001, 8(5): 205-213.

[5] Smith A J, London J, Stanier R Y. Biochemical basis of obligate autotrophy in blue-green algae and thiobacilli[J]. Journal of Bacteriology, 1967, 94(4): 972-983.

[6] Ohashi Y, Shi W, Takatani N, et al. Regulation of nitrate assimilation in cyanobacteria[J]. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(4): 1411-1424.

[7] Zhang S, Bryant D A. The tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria[J]. Science, 2011, 334(6062): 1551-1553.

[8] 龍昊知，李至敏，王小琴，等.集胞藻PCC 6803中sll1981基因的克隆與表達研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,37(6):1076-1079.

[9] Steinhauser D, Fernie A R, Araujo W L. Unusual cyanobacterial TCA cycles: not broken just different[J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(9): 503-509.

[10] Schneider B L, Reitzer L. Pathway and enzyme redundancy in putrescine catabolism inEscherichiacoli[J]. Journal of Bacteriology, 2012, 194(15): 4080-4088.

[11] Fait A, Fromm H, Water D, et al. Highway or byway: the metabolic role of the GABA shunt in plants[J]. Trends in Plant Science, 2008, 13(1): 14-19.

[12] Kim K J, Pearl P L, Jensen K, et al. Succinic semialdehyde dehydrogenase: biochemical-molecular-clinical disease mechanisms, redox regulation, and functional significance[J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2011, 15(3): 691-718.

[13] Kim Y G, Lee S, Kwon O S, et al. Redox-switch modulation of human SSADH by dynamic catalytic loop[J]. The EMBO Journal, 2009, 28(7): 959-968.

[14] Parviz M, Vogel K, Gibson K M, et al. Disorders of GABA metabolism: SSADH and GABA-transaminase deficiencies[J]. Journal of Pediatric Epilepsy, 2014, 3(4): 217-227.

[15] Bouche N, Fait A, Bouchez D, et al. Mitochondrial succinic-semialdehyde dehydrogenase of the gamma-aminobutyrate shunt is required to restrict levels of reactive oxygen intermediates in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2003, 100(11): 6843-6848.

[16] Toyokura K, Watanabe K, Oiwaka A, et al. Succinic semialdehyde dehydrogenase is involved in the robust patterning ofArabidopsisleaves along the adaxial-abaxial axis[J]. Plant and Cell Physiology, 2011, 52(8): 1340-1353.

[17] Park J, Rhee S. Structural basis for a cofactor-dependent oxidation protection and catalysis of cyanobacterial succinic semialdehyde dehydrogenase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(22): 15760-15770.

[18] Yuan Z, Yin B, Wei D, et al. Structural basis for cofactor and substrate selection by cyanobacterium succinic semialdehyde dehydrogenase[J]. Journal of Structural Biology, 2013, 182(2): 125-135.

(責(zé)任編輯：曾小軍)

Expression and Purification of Protein all3556 fromAnabaenasp. PCC 7120

WANG Xiao-qin1, LI Zhi-min2, LEI Guo-feng1, LI Zhi-min1,3*

(1. College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 3. Jiangxi Provincial Engineering Laboratory for Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, Nanchang 330045, China)

Succinic semialdehyde dehydrogenase plays important physiological roles in the prokaryotes and eukaryotes. BLAST sequence analysis reveals that the geneall3556 inAnabaenasp. PCC 7120 encodes succinic semialdehyde dehydrogenase. The geneall3556 was cloned from the genome ofAnabaenasp. PCC 7120 by conventional PCR. Then the plasmid of pET-28a-all3556 was constructed by ligatingall3556 gene with pET-28a vector, and the expression ofall3556 in the competent cells ofEscherichiacolistrain BL21 (DE3) was observed. The results of SDS-PAGE showed that the protein all3556 could high-efficiently express in soluble form in this system. The protein all3556 was purified by Ni-NTA affinity chromatography, its purity was more than 95%, and its yield was about 27 mg/g wet cell. This study will lay an important base for further illustrating the catalytic function and mechanism of all3556 protein in the future.

Anabaenasp. PCC 7120; all3556 protein; Protein expression and purification

2016-12-12

國家自然科學(xué)基金項目(31400054和31560250)；江西省自然科學(xué)基金重大項目(20161ACB21012)。

王小琴(1993—)，女，江西上饒人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者：李志敏。

Q936

A

1001-8581(2017)05-0001-04