正交法優(yōu)選亮菌多糖脫色工藝研究

黃純 王小平 程海濤 姜晟

摘要[目的]建立亮菌多糖脫色的最佳方法。[方法]以色素脫除率作為主要考察指標(biāo)，通過單因素考察和正交法優(yōu)化亮菌多糖脫色工藝。[結(jié)果]D152樹脂、45 ℃、pH 5.0為最佳脫色條件。[結(jié)論]D152作用后色素脫除率高，糖保留率高，有益于下一步分離純化。

關(guān)鍵詞脫色素；亮菌多糖；工藝優(yōu)化；正交法

中圖分類號S567.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0133-02

Study on Decoloration Technique of Armillariella Polysaccharide by Orthogonal Experiments

HUANG Chun，WANG Xiaoping，CHENG Haitao et al

（China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211196）

Abstract[Objective] The research aimed to establish the optimum method of decoloration about Armillariella polysaccharide.[Method]Taking the decoloring ratio as main index， the optimum decoloring technique were established through single factorial test and orthogonal experiments.[Result]The best method of decoloration were obtained as follows： D152 resins working in pH 5.0 and 45 ℃. [Conclusion]The decoloring ratio of D152 and the reteion rate of polysaccharide are high， which is beneficial to the next step.

Key wordsDecoloration；Armillariella polysaccharide；Technology optimization；Orthogonal method

亮菌學(xué)名白蘑科假密環(huán)菌[Armillariella tabescens（Scop.EX.Fr）Sing]，是我國在20世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種真菌[1]。筆者前期從亮菌發(fā)酵菌粉中經(jīng)熱水提取、Sevag法去蛋白、乙醇沉淀等步驟得到亮菌多糖（Armillariella polysaccharide，ALP）粗品[2]，再經(jīng)DEAE-纖維素色譜柱純化后得2種多糖ALP1和ALP2，初步的藥效試驗已表明ALP2具有較好的抗腫瘤活性[3]。但在研究中也發(fā)現(xiàn)，亮菌多糖粗品中的色素在柱層析中不易脫除，是阻礙其純品分離純化、結(jié)構(gòu)確定、作用機理、構(gòu)效關(guān)系研究的瓶頸之一。因此，對亮菌多糖粗品進行脫色，一方面可以改善多糖的外觀、提高亮菌多糖的純度，另一方面也可為后續(xù)的各項研究打下基礎(chǔ)?；陔x子交換樹脂和吸附樹脂已有用于糖漿脫色的報道[4-5]，該試驗嘗試將其應(yīng)用于亮菌多糖粗品脫色，通過對不同類型樹脂的脫色效果和脫色條件的考察，找出能夠有效脫除粗品中色素的工藝，為亮菌多糖的生產(chǎn)和研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

亮菌多糖粗品（自制）；大孔陽離子樹脂D151、D152，大孔陰離子交換樹脂D280、D201GF，大孔吸附樹脂D4006、D3520、AB-8，天津波鴻樹脂科技有限公司；硫酸、苯酚、葡萄糖 、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；其余試劑皆為國產(chǎn)分析純。722分光光度計，上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1樹脂預(yù)處理。

去離子水反復(fù)洗滌樹脂至無泡沫。陽離子交換樹脂用5%鹽酸、5%NaOH、5%鹽酸，陰離子交換樹脂用5%NaOH、5%鹽酸、5%NaOH，各依次浸泡4 h，每次浸泡后以去離子水清洗至中性。吸附樹脂以5%鹽酸、5%NaOH依次浸泡4 h，每次浸泡后皆以去離子水清洗至中性，再用95%乙醇浸泡12 h，用去離子水洗至無醇味。

1.2.2樹脂的篩選。

分別向圓底燒瓶中加入一定量預(yù)處理的D151、D152、 D280、D201GF、 D4006、D3520、AB-8樹脂和濃度為1 mg/mL的ALP粗品溶液，調(diào)pH至中性，55 ℃水浴恒溫振蕩2 h，過濾，測定濾液的脫色率、糖保留率。

1.2.3測定方法及計算。

1.2.3.1脫色率的測定。調(diào)節(jié)pH至（7.0±0.1），5 000 r/min離心20 min后過濾，在420 nm處測定光密度值。

脫色率=（OD脫色前-OD脫色后）/OD脫色前×100%。

1.2.3.2糖含量測定及多糖保留率的計算。采用硫酸-苯酚法[6]測定糖含量。

多糖保留率=M前/M后×100%，

式中，M前、M后分別為脫色前后多糖的質(zhì)量濃度。

1.2.4溫度對樹脂脫色效果的影響。

分別向圓底燒瓶中加入預(yù)處理的D151、D152、D4006和pH為5.5的ALP粗品溶液，在35、45、55、65、75 ℃水浴恒溫振蕩2 h，過濾，測定濾液的脫色率、糖保留率。

1.2.5pH對樹脂脫色效果的影響。

分別向圓底燒瓶中加入預(yù)處理的D151、D152、D4006和pH分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0的ALP粗品溶液，55 ℃水浴恒溫振蕩2 h，過濾，測定濾液的脫色率、糖保留率。

1.2.6正交設(shè)計優(yōu)選脫色的工藝條件。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9 （34）正交試驗，通過正交試驗確定最佳脫色條件。

2結(jié)果與分析

2.1樹脂的初篩選

從表1可以看出，D151、D152、D280、D201GF、D4006的脫色率均達(dá)到50%以上；D151、D152、D4006糖保留率較高，其余樹脂在脫色的同時多糖的損失很大。據(jù)此選出D151、D152、D4006這3種樹脂做進一步研究。

2.2不同溫度對脫色效果的影響

從表2可以看出，D151和D152脫色率在35～55 ℃隨溫度升高而增加，溫度高于55 ℃后脫色率下降；D4006的脫色率在35～65 ℃隨溫度升高而增加，溫度高于65 ℃脫色率下降。綜合考慮，正交試驗溫度定為45、55、65 ℃。

2.3pH對樹脂脫色效果的影響

從表3可以看出，D151在pH 3.0～4.5脫色率隨pH的增加而增加，pH大于4.5后脫色率下降；D152在pH 3.0～6.0脫色率隨pH的增加而增加，pH大于7.5后脫色率下降；D4006隨著 pH的增加脫色率下降。綜合考慮，將正交試驗的pH定為3.5、5.0、6.5。

2.4正交試驗

通過單因素試驗，得出正交試驗因素水平表（表4）。正交試驗結(jié)果見表5。極差分析表明，各因素對樹脂脫色率的影響程度從大到小依次為A、C、B，即樹脂種類對脫色率的影響最大，pH次之，溫度的影響最??；方差分析表明，樹脂種類、pH對脫色率的影響均達(dá)到顯著水平，溫度對脫色率的影響不顯著。

2.5驗證試驗

以脫色率作為考察指標(biāo)，理論上最佳組合是A2B2C2，而正交試驗的最佳組合是A2B1C2，故需進行驗證試驗。驗證試驗結(jié)果表明，A2B2C2和A2B1C2的脫色率分別為88.1、88.6%，2種組合的脫色率和糖保留率基本接近。考慮到A2B1C2組合能耗更低，故選擇A2B1C2。并且要求樹脂在脫色素的同時應(yīng)盡可能多地保留糖，A2B1C2具有較高的糖保留率，符合要求。

3小結(jié)與討論

亮菌多糖粗品是亮菌發(fā)酵菌粉經(jīng)水提醇沉得到的棕色粉末，其中色素的種類、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)目前鮮見報道。從樹脂初篩的試驗結(jié)果來看，屬于陽離子交換樹脂的D151、D152和陰離子交換樹脂D280均有較好的脫色效果，推測亮菌多糖粗品中的色素既有陽離子型也有陰離子型，成分比較復(fù)雜。離子交換樹脂在發(fā)揮作用時，除了離子交換過程外，還存在吸附作用，而D280樹脂作用后，溶液中的多糖幾乎檢測不到，此現(xiàn)象有深入研究的必要。從正交試驗結(jié)果來看，樹脂種類對脫色率的影響最大，pH次之，二者對脫色率的影響都達(dá)到顯著水平，而溫度對脫色率的影響則較小。究其原因，可能與色素分子的分子結(jié)構(gòu)、帶電情況、基團極性、是否容易與吸附樹脂的表面基團形成氫鍵等因素有關(guān)，尚需要繼續(xù)研究。多糖的進一步分離純化往往采用離子交換色譜法，色素的殘留會對離子交換樹脂產(chǎn)生毒害。經(jīng)過D152作用后色素的脫除率達(dá)到85%，而此條件下多糖的保留率近90%，所以正交試驗確定的工藝條件對進一步分離得到高純度、高產(chǎn)率的亮菌多糖非常有益。

參考文獻(xiàn)

[1] 江蘇省“亮菌”科研協(xié)作組化學(xué)小組.假密環(huán)菌的研究Ⅱ.假蜜環(huán)菌素的分離及化學(xué)結(jié)構(gòu)的測定[J].微生物學(xué)報，1974，14（1）：9-16.

[2] 黃純，宋慧智，馬馳，等.亮菌多糖提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（19）：5027-5028.

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（21）：135-137，145