PD—1抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用

黃樂(lè)

【摘 要】 目的：分析PD-1抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值。方法：從2014年2月～2015年9月，醫(yī)院住院的15名肺癌患者中、15名體檢健康的志愿者，采血獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞，進(jìn)行腫瘤組織離體培養(yǎng)，以CIK為效應(yīng)細(xì)胞，以A549、H1299、原代細(xì)胞為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照10：1比例混合，采用GytoTox-Glo細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行活化淋巴細(xì)胞殺傷作用檢測(cè)，以自身PBMC作為陰性對(duì)照組，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組加入效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)另設(shè)三組分別加入10、50、100ngPD -1抗體（低劑量組、中劑量組、高劑量組）。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組、小劑量組、中劑量組、高劑量組腫瘤細(xì)胞殺傷率指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組高于中劑量組，中劑量組高于小劑量組，小劑量組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PD-1抗體可增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用。

【關(guān)鍵詞】 惡性腫瘤 靶向治療 PD-1抗體

靶向治療是惡性腫瘤治療的新療法，也是當(dāng)前最有潛力的腫瘤療法。PD-1抗體是PD-LI一個(gè)抑制性受體，PD-1分子尾部含有2個(gè)酪氨酸殘基，他們與下游信號(hào)傳導(dǎo)分子相互作用，可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，PD-1表達(dá)與活化的T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的單核以及樹(shù)突狀細(xì)胞[1]。本次研究采用體外試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)PD-1抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

從2014年2月～2015年9月，醫(yī)院住院的15名肺癌患者中，抽取血液10ml，其中男6例、女4例，平均年齡（58.1±5.2）歲。另選擇體檢健康的志愿者15名，其中男6例、女4例，平均年齡（58.3±5.2）歲，采血10ml。從人淋巴新=細(xì)胞中，采用梯度離心法，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），含有10%FCS和200U/ml IL-2的PRMI-1640培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

儀器主要包括牛血清單板、PD-1單抗、流式細(xì)胞儀、自動(dòng)酶標(biāo)儀、各類(lèi)培養(yǎng)基，BX-60熒光顯微鏡等。

1.3 方法

首先：體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞，取靜脈血EDTA抗凝，分離淋巴細(xì)胞分離液，獲得的細(xì)胞，于4ml1640完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)備用，而后進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)。健康的人PBMC采用1-2×106/mln濃度懸浮無(wú)血清培養(yǎng)液，加入重組人IFN-g，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h加入CD3單克隆抗體50ng/ml，重組人IL-2 300U/ml，刺激CIK細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，加入重組人IL-1a 100U/ml，換液培養(yǎng)擴(kuò)瓶，并補(bǔ)充IL-1a，第14日收獲CIK細(xì)胞，染色。其次，進(jìn)行腫瘤組織離體培養(yǎng)，保存離體組織，快處理，消化，培養(yǎng)，過(guò)濾，離心濾液，進(jìn)行培養(yǎng)，換液傳代。最后進(jìn)行腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)：以CIK為效應(yīng)細(xì)胞，以A549、H1299、原代細(xì)胞為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照10：1比例加入到96孔U型板中，采用GytoTox-Glo細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行活化淋巴細(xì)胞殺傷作用檢測(cè)，以AAF-GloTM為底物，發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞毒效應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量成正比，計(jì)算總細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度減去死細(xì)胞發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞活力，計(jì)算活化淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷率。以自身PBMC作為陰性對(duì)照組，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組加入效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)另設(shè)三組分別加入10、50、100ngPD -1抗體（低劑量組、中劑量組、高劑量組）。37℃，5%CO2孵育6h，每孔加入50μl熒光底物檢測(cè)，室溫下?lián)u床低速震蕩15min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔發(fā)光值。細(xì)胞殺傷率=[（目標(biāo)組發(fā)光值-淋巴對(duì)照組組發(fā)光值-靶細(xì)胞對(duì)照組發(fā)光值+培養(yǎng)基發(fā)光值）/（靶細(xì)胞總發(fā)光值-靶細(xì)胞對(duì)照組發(fā)光值）]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，殺傷率指標(biāo)采用（Mena±SD）符號(hào)（x±s）表示，服從正態(tài)分布組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較F檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、小劑量組、中劑量組、高劑量組腫瘤細(xì)胞殺傷率指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組高于中劑量組，中劑量組高于小劑量組，小劑量組高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

從本次研究結(jié)果來(lái)看，體外試驗(yàn)證實(shí)：PD-1抗體可增強(qiáng)CIK效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用，提高腫瘤細(xì)胞殺傷率，且表現(xiàn)出劑量依賴。目前抗PD-1藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，一項(xiàng)針對(duì)進(jìn)展期難治性NSCLC的meta分析顯示，抗PD-L1藥物可起到增效作用，提高患者的中位總生存期[HR=0.61，95%CI0.61～0.75，P<0.05），和總緩解率[HR=0.56，95%CI0.43～0.73，P<0.05）[2]。另一項(xiàng)針對(duì)PD-1/PD-L1抗體與多西他賽治療晚期非小細(xì)胞肺癌的meta分析顯示，看題組不良反應(yīng)發(fā)生率較低，總的不良反應(yīng)發(fā)生率顯著下降，但免疫相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率上升[3]。PD-1抗體通過(guò)發(fā)揮增效作用，延長(zhǎng)惡性腫瘤患者生存期，也可能存在不良反應(yīng)，影響免疫功能[4]。

參考文獻(xiàn)

[1]曹佳彬，魏敬雙.PD-1 抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2014，27（6）：856-860.

[2]王心怡，李晨露.抗PD-L1藥物治療進(jìn)展期難治型NSCLC有效性與安全性Meta分析[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，52（6）：659-664.

[3]蘇強(qiáng)，閆涵，侯艷麗，等.PD-1/PD-L1抗體與多西他賽治療晚期非小細(xì)胞肺癌安全性meta分析[J].中華腫瘤防治雜志，2016，23（21）：1450-1452.