香格里拉本土葡萄酒酵母的篩選及其脅迫耐受性分析

秦偉帥，時(shí)磊，黨明明，何霞紅，朱書(shū)生，趙新節(jié)*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；3. 山東省蓬萊萬(wàn)德福酒業(yè)有限公司，山東煙臺(tái) 265600)

香格里拉本土葡萄酒酵母的篩選及其脅迫耐受性分析

秦偉帥1,2，時(shí)磊3，黨明明3，何霞紅1，朱書(shū)生1，趙新節(jié)2*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；3. 山東省蓬萊萬(wàn)德福酒業(yè)有限公司，山東煙臺(tái) 265600)

本文對(duì)香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)及土壤中分離獲得76株酵母菌株進(jìn)行序列測(cè)定和生理特征分析。結(jié)果表明，這些菌株在親緣關(guān)系上可歸類(lèi)于9個(gè)屬10個(gè)種，其中優(yōu)勢(shì)菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），占52.6%，其次是巴布維紅酵母（Rhodosporidium babjevae）和葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae），分別占22.4%和7.9%。利用改良模擬葡萄汁培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行脅迫耐受性分析發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌株CZ11和BZL12具有較高的酒精度、高糖和低溫耐受性，具有冰酒發(fā)酵應(yīng)用潛力。

香格里拉；本土酵母；篩選；脅迫耐受性；分析

香格里拉位于中國(guó)青藏高原南部，海拔3300～3500 m，是中國(guó)新興的葡萄酒產(chǎn)區(qū)。該地區(qū)氣候寒冷干燥，紫外線輻射強(qiáng)，年平均降雨量在800～1000 mm之間，真菌病害少，是適宜種植優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的高海拔產(chǎn)區(qū)。高原冰葡萄酒的發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物代謝過(guò)程，酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。酵母性能的好壞關(guān)系到冰酒發(fā)酵是否能夠順利的進(jìn)行[1]。

目前，國(guó)內(nèi)冰酒生產(chǎn)大都選用進(jìn)口商業(yè)活性干酵母，但是冰酒發(fā)酵的高糖和低溫等因素引起的酵母起酵速度慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題仍然沒(méi)有得到有效解決，大大增加了葡萄酒的生產(chǎn)成本和感染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。由于香格里拉葡萄適栽區(qū)的生態(tài)地理環(huán)境多種多樣，蘊(yùn)藏著豐富的葡萄釀酒酵母資源，本土酵母已經(jīng)適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、土壤和葡萄品種，能較快的在葡萄酒發(fā)酵中占主導(dǎo)地位[1,3]。因此，在產(chǎn)區(qū)環(huán)境范圍內(nèi)，篩選優(yōu)良耐受性的酵母菌株，并利用合理的葡萄酒發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)酵母釀造性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)該產(chǎn)區(qū)高品質(zhì)、特色冰酒的生產(chǎn)具有重要意義。

本研究從香格里拉產(chǎn)區(qū)土壤和釀酒葡萄品種中分離出本土葡萄酒酵母，采用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列測(cè)定和5.8S-ITS區(qū)序列分析、生理特征分析方法對(duì)得到的酵母菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并采用改良的模擬葡萄汁對(duì)分離菌株進(jìn)行脅迫耐受性分析，為該產(chǎn)區(qū)適宜冰酒發(fā)酵的酵母菌資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

本研究共采集8個(gè)地區(qū)40份新鮮的土壤樣品和55份葡萄果實(shí)，詳見(jiàn)表1。葡萄品種包括赤霞珠、玫瑰蜜和霞多麗。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）豆芽汁蔗糖富集培養(yǎng)基[4-5]：黃豆芽200 g、蔗糖30 g、水1000 mL。

（2）孟加拉紅-鏈霉素分離培養(yǎng)基[5-6]：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅33.4 mg、蒸餾水100 mL、鏈霉素溶液30 μg/mL。

（3）YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、水1000 mL。

（4）改良模擬葡萄汁培養(yǎng)基[3,7-8]：葡萄糖10 g/L，果糖10 g/L，酒石酸3 g/L，檸檬酸0.3 g/L，L-蘋(píng)果酸0.3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L。其它成分包括氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素和脂肪酸，pH值調(diào)整為5.8。所有固體培養(yǎng)基加入20 g/L瓊脂。培養(yǎng)基滅菌條件為115 ℃，30 min。

表1 樣品來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 酵母菌株的分離與保藏

土壤中酵母菌株分離[5]：稱(chēng)取土樣1.0 g，加到100 mL滅菌富集培養(yǎng)基中，33 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)30 h。梯度稀釋后涂布于分離選擇培養(yǎng)基上，33 ℃靜置培養(yǎng)2～3 d后挑取形態(tài)不同的單菌落，鏡檢。形態(tài)初步確定為酵母后，多次劃線純化，獲得純培養(yǎng)物。42 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，挑取生長(zhǎng)良好的菌株純化后轉(zhuǎn)管低溫保存。

葡萄中酵母菌株的分離[3]：葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中取樣，將樣品梯度稀釋后涂布于YPD平板以分離酵母，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，結(jié)合鏡檢和菌落的形態(tài)觀察，從平板上挑取分離良好、具有典型性的單菌落，經(jīng)進(jìn)一步純化后轉(zhuǎn)管低溫保存。

1.2.2 酵母的菌種鑒定

將分離純化的酵母菌種梯度稀釋后涂布于YPD平板，25 ℃培養(yǎng)5～7 d。將酵母菌種送中科院微生物研究所進(jìn)行酵母26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列分析，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件人工校對(duì)。用Mega 5.0軟件鄰接法，進(jìn)行1000 次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 酵母脅迫耐受性試驗(yàn)

冰葡萄酒釀造過(guò)程中，葡萄醪含糖量高、發(fā)酵溫度低等因素影響酵母的生長(zhǎng)和代謝，因此要求酵母具有耐低溫、耐高糖、耐酒精等抗逆性能[9]，它是冰酒酵母菌種選育的重要指標(biāo)。

（1）低溫耐受性能試驗(yàn)

活化菌種轉(zhuǎn)接于改良模擬葡萄汁中，接種量為1%。10 ℃和15 ℃靜置培養(yǎng)，于7 d后觀察杜氏管中產(chǎn)氣量，記錄酵母菌的低溫耐受性。

（2）酒精耐受性能試驗(yàn)

活化菌種轉(zhuǎn)接于酒精濃度調(diào)整為16%和18%的改良模擬葡萄汁中，接種量為1%，28℃靜置培養(yǎng)，7 d后觀察杜氏管中產(chǎn)氣量，記錄酵母菌的不同酒精度下耐受性。

（3）高糖耐受性能試驗(yàn)

將模擬葡萄汁培養(yǎng)基含糖量調(diào)整為500 g/L、600 g/L兩個(gè)濃度，取10 mL分裝于試管，放入倒置的杜氏發(fā)酵管（確保充滿液體培養(yǎng)基且無(wú)氣泡），接種量為1%，28 ℃靜置培養(yǎng)，7 d后觀察杜氏管中產(chǎn)氣量，記錄酵母菌的不同糖濃度耐受性。

以上所有試驗(yàn)，各處理重復(fù)次數(shù)均為3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法。差異顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定及種群分布

本研究共分離獲得酵母菌76株，經(jīng)過(guò)26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)76株酵母分屬于9個(gè)屬10個(gè)種，其中，大隱球酵母（Cryptococcus magnus）1株（占總分離株的1.3% ）、巴布維紅酵母（Rhodosporidium babjevae）17株（占22.4%）、皮杰普氏畢赤酵母（Pichia pijperi）1株（占1.3%）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）40株（占52.6%）、鐵杉假絲酵母（Candida railenensis）3株（占3.9%）、科特維樂(lè)紅酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）1 株（占1.3%）、德巴利酵母（Debaryomyces prosopidis）5株（占6.6%）、葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）6株（占7.9%）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）1株（占1.3%）和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）1株（占1.3%），優(yōu)勢(shì)菌株為釀酒酵母和巴布維紅酵母，其次是德巴利酵母和葡萄酒有孢漢生酵母。茨中和奔子欄篩選和鑒定的菌株總數(shù)最多。從分離結(jié)果看，釀酒酵母的地域分布最廣（表2），茨中、尼通、布村、奔子欄和達(dá)日5個(gè)地區(qū)的樣品中均能篩選到。試驗(yàn)從土壤中共分離到酵母16株，葡萄果實(shí)中共分離到酵母59株。

2.2 酵母菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

酵母26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析[10]，與已知種的相似性為99%以上并有形態(tài)特征的支持時(shí)，就可以做出種的鑒定，與最近緣的已知種的相似性在98%～99%之間時(shí)，就需要結(jié)合5.8S-ITS序列分析和生理生化特征比較，對(duì)其作出分類(lèi)學(xué)鑒定。如果在98%或者以下時(shí)，則可初步確定為新種。圖1為76株酵母系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 酵母脅迫耐受性分析

表2 酵母菌的地理分布 （單位：株）

2.3.1 酵母菌株的低溫耐受性分析

本研究所篩選到的40株釀酒酵母中，有11株能在10 ℃條件下產(chǎn)氣；而在6株葡萄酒有孢漢生酵母中，有1株能在10 ℃條件下產(chǎn)氣；1株美極梅奇酵母能在10 ℃條件下產(chǎn)氣。所有的大隱球酵母、巴布維紅酵母、皮杰普氏畢赤酵母、鐵杉假絲酵母、德巴利酵母、科特維樂(lè)紅酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母在10 ℃條件下均不能產(chǎn)氣。上述結(jié)果表明，不同屬酵母菌的耐低溫能力不相同，同種酵母不同菌株之間的耐低溫能力也存在明顯差異，其中耐低溫能力較好的是釀酒酵母菌株。不同溫度條件下產(chǎn)氣菌株見(jiàn)表3。

圖1 根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

表3 酵母菌耐低溫能力檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 酵母菌株的酒精耐受性分析

本研究所篩選到的40株釀酒酵母中，有19株能在16%酒精濃度條件下產(chǎn)氣；有2株釀酒酵母能在18%酒精濃度條件下產(chǎn)氣（表4）。所有的大隱球酵母、巴布維紅酵母、皮杰普氏畢赤酵母、鐵杉假絲酵母、德巴利酵母、科特維樂(lè)紅酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、葡萄酒有孢漢生酵母、美極梅奇酵母在16%酒精濃度條件下均不能產(chǎn)氣。上述結(jié)果表明，釀酒酵母具有較好的酒精耐受性，同種酵母不同菌株之間的耐酒精能力也存在明顯差異。

2.3.3 酵母菌株的高糖耐受性分析

本研究所篩選得到的40株釀酒酵母中，有20株能在500 g/L糖濃度條件下產(chǎn)氣；有5株葡萄酒有孢漢生酵母能在500 g/L糖濃度條件下產(chǎn)氣；有1株戴爾凱氏有孢圓酵母能在500 g/L糖濃度條件下產(chǎn)氣。有3株釀酒酵母、1株葡萄酒有孢漢生酵母、1株戴爾凱氏有孢圓酵母能在600 g/L糖濃度條件下產(chǎn)氣。所有的大隱球酵母、巴布維紅酵母、皮杰普氏畢赤酵母、鐵杉假絲酵母、德巴利酵母、科特維樂(lè)紅酵母、美極梅奇酵母在500 g/L糖濃度條件下均不能產(chǎn)氣。上述結(jié)果表明，不同酵母具有不同的高糖耐受性，同種酵母不同菌株之間的耐高糖能力也存在明顯差異。不同糖濃度條件下產(chǎn)氣菌株見(jiàn)表5。

3 討論和結(jié)論

葡萄酒的品質(zhì)很大程度上取決于酵母菌種的釀酒特性，充分利用各類(lèi)酵母的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，有效控制敗壞性酵母，會(huì)使葡萄酒的香氣和口感更加復(fù)雜[1]。在冰酒釀造過(guò)程中，耐受性強(qiáng)的酵母菌種可以迅速起酵，縮短發(fā)酵周期。因此，本試驗(yàn)對(duì)云南香格里拉產(chǎn)區(qū)40份新鮮的土壤樣品和55份葡萄果實(shí)的酵母菌進(jìn)行了分離鑒定并對(duì)其脅迫耐受性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，茨中和奔子欄篩選和鑒定的菌株總數(shù)最多，酵母資源豐富。本土酵母菌的物種具有一定的多樣性，而且在分布地域上存在一定的差異。其中優(yōu)勢(shì)菌株為釀酒酵母，地域分布最廣，茨中、尼通、布村、奔子欄和達(dá)日5個(gè)地區(qū)的樣品中均能篩選到。其次是巴布維紅酵母和葡萄酒有孢漢生酵母。其中釀酒酵母和葡萄酒有孢漢生酵母主要在葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中篩選得到。Paraggio 研究發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生大量的酯類(lèi)和甘油，能夠增加葡萄酒口感的圓潤(rùn)度[11]。Wang 等人通過(guò)接種釀酒酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母進(jìn)行葡萄酒混菌發(fā)酵，可以加快葡萄酒酒精發(fā)酵進(jìn)程，改變釀酒酵母的脅迫耐受性[12]。然而在本試驗(yàn)在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中并未篩選到葡萄汁有孢漢遜酵母。

本研究通過(guò)改良的模擬葡萄汁對(duì)篩選得到的76株酵母進(jìn)行脅迫耐受性分析發(fā)現(xiàn)，不同種屬的酵母菌以及同種酵母菌不同菌株之間在耐脅迫能力方面具有明顯差異。其中，能夠耐受18%酒精度的菌株為釀酒酵母BZL8和BZL10。能夠耐受600 g/L葡萄糖的菌株為釀酒酵母CZ3、BZL7和BZL10，葡萄酒有孢漢生酵母CZ20，戴爾凱氏有孢圓酵母CZ23。能夠耐受16%酒精度、500 g/L葡萄糖和低溫10 ℃的菌株為釀酒酵母CZ11和BZL12，具有高耐受性冰酒酵母開(kāi)發(fā)潛力。相關(guān)研究證實(shí)葡萄酒有孢漢生酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母在葡萄酒釀造過(guò)程中可以增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，并且和釀酒酵母連續(xù)接種發(fā)酵，可以控制釀酒酵母的乙醇生成量[13-15]。這為下一步香格里拉產(chǎn)區(qū)葡萄酒特征香氣的形成機(jī)制研究及優(yōu)良菌種選育奠定了基礎(chǔ)。

表4 釀酒酵母菌耐酒精能力檢測(cè)結(jié)果

表5 酵母菌耐高糖能力檢測(cè)結(jié)果

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Screening and stress tolerance analysis of native wine yeasts in Shangri-La

QIN Weishuai1,2, SHI Lei3, DANG Mingming3, HE Xiahong1, ZHU Shusheng1, ZHAO Xinjie2*
（1.Key Laboratory of Agrobiodiversity and Pest Management, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2.Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353，China; 3.Shandong Penglai Wandefu Wine Company Limited, Yantai 265600，China）

In this study, 76 wine yeast strains were isolated from different soil samples and grape fruits in Shangri-La. Based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and physiological characterization, these strains were phylogenetically related to 10 species in 9 genera, Saccharomyces cerevisiae was the dominant strains with 40 strains accounted for 52.6%, followed by 22.4% of Rhodosporidium babjevae, and 7.9% of Hanseniaspora vineae. We analyzed the stress tolerance of the strains using the modifi ed grape juice culture medium and found that strains CZ11 and BZL12 had higher alcohol content, higher sugar content, and lower temperature tolerance.

Shangri-La; native yeast; screening; stress tolerance; analysis

S663.1；TS261.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.006

2017-03-29

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-06-14）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)基金（SDAIT-03-021-12）

秦偉帥，博士，研究方向?yàn)榻湍妇N選育及代謝調(diào)控。E-mail: sdjnqws@163.com

*通訊作者：趙新節(jié)，博士，教授，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒。E-mail: zhaoxinjie1177@163.com