4種防凍劑對(duì)夏黑葡萄嫩芽和巨峰葡萄幼葉抗凍能力的影響

婁玉穗，壽靈超，高靜霞，張才喜，陳光正，王世平*

（1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，鄭州 450002；3. 臺(tái)灣久安公司，臺(tái)灣南投 55242）

4種防凍劑對(duì)夏黑葡萄嫩芽和巨峰葡萄幼葉抗凍能力的影響

婁玉穗1,2，壽靈超1，高靜霞1，張才喜1，陳光正3，王世平1*

（1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，鄭州 450002；3. 臺(tái)灣久安公司，臺(tái)灣南投 55242）

為了探討4種防凍劑對(duì)提高葡萄嫩芽和幼葉抗凍能力的效果，以夏黑葡萄扦插幼苗和巨峰葡萄幼葉為試驗(yàn)材料，分別浸漬一定濃度的苞果303、苞果良、氨基丁酸（FP）和水楊酸，然后進(jìn)行低溫處理，以觀察和測(cè)定嫩芽和幼葉的受凍害情況。結(jié)果表明，500倍苞果303和200 mg/L FP藥液在穩(wěn)定細(xì)胞膜透性、降低膜脂過氧化、提高保護(hù)酶活性等方面具有較顯著的效果，嫩芽和幼葉的霜凍危害顯著減輕。因此，苞果303和FP具有提高葡萄嫩芽和幼葉的抗霜凍能力，有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

葡萄；防凍劑；抗凍能力；凍害指標(biāo)

葡萄低溫凍害在全世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，是威脅生產(chǎn)的重大因子[1-3]。低溫凍害按照發(fā)生時(shí)間可分為早霜凍和晚霜凍兩種，早霜凍發(fā)生在晚秋早霜來(lái)臨時(shí)，主要危害枝條和根系；晚霜凍發(fā)生在葡萄萌芽生長(zhǎng)期，主要危害葡萄嫩芽和幼葉。近年來(lái)晚霜凍現(xiàn)象比較嚴(yán)重[2-4]，尤其是隨著促早栽培和一年多熟栽培等模式的出現(xiàn)，早春凍害已經(jīng)成為種植者最擔(dān)憂的問題之一。陳曉楠指出，葡萄絨球、嫩梢和幼葉、花序分別在環(huán)境溫度低于-3 ℃、-1 ℃和0 ℃時(shí)即會(huì)發(fā)生凍害[5]，這說明葡萄萌芽后，其抗凍性越來(lái)越低，而此時(shí)期也是發(fā)生倒春寒的關(guān)鍵時(shí)期。因此，研究提高葡萄防寒抗凍能力的方法具有重要的生產(chǎn)意義。

生產(chǎn)上通常采取的防凍措施包括覆蓋、熏煙、噴淋和噴施防凍劑等[4-6]，前3種方法屬于物理防凍法，需要消耗大量的勞動(dòng)力和資源，植物防凍劑因其操作使用簡(jiǎn)單、效果好而廣受歡迎[8]。關(guān)于各種防凍劑的應(yīng)用和專利產(chǎn)品也成為研究熱點(diǎn)[7-9]。目前，在生產(chǎn)上或研究中用于植物防凍的藥劑有氯化鈣、硫酸鉀、水楊酸、乙烯利、萘乙酸、脫落酸、矮壯素、多效唑等[7-10]。氨基丁酸（FP）在預(yù)防甜櫻桃花果晚霜凍方面效果顯著，并獲得美國(guó)專利（專利號(hào)：USSP2011/0281730A）。臺(tái)灣久安公司開發(fā)的肥料產(chǎn)品苞果良和苞果303，在2008年春季福建的葡萄晚霜凍期間表現(xiàn)出了良好的抗低溫能力。因此，為了明確不同防凍劑在提高葡萄防寒抗凍能力的提升效果，本研究通過浸漬的方法使葡萄嫩芽和幼葉吸收藥劑，冷凍處理后，觀察和測(cè)定多個(gè)評(píng)價(jià)抗凍能力的指標(biāo)，以期篩選出對(duì)提高葡萄嫩芽和幼葉防凍效果最顯著的藥劑，為葡萄凍害的防治提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2013年1～4月在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院進(jìn)行，將夏黑葡萄一年生枝條剪成留2個(gè)芽的插穗，頂端離芽約1 cm處平剪，下端在芽眼處斜剪，插入濕沙后置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)催芽。培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境設(shè)置為：溫度25 ℃，相對(duì)濕度90%，12 h光照/12 h黑暗。待芽即將萌發(fā)時(shí)移入玻璃溫室中培養(yǎng)。幼葉的抗凍性試驗(yàn)選用生長(zhǎng)在玻璃溫室中的20株5年生地栽巨峰葡萄植株作為試驗(yàn)材料，栽培基質(zhì)為園土:有機(jī)肥（8:1，v/v），肥水管理參考王世平等[11]的方法，2013年巨峰葡萄植株于3月中旬萌芽。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 葡萄嫩芽的抗凍性觀測(cè)

（1）嫩芽的抗凍性預(yù)備試驗(yàn)

圖1 控溫冰箱內(nèi)的設(shè)定溫度與實(shí)際溫度變化過程

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的夏黑葡萄扦插幼苗20個(gè)（最大葉片寬度2 cm左右），隨機(jī)分成2組，每組10個(gè)幼苗，第一組溫度設(shè)定為1 ℃、-1 ℃、-3 ℃、-5 ℃、-3 ℃、-1 ℃、1 ℃，置于程序控制冰箱中，為了更準(zhǔn)確地測(cè)定控溫冰箱內(nèi)的溫度變化，同時(shí)在放置扦插幼苗的隔板上放置溫度測(cè)定儀（U23-001，美國(guó)Onset公司），溫度變化如圖1所示；第二組溫度設(shè)定為0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-2 ℃、0 ℃，每個(gè)溫度段保持1 h，之后取出幼苗在室溫下放置3 h后觀察嫩芽是否發(fā)生凍害以及受凍害的程度。

（2）嫩芽的抗凍性觀測(cè)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的夏黑葡萄扦插幼苗70個(gè)，10個(gè)幼苗作為對(duì)照，其余幼苗置于程序控溫冰箱中冷凍處理，溫度設(shè)定為-3.5 ℃、-4 ℃、-4.5 ℃、-5 ℃、-5.5 ℃、-6 ℃，每個(gè)溫度段保持1 h，每隔1 h從冰箱中隨機(jī)取出10個(gè)幼苗在室溫下放置3 h后觀察嫩芽的受凍害情況。

1.2.2 防凍劑處理對(duì)葡萄嫩芽抗凍性的影響

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的夏黑葡萄扦插幼苗（最大葉片寬度在2 cm左右）250個(gè)，隨機(jī)分成5組，每組50個(gè)，分別用500倍苞果303、500倍苞果良、200 mg/L水楊酸和200 mg/L FP浸泡48 h，以去離子水浸泡作為對(duì)照。之后置于控溫冰箱中，設(shè)定溫度梯度為-0.5 ℃、-2.5 ℃、-4.5 ℃、 -2.5 ℃、-0.5 ℃，每個(gè)溫度段保持1 h，程序結(jié)束后取出幼苗置于室溫下3 h后觀察嫩芽的受凍害情況。

1.2.3 防凍劑處理對(duì)葡萄幼葉凍害生理生化指標(biāo)的影響

從巨峰葡萄植株上剪取寬度為5 cm左右的幼葉作為試驗(yàn)材料，分別用500倍苞果303、500倍苞果良、200 mg/L水楊酸、200 mg/L FP和去離子水浸泡葉柄24 h，每個(gè)處理20片幼葉，取一半幼葉置于控溫冰箱中冷凍，設(shè)定溫度梯度為-0.5 ℃、-2.5 ℃、-4.5 ℃、-2.5 ℃、-0.5 ℃，每個(gè)溫度段保持1 h，程序降溫處理結(jié)束后取出幼葉，置于室溫下3 h后測(cè)定幼葉的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性。另一半幼葉直接用于測(cè)定相同指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 凍害指數(shù)

參考俞奔馳等[12]的凍害等級(jí)劃分方法對(duì)幼葉受凍害情況進(jìn)行評(píng)估。凍害情況共分5個(gè)等級(jí)，0級(jí)：無(wú)凍害；1級(jí)：輕微凍害，25%嫩葉受凍；2級(jí)：25%～50%幼葉受凍；3級(jí)：50%～75%幼葉受凍；4級(jí)：嚴(yán)重凍害，75%幼葉凍死。

凍害百分率/%=（發(fā)生凍害株數(shù)/總株數(shù)）×100。

凍害指數(shù)=[Σ（同一凍害等級(jí)的株數(shù)×該凍害等級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)凍害代表值）]×100。

1.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率

參考修德仁等[13]的方法。用直徑1 cm的打孔器在幼葉上取5個(gè)小圓片，用去離子水反復(fù)沖洗干凈，置于15 mL離心管中，加入10 mL去離子水，并使葉片完全浸入水中。振蕩10 min后，用電導(dǎo)率儀（FE30）測(cè)定電導(dǎo)率S1。再置于沸水浴中加熱40 min，冷卻至室溫后，用去離子水定容到加熱前的體積后測(cè)定電導(dǎo)率S2。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式：

相對(duì)電導(dǎo)率（%，傷害率）=（S1/S2）×100。

1.3.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[14]，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定[15]，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[16]，酶活力用“U/g”表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SAS8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 防凍劑處理對(duì)夏黑葡萄嫩芽抗凍性的影響

根據(jù)夏黑葡萄嫩芽抗凍性預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度降到-5 ℃時(shí)，夏黑嫩芽發(fā)生嚴(yán)重的凍害現(xiàn)象，而當(dāng)溫度降到-4 ℃時(shí)，嫩芽幾乎沒有發(fā)生凍害現(xiàn)象，因此初步確定夏黑嫩芽開始發(fā)生凍害的溫度范圍為-4～-5 ℃。之后的嫩芽抗凍性觀測(cè)試驗(yàn)表明，當(dāng)溫度低于-4.5 ℃時(shí)，嫩芽發(fā)生凍害的情況明顯加重，因此，確定夏黑嫩芽發(fā)生凍害的臨界溫度為-4.5 ℃。另外，500倍苞果303、500倍苞果良、200 mg/L水楊酸和200 mg/L FP處理的幼苗凍害百分率和凍害指數(shù)均低于對(duì)照，說明這4種防凍劑對(duì)提高葡萄嫩芽抗凍能力的效果較顯著（表1），其中，夏黑嫩芽發(fā)生凍害最輕的處理是200 mg/L FP，其凍害指數(shù)比對(duì)照減少72.0%；其次是500倍苞果303，比對(duì)照減少53.8%。

表1 不同防凍劑對(duì)夏黑葡萄嫩芽?jī)龊Πl(fā)生的影響

2.2 防凍劑處理對(duì)葡萄幼葉凍害生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 防凍劑處理對(duì)巨峰葡萄幼葉相對(duì)電導(dǎo)率的影響

與去離子水處理相比，4種防凍劑浸漬處理均降低了巨峰葡萄幼葉的相對(duì)電導(dǎo)率，但降低效果不顯著（圖2）。經(jīng)低溫冷凍后，葡萄葉片的相對(duì)電導(dǎo)率增加，其中，200 mg/L FP處理的增加量最少，僅為17.1%，對(duì)照增加54.7%。說明FP對(duì)于冷凍后穩(wěn)定幼葉質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的效果最顯著，其細(xì)胞膜透性最??；其次是500倍苞果303，比對(duì)照低40.9%?？傮w上，防凍劑處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率均低于對(duì)照，說明這4種防凍劑處理均提高了葡萄葉片的抗凍性，其中水楊酸的效果最差。

2.2.2 防凍劑處理對(duì)巨峰葡萄幼葉MDA含量的影響

與去離子水處理相比，防凍劑浸漬巨峰葡萄葉柄后，幼葉的MDA含量均比對(duì)照有所降低，其中500倍苞果303處理的降低幅度最大，比對(duì)照低57.2%，其次是500倍苞果良，比對(duì)照低54.3%（圖3）。經(jīng)低溫冷凍后，幼葉的MDA含量均增加，其中，對(duì)照的增加量最大，比冷凍前增加53.3%，說明對(duì)照幼葉受到的凍害最嚴(yán)重；防凍劑處理的幼葉MDA含量增加幅度不明顯，僅增加5.9%～17.4%。整體上，苞果303處理幼葉的MDA含量最低，為對(duì)照的32.4%，這說明苞果303處理的葡萄幼葉膜脂過氧化發(fā)生最少，受凍害程度最輕；其次是500倍苞果良處理，200 mg/L水楊酸的效果最差。

圖2 防凍劑處理對(duì)冷凍前后巨峰葡萄葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響“*”表示與冷凍后對(duì)照之間存在顯著性差異（P＜0.05），下同。

圖3 防凍劑處理對(duì)冷凍前后巨峰葡萄幼葉MDA含量的影響

圖4 防凍劑處理對(duì)冷凍前后巨峰葡萄幼葉SOD活性的影響

2.2.3 防凍劑處理對(duì)巨峰葡萄幼葉SOD活性的影響

防凍劑浸漬葡萄葉柄后，幼葉SOD活性增加，其中500倍苞果303處理的SOD活性最強(qiáng)，比對(duì)照增加43.4%；其次是200 mg/L FP，比對(duì)照增加37.6%（圖4）。冷凍處理后，幼葉SOD活性增加，其中FP浸漬處理的葡萄幼葉的SOD活性最強(qiáng)，達(dá)到127.4 U/g，比對(duì)照高36.6%；苞果303的效果次之，說明這兩種藥劑在清除幼葉組織和細(xì)胞內(nèi)的超氧陽(yáng)離子自由基的能力最強(qiáng)，從而減緩氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，提高幼葉的抗凍性。

2.2.4 防凍劑處理對(duì)巨峰葡萄幼葉POD活性的影響

與葡萄葉片SOD活性變化規(guī)律相似，防凍劑浸漬后，幼葉POD活性均比對(duì)照增強(qiáng)，其中500倍苞果303處理的幼葉POD活性最強(qiáng)，比對(duì)照增加206.1%。冷凍處理后，幼葉POD活性增加，其中，200 mg/L FP處理葡萄幼葉的POD活性最強(qiáng)，比冷凍前增加167.5%，比對(duì)照增加121.1%（圖5），這說明FP對(duì)于冷凍后提高葡萄幼葉降解H2O2能力的效果最顯著，從而解除細(xì)胞內(nèi)的有害自由基，增強(qiáng)幼葉的抗凍性。

圖5 防凍劑處理對(duì)冷凍前后巨峰葡萄幼葉POD活性的影響

3 討論與結(jié)論

葡萄發(fā)生凍害后，從表面上看葉片呈水漬狀萎蔫，而其生理生化指標(biāo)早已發(fā)生改變。本研究中防凍劑浸漬葡萄扦插幼苗后，嫩芽受凍害的百分率和凍害指數(shù)均降低（表1），說明我們所使用的4種防凍劑均提高了葡萄嫩芽的抗凍能力，其中效果最好的藥劑是200 mg/L FP和500倍苞果303。

植物抗寒性與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、生理活性及其保護(hù)酶活性有密切關(guān)系，因此鑒定植物抗寒性的方法有多種，常用的有電導(dǎo)率法、丙二醛、脯氨酸、還原糖、可溶性蛋白、氨基酸、淀粉、脂類物質(zhì)、膜保護(hù)酶SOD活性、POD活性測(cè)定法等[17-20]。這些指標(biāo)的高低和變化均能夠反映植物受凍害的程度或抗寒性的強(qiáng)弱。

生物膜是植物細(xì)胞及細(xì)胞器與環(huán)境的一個(gè)界面結(jié)構(gòu)，各種逆境對(duì)細(xì)胞的影響首先作用于生物膜，低溫傷害也是如此。植物的抗寒性強(qiáng)弱與細(xì)胞質(zhì)膜透性呈負(fù)相關(guān)，電導(dǎo)率是反應(yīng)質(zhì)膜透性的主要指標(biāo)，抗寒性強(qiáng)或受害輕的細(xì)胞滲透性和電導(dǎo)率小[19]。研究表明：山葡萄的電導(dǎo)率隨溫度的降低而升高，之后隨溫度的升高而降低[21]；總體上電導(dǎo)率隨溫度的降低呈“S”形曲線[19]。本研究中，葉柄浸泡藥液后，幼葉相對(duì)電導(dǎo)率降低，說明這4種防凍劑均降低了幼葉的細(xì)胞膜透性。低溫冷凍后，幼葉相對(duì)電導(dǎo)率升高，其中FP處理幼葉的相對(duì)電導(dǎo)率最小，說明FP對(duì)保護(hù)冷凍后幼葉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的效果最顯著，其次是苞果303。

MDA作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，既能夠抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性和降低抗氧化物的含量，又具有細(xì)胞毒性，破壞膜結(jié)構(gòu)。因此，其含量的高低是反映細(xì)胞受到傷害程度的重要指標(biāo)，植物抗寒能力強(qiáng)，該物質(zhì)含量低，反之則相反[22]。本研究中，藥液浸泡后，幼葉MDA含量降低，說明4種防凍劑均降低了細(xì)胞膜脂過氧化的發(fā)生。冷凍處理后，幼葉MDA含量增加，這與之前的研究結(jié)果相似[19,23]?？傮w上冷凍后防凍劑處理幼葉的MDA含量均顯著低于對(duì)照幼葉的MDA含量，說明防凍劑處理大大降低了幼葉膜脂過氧化的發(fā)生，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高了葡萄的抗凍性，其中苞果303的效果最顯著。

在逆境環(huán)境下，保護(hù)酶活性的增加可以抵御逆境產(chǎn)生的傷害。SOD和POD是植物體內(nèi)清除活性氧和自由基的保護(hù)酶，能夠減緩氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，對(duì)于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定具有重要作用。研究表明，抗寒性強(qiáng)的葡萄品種，這兩種酶的活性較高[24]。本研究中防凍劑處理后幼葉SOD活性和POD活性均增強(qiáng)，其中苞果303處理的效果最顯著，POD活性比對(duì)照增加206.1%。幼葉經(jīng)過冷凍后，這兩種酶活性再次增加，小麥上也有相似的研究結(jié)果[23]。其中FP處理幼葉的這兩種酶活性最強(qiáng)，SOD活性和POD活性分別比對(duì)照高36.6%和121.1%，說明FP對(duì)提高幼葉保護(hù)酶活性的效果最顯著，幼葉經(jīng)冷凍處理后的抗凍性最強(qiáng)，從而增強(qiáng)了幼葉抵御寒冷的傷害。

總之，雖然本研究的低溫環(huán)境和過程為實(shí)驗(yàn)室模擬，但是通過設(shè)置去離子水對(duì)照處理，在相同的冷凍條件下，防凍劑處理減輕了嫩芽的受凍害程度，穩(wěn)定了幼葉的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少了膜脂過氧化的發(fā)生和提高了幼葉抗氧化活性酶的活性，從而提高了葡萄的抗凍性，這對(duì)于葡萄生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

綜合各種防凍劑在提高葡萄嫩芽和幼葉的抗凍能力、質(zhì)膜穩(wěn)定性、抗氧化活性酶活性和減少膜脂過氧化發(fā)生等因素，我們認(rèn)為500倍苞果303和200 mg/L FP對(duì)提高葡萄嫩芽、幼葉的抗晚霜凍能力的效果比較顯著。

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Effect of four antifreezes on cold resistance of buds in Summer Black and young leaves in Kyoho grapevines

LOU Yusui1,2, SHOU Lingchao1, GAO Jingxia1, ZHANG Caixi1, CHEN Guangzheng3, WANG Shiping1*
(1. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240; 2. Horticulture Reseach Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 3. Jiu'an Company of Taiwan, Nantou, Taiwan 55242)

In order to know the effect of four antifreezes on cold resistance of grape buds and young leaves, cutting branches of Summer Black and young leaf petioles of Kyoho were soaked into certain concentrations of 'Bao guo 303', 'Bao guo liang', aminobutyric acid (FP) and salicylic acid. Then they were subjected to cold treatment and the cold injury status of buds and young leaves were surveyed and determined. Results showed that 500 times 'Bao guo 303' and 200 mg/L FP had a better effect on stabilizing cytomembrane permeability, reducing membrane lipid peroxidation and cold injury occurrence, and increasing protective enzyme activity. Therefore, 'Bao guo 303' and FP can improve cold resistance of grape buds and young leaves and are worth to be popularized.

grapevine; antifreeze; cold resistance; cold injury index

S663.1；Q945.79

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.001

2017-03-16

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-30-zp-07）；上海市果業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（滬農(nóng)科產(chǎn)字（2014）第7號(hào)和滬農(nóng)科產(chǎn)字（2015）第7號(hào)）

婁玉穗，博士研究生，主要從事葡萄栽培生理研究。E-mail: yusui86@126.com

*通訊作者：王世平，E-mail: fruit@sjtu.edu.cn