miR-221在H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究

符麗珍，黃茂芹，勞之勇，肖孟生，朱德康

(1.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院內(nèi)科，?？?570203；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570203)

miR-221在H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究

符麗珍1，黃茂芹2，勞之勇1，肖孟生1，朱德康1

(1.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院內(nèi)科，?？?570203；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院心血管內(nèi)科，海口 570203)

目的 探討miR-221在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)損傷中的作用及機(jī)制研究。方法 MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞的損傷作用，RT-PCR法檢測(cè)miR-221表達(dá)量。通過Lipofectamine 2000將miR-221 inhibitor及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入H9c2心肌細(xì)胞，并將實(shí)驗(yàn)分為4組，正常對(duì)照組，模型對(duì)照組(H2O2組)，陰性對(duì)照組(H2O2+陰性對(duì)照組)，抑制組(H2O2+miR-221 inhibitor組)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)Bax，Bcl-2，10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白(PTEN)及p-蛋白激酶(AKT)表達(dá)。結(jié)果 0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞活力的抑制作用逐漸加強(qiáng)，其中200 μmol/L H2O2對(duì)細(xì)胞活力抑制程度適中，因此作為后續(xù)誘導(dǎo)劑量。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組中miR-221表達(dá)量顯著上調(diào)(P< 0.01)，H9c2細(xì)胞活力降低(P< 0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著提高(P< 0.01)，Bax及PTEN表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)，Bcl-2及p-AKT表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)。與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組中miR-221表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01)，H9c2細(xì)胞活力提高(P< 0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P< 0.01)，Bax及PTEN表達(dá)量下調(diào)(P< 0.01)，Bcl-2及p-AKT表達(dá)量上調(diào)(P< 0.01)。結(jié)論 miR-221低表達(dá)能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，與調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

miR-221；H9c2心肌細(xì)胞；氧化應(yīng)激；凋亡；PTEN/AKT信號(hào)通路

在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)氧自由基及活性氧的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而在病理情況下，活性氧的生成遠(yuǎn)大于機(jī)體清除能力后，會(huì)造成組織和細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。大量研究證實(shí)，心血管疾病心肌梗死，心力衰竭，心肌重塑，心肌缺血及心肌缺血再灌注等病理?xiàng)l件下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基及活性氧，造成心肌組織及細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，使得心肌細(xì)胞大量的凋亡或者壞死，加重病情，并造成惡性循環(huán)。其中細(xì)胞壞死一般是發(fā)生在心肌缺血或者缺血再灌注的終末階段，而心肌細(xì)胞凋亡貫穿于整個(gè)心血管疾病病理過程。因此，抑制氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)于心血管疾病的治療將具有顯著的改善作用[1, 2]。miRNA是一類具有18～23 nt氨基酸的保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，能結(jié)合于其下游靶基因mRNA的3’UTR端，進(jìn)而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，從而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)，凋亡，增殖，凋亡，遷移等生物學(xué)行為，也因此，miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括心血管疾病[3, 4]。但是miRNA在心血管疾病的氧化應(yīng)激損傷中的研究較少，所以本研究將選取一個(gè)miRNA，探討其在心肌氧化應(yīng)激中的作用。研究已顯示miR-221在心肌梗死，心力衰竭等高表達(dá)，且miR-221與心肌氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5-7]，但是具體的機(jī)制尚未見報(bào)道，因此，本研究將探討miR-221在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)損傷中的作用及具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。兔抗Bax，Bcl-2，PTEN，AKT，p-AKT，GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitmics公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine 2000，trizol 試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，MTT購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。miR-221 inhibitor(5’-GAAACCCAGCAGACAAUGUA GCU-3’)及miR-221陰性對(duì)照(正義鏈：5’-CGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’)由廣州市銳博生物科技有限公司訂購(gòu)合成。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN集團(tuán)公司；熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度的H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的H9c2細(xì)胞接種于96孔板后，24 h后，0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2作用48 h，采用MTT法檢測(cè)H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

通過Lipofectamine 2000將miR-21 inhibitor及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染濃度分別為200 nm和200 nm，6 h后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，RT-PCR法檢測(cè)miR-221 inhibitor轉(zhuǎn)染效果。另將實(shí)驗(yàn)分為4組，正常對(duì)照組，模型對(duì)照組(H2O2組)，陰性對(duì)照組(H2O2+陰性對(duì)照組)，抑制組(H2O2+miR-221 inhibitor組)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)miR-221表達(dá)量

采用trizol試劑盒提取總RNA，并檢測(cè)RNA純度。接著一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行realtime-PCR，采用2-△△t方法對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。引物設(shè)計(jì)如下，miR-221上游引物：5’- GGGCATGAACCTGGCATAC-3’， 下游引物：5’- AGGTAGCCTGAAACCCAGCA-3’。GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。引物分別加入25 μL的PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，59℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

按“1.2.1”或 “1.2.2”方法處理細(xì)胞，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入終濃度為5 mg/mL 的MTT 20 μL，4 h后，將上清液棄掉，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。

1.2.5 吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按“1.2.2”方法處理細(xì)胞，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，并加入1×Buffer A重懸細(xì)胞，接著將細(xì)胞濃度調(diào)整為106/mL，取95 μL細(xì)胞懸液加入5 μL的吖啶橙染液，并混合均勻，室溫條件下避光染色15 min，后將細(xì)胞懸液接種于載玻片上，并蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用Image pro plus6.0軟件分析圖像計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)。其中正常細(xì)胞被均為染成黃綠色，而凋亡細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核破碎成點(diǎn)狀，呈致密濃染的綠色。

1.2.6 Western-blot

按“12.2”方法處理細(xì)胞，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞加入裂解液裂解30 min，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品煮沸變性10 min，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，轉(zhuǎn)膜30～40 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，PTEN，AKT，p-AKT，GAPDH單克隆抗體，稀釋度皆為1∶100)4°C孵育過夜。次日二抗溶液(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋度為1∶200)室溫孵育1 h，并滴加化學(xué)曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響

注：與0 μmol/L H2O2比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響Note.Compared with 0 μmol/L H2O2, *P < 0.05，**P < 0.01.Fig.1 Effect of H2O2 on H9c2 cell viability

如圖1所示， 0、25、50、100、200、400 μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞48 h后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著H2O2劑量濃度的增加，H9c2細(xì)胞活力逐漸下降，差異有顯著性(P< 0.01)。在200 μmol/L 時(shí)，既能顯著抑制H9c2細(xì)胞活力，又不會(huì)使大量細(xì)胞凋亡，所以選此劑量濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的誘導(dǎo)劑量。

2.2 miR-221在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量

與正常對(duì)照組(0.18±0.02)比較，模型對(duì)照組(0.94±0.09)細(xì)胞中miR-221表達(dá)量顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.3 miR-221 inhibitor的轉(zhuǎn)染效果

如圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組中miR-221表達(dá)量顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組中miR-221表達(dá)量顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對(duì)照組；(2)模型對(duì)照組；(3)陰性對(duì)照組；(4)抑制組；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，##P < 0.01。圖2 miR-221 inhibitor的轉(zhuǎn)染效果Note.(1)normal control group;(2)model control group;(3)negative control group;(4)inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.2 Effect of miR-221 inhibitor transfection

2.4 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響

注：(1)正常對(duì)照組；(2)模型對(duì)照組；(3)陰性對(duì)照組；(4)抑制組；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，##P < 0.01。圖3 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響Note.(1)normal control group;(2)model control group;(3)negative control group;(4)inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.3 Effect of miR-221 inhibitor on viability of H9c2 cell induced by H2O2

如圖3所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組中細(xì)胞活力顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組中細(xì)胞活力顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.5 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響如圖4所示，與正常對(duì)照組(3.47±0.35)比較，模型對(duì)照組(45.49±4.56)及陰性對(duì)照組(43.97±4.40)中細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組(7.21±0.72)中細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對(duì)照組；(2)模型對(duì)照組；(3)陰性對(duì)照組；(4)抑制組。圖4 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響(×200)Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group.Fig.4 Effect of miR-221 inhibitor on viability of H9c2 cell induced by H2O2

2.6 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)量的影響

如圖5，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組中Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組中Bax表達(dá)量下調(diào)，Bcl-2表達(dá)量上調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對(duì)照組；(2)模型對(duì)照組；(3)陰性對(duì)照組；(4)抑制組；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，##P < 0.01。圖5 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中Bax，Bcl-2表達(dá)量的影響Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.5 Effect of miR-221 inhibitor on the expression of Bad and Bcl-2 in H9c2 cell induced by H2O2

2.7 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中PTEN及p-AKT表達(dá)量的影響

如圖6所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組中PTEN表達(dá)量上調(diào)，p-AKT表達(dá)量降低，差異有顯著性(P< 0.01)；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，抑制組中PTEN表達(dá)量下調(diào)，p-AKT表達(dá)量上升，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：(1)正常對(duì)照組；(2)模型對(duì)照組；(3)陰性對(duì)照組；(4)抑制組；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，##P < 0.01。圖6 miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中PTEN及p-AKT表達(dá)量的影響Note.(1)Normal control group;(2)Model control group;(3)Negative control group;(4)Inhibition group；Compared with normal control group, **P<0.01; Compared with model control group and negative control group, ##P < 0.01.Fig.6 Effect of miR-221 inhibitor on the expression of PTEN and p-AKT in H9c2 cell induced by H2O2

3 討論

1993年Lee首次在研究線蟲的發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)了miRNA，并命名為L(zhǎng)in-4，爾后2000年Reinhart也在線蟲發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)miRNA(Line-7)，因此miRNA迅速的成為生命科學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。miRNA是一類長(zhǎng)度約為18-25 nt的高度保守的小RNA，能通過與其靶基因的3’-UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平，從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)，增值，分化與凋亡的調(diào)控，與機(jī)體的發(fā)育、代謝及眾多疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。近些年研究發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌梗死，心力衰竭，心臟重構(gòu)，心肌缺血再灌注等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[8, 9]。而且研究也進(jìn)一步顯示miRNA與心血管基本氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，如Xu等[10]研究顯示miR-19b在H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-19b表達(dá)能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。Li等[11]研究顯示miR-139在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-139表達(dá)能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。而miR-221被發(fā)現(xiàn)較早，是從斑馬魚中獲得并克隆的miRNA，后來又在白血病細(xì)胞株HL-60進(jìn)一步克隆獲得。miR-221一直以來都被認(rèn)為具有抑癌基因，在肺癌，乳腺癌，胃癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并與miR-222是同一個(gè)onco-miR，都位于X染色體p11.3區(qū)[12]。而且Souza等[5]研究也表明miR-221在心力衰竭高表達(dá)。Coskunpinar等[6]研究證實(shí)心肌梗死組織中多種循環(huán)miRNA表達(dá)量異常，其中循環(huán)miR-221表達(dá)量最高，是正常組的3.89倍，且與心肌損傷標(biāo)志物超敏心肌肌鈣蛋白T及GARCE、 Synthax評(píng)分密切相關(guān)，提示循環(huán)miR-221是心肌梗死早期診斷新的標(biāo)記物。另外miR-221與糖尿病心肌氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7]，對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧引起的H9c2細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[13]。所以本研究推測(cè)miR-221與心肌氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。

H2O2作為活性氧中的一種，常常被用來模擬心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，因此本研究首先采用不同濃度 的H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，并結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)200 μmol/L H2O2能降低H9c2細(xì)胞一半活力，且此誘導(dǎo)劑量與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[14, 15]，因此被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)劑量。接著利用RT-PCR法檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-221的表達(dá)量，結(jié)果表明H2O2組中miR-221表達(dá)量上升，與Souza等[5]，Coskunpinar等[6]研究結(jié)果一致，RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明miR-221 inhibitor轉(zhuǎn)染的成功。所以我們接著利用MTT法及吖啶橙檢測(cè)miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力及凋亡的影響，結(jié)果表明抑制組細(xì)胞活力顯著提高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

細(xì)胞的凋亡受眾多信號(hào)通路調(diào)控，PI3K/AKT信號(hào)通路就是其中一種，其具有抗凋亡通路之稱，能通過調(diào)控下游多種靶蛋白如Bax及Bcl-2的表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化、遷移、侵襲及血管生成等過程[16, 17]。而同時(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路上游蛋白PTEN是miR-221的下游靶基因[12]。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，從而負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，在細(xì)胞凋亡中起重要作用。研究顯示miR-221通過調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路及Bax、Bcl-2的表達(dá)參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[18-20]。所以本研究繼續(xù)探討miR-221 inhibitor對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中PTEN/AKT信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明miR-221 inhibitor能顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中PTEN及Bax表達(dá)，上調(diào)p-AKT及Bcl-2表達(dá)，從而說明下調(diào)miR-221表達(dá)能通過激活PTEN/AKT信號(hào)通路，并調(diào)控下游蛋白表達(dá)，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-221在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-221表達(dá)能通過調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游蛋白Bax及Bcl-2表達(dá)，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

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The role of miR-221 in the injury induced by hydrogen peroxide in rat myocardial cells

FU Li-zhen1，HUANG Mao-qin2，LAO Zhi-yong1，XIAO Meng-Sheng1，ZHU De-kang1

(1.Department of Hainan Nongken General Hospital，Haikou 570203，China； 2.Department of Cardiology 2 Hainan Nongken General Hospital，Haikou 570203)

Objective To explore the role of miR-221 in the injury induced by hydrogen peroxide (H2O2) in rat myocardial cells (H9c2). Methods The viability of H9c2 cell induced by cell different concentrations of H2O2was determined by MTT. The expression of miR-221 was detected by RT-PCR method. The miR-221 inhibitor and negative control were transferred into H9c2 cells by Lipofectamine 2000, then the cells were divided into normal control group, model control group (H2O2group), negative control group (H2O2+ negative control group), inhibition group (H2O2+miR-221 inhibitor group). The cell viability was measured by MTT assay. Cell apoptosis was detected by acridine orange staining method. The expression of Bcl-2, Bax, phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN, p-protein kinase B (AKT) were assayed by Western Blot. Results 0，25，50，100，200，400 μmol/L H2O2inhibited H9c2 cell activity gradually, of which 200 mol/L inhibition of cell viability moderate, so as a subsequent induction dose. Compared with normal control group, cell viability was decreased (P< 0.01), cell apoptotic rat was increased (P< 0.01), the expression of Bax and PTEN was upregulated (P< 0.01), the expression of Bcl-2 and p-AKT was downregulated (P< 0.01) in model control group and negative control group. Compared with model control group and negative control group, inhibition group proves the contrary. Conclusions Down-expression of miR-221 could significantly inhibit oxidative stress damage in H9c2 cells, which related to regulation of PTEN/AKT signal pathway.

miR-221; H9c2 myocardial cell; Oxidative stress; Apoptosis; PTEN/AKT signal pathway

符麗珍(1980-)，女，主治醫(yī)師。E-mail: 13518828771@qq.com

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0083-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.018

2016-09-14