松花粉對環(huán)磷酰胺增效減毒作用研究

鞏 萍，孫 銅，戴曉莉，馬玉奎*

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐 262600；2. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101；3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟南 250100)

研究報告

松花粉對環(huán)磷酰胺增效減毒作用研究

鞏 萍1，孫 銅2，戴曉莉3，馬玉奎3*

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐 262600；2. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101；3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟南 250100)

目的 研究松花粉對環(huán)磷酰胺化療有無增效和減毒作用。方法 采用腹水型 S180 小鼠為實驗系統(tǒng)，通過檢測抑瘤率、血液學(xué)和肝功能指標(biāo)，評價松花粉對環(huán)磷酰胺化療的增效和減毒作用；采用免疫低下小鼠模型為實驗系統(tǒng)，通過檢測巨細(xì)胞吞噬功能、溶血素水平和胸腺、脾臟指數(shù)，評價松花粉的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果 松花粉( 150、300、600 mg/kg) 與環(huán)磷酰胺合用后抑瘤率明顯提高，可明顯抑制環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞下降和肝功能的損傷，可提高免疫低下小鼠單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能、溶血素水平和免疫器官系數(shù)。結(jié)論 松花粉可通過調(diào)節(jié)免疫對環(huán)磷酰胺化療起到明顯的增效減毒作用。

松花粉；免疫調(diào)節(jié)；增效減毒；環(huán)磷酰胺

我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，每年新發(fā)腫瘤病例300多萬，已嚴(yán)重危害人類的生命與健康。目前臨床上對于腫瘤的治療多采用化療方式，但是治療過程中大部分患者往往因無法耐受化療藥物所帶來的副作用而中斷治療。臨床上如何減少化療的毒副作用是亟待解決的問題，而中醫(yī)藥在這方面卻可以發(fā)揮很好的作用。松花粉( Pini Pollen )又名松花、松黃，可藥食兼用，是我國傳統(tǒng)中藥材，在我國具有悠久的藥用歷史，唐代的《新修本草》已有記載。松花粉的主要成分為蛋白質(zhì)、磷脂、多種維生素和礦物質(zhì)等[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，松花粉具有抗氧化、降糖、保肝、抗衰老、提高機體免疫力和抗腫瘤作用等眾多功效[2,3]。本文采用腹水型 S180 小鼠和免疫低下小鼠模型考察了松花粉對環(huán)磷酰胺化療的增效減毒作用并對其機制進行了初步研究，為松花粉進一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，雌雄各半，4周齡，體重(20±2)g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(魯)2014-0004]。飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境[SYXK(魯)2014-0008]，室溫20～25℃，濕度40%～70%，動物自由飲水飲食。本實驗經(jīng)過山東省藥學(xué)科學(xué)院IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為2014025。

1.2 主要試劑和儀器

松花粉(煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供，批號14010412)； 注射用環(huán)磷酰胺(CTX， 齊魯制藥有限公司提供，批號：20140823)；血液學(xué)、血液生化學(xué)檢測試劑盒均由寧波瑞源生物科技有限公司提供。

HEMAVET-950型全自動血球計數(shù)儀(Drew Scientitic公司)；日立7180全自動生化分析儀(日本株式會社日立高新技術(shù))；HH.CP-01W二氧化碳培養(yǎng)箱(北京中科環(huán)試儀器有限公司)；721-100型可見分光光度計(上海光學(xué)儀器一廠)；電子數(shù)顯卡尺(杭州安恒測控技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 對環(huán)磷酰胺化療的增效減毒作用[4]

80只小鼠接種腹水型S180腫瘤后6 d內(nèi)抽取腹水，用0.9%氯化鈉注射液稀釋調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0～4.0×107個細(xì)胞每毫升，在無菌條件下將腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右腋皮下，0.2 mL每只。接種后將小鼠隨機分為模型組、CTX單用組、CTX+松花粉(150、300、600 mg/kg)三個劑量組和松花粉(150、300、600 mg/kg)單用三個劑量組。接種次日開始灌胃給予相應(yīng)劑量的松花粉20 mL/kg，模型和CTX單用組給予等容積的純水。給藥第10天，除模型和單用松花粉組外，其余各組小鼠連續(xù)3 d靜脈給予CTX 50 mg/kg。末次給予松花粉后3 h，腹主動脈采血，檢測白細(xì)胞(WBC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等指標(biāo)。采血后取每只動物的瘤塊并稱瘤重，計算抑瘤率和q值[4]。

腫瘤抑制率=(A-B)/A×100%，B為藥物組平均瘤重，A為模型組平均瘤重。

q值=E(ab)/[Ea+(1-Ea) ×Eb]，E(ab)為兩種藥物合用的腫瘤抑制率，Ea、Eb為兩種藥物單用的腫瘤抑制率， q大于1.15表示兩種藥物合用具有協(xié)同作用。

1.3.2 松花粉對小鼠巨細(xì)胞吞噬功能的影響[5]

60只小鼠隨機分為正常組、模型組、松花粉150、300、600 mg/kg三個劑量組，每組10只，雌雄各半。各組小鼠分別每天1次灌服不同濃度的藥物溶液20 mL/kg，正常和模型組給予等容積純水，連續(xù)14 d。除正常組外，其余各組小鼠于給藥第7、9、11天分別腹腔注射50 mg/kg CTX，14 d給藥后2 h，靜脈給予25%墨汁10 mL/kg體重后2、10 min各采血20 μL，加入0.1%Na2CO3溶液2 mL，675 nm下測OD值。剖檢小鼠后采集肝臟和脾臟稱重，計算碳粒廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)。

廓清指數(shù)K=( logOD1-logOD2) /(T2- T1)，吞噬指數(shù)α=K1/3×體重/(肝臟重量+脾臟重量)。

1.3.3 松花粉對小鼠血清溶血素水平的影響[5]

60只小鼠，按照1.3.2方法分組和給予松花粉。松花粉各劑量組給藥第5次后，腹腔注射0.2 mL 20%兔紅細(xì)胞懸液進行免疫，免疫后第2、4、6天腹腔注射50 mg/kg CTX。模型組同法進行免疫和給予CTX。14 d給藥后2 h麻醉后取胸腺和脾臟，稱重計算100 g體重的相對系數(shù)。腹主動脈采血取血清，取10 μL血清用生理鹽水稀釋至1 mL，與0.5 mL 20%兔紅細(xì)胞懸液和0.5 mL補體混勻，37℃水浴中保溫0.5 h，0℃終止反應(yīng)，離心取上清液，540 nm下測 OD 值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 松花粉對環(huán)磷酰胺化療的增效作用

與模型組比較，松花粉和環(huán)磷酰胺合用后的抑瘤率明顯高于環(huán)磷酰胺或松花粉單用組，合用后q值大于0.85，說明松花粉在150、300、600mg/kg三個劑量下均可明顯增強環(huán)磷酰胺的抗腫瘤作用。結(jié)果見表1。

2.2 松花粉對環(huán)磷酰胺化療的減毒作用

與模型組比較，環(huán)磷酰胺化療后裸鼠WBC數(shù)量明顯減少，血清中ALT和AST水平明顯升高，說明環(huán)磷酰胺化療和引起WBC減少和損傷肝功能；與CTX組比較，化療的同時給予松花粉300、600mg/kg后以上指標(biāo)明顯恢復(fù)(P < 0.05)，說明松花粉在300mg/kg以上劑量可明顯抑制環(huán)磷酰胺化療引起的白細(xì)胞減少和肝功能損傷。結(jié)果見表2。

2.3 松花粉對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用

與正常組比較，模型組廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯降低(P < 0.01)，說明造模復(fù)制成功。與模型組比較，松花粉300、600mg/kg劑量組廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯提高(P < 0.05)，說明松花粉以上劑量對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能有明顯的提高作用。

2.4 松花粉對小鼠血清溶血素水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠溶血素水平、脾臟和胸腺系數(shù)廓清指數(shù)明顯降低(P < 0.01)，說明造模復(fù)制成功，小鼠免疫受到抑制。與模型組比較，松花粉300、600mg/kg劑量組溶血素水平、胸腺和脾臟系數(shù)明顯提高(P < 0.05)，說明松花粉以上劑量對免疫低下小鼠的免疫功能有明顯的提高作用。

表1 松花粉對化療的增效作用(±s，n=10)

Tab.1 The synergism effects of Pini Pollen on cyclophosphamide in model mice

表1 松花粉對化療的增效作用(±s，n=10)

組別Groups劑量/mg/kgDosage瘤重/gTumorweight抑瘤率/%Rateoftumorinhibitionp值pvalue模型Model—1.92±0.49——CTX500.95±0.36**50.5—松花粉PiniPollen600 1.32±0.41*31.3—3001.44±0.2625.0—1501.61±0.4416.1—CTX+松花粉CTX+PiniPollen600+50 0.70±0.19**63.50.96300+500.79±0.27**58.90.93150+500.88±0.37*54.20.88

注：*P< 0.05,**P< 0.01, vs模型組。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, vs model group.

表2 松花粉對環(huán)磷酰胺化療的減毒作用(±s，n=10)

Tab.2 The attenuation effects of Pini Pollen on cyclophosphamide in model mice

表2 松花粉對環(huán)磷酰胺化療的減毒作用(±s，n=10)

組別Groups劑量/mg/kgDosageWBC/109/LALT/U/LAST/U/L模型Model—7.8±1.1 62±15152±23CTX50 4.9±0.7*131±32** 214±35**CTX+松花粉CTX+PiniPollen50+6007.0±1.2# 81±22#172±28#50+3006.5±0.8# 90±27# 188±35*50+150 5.8±1.0*105±37* 199±39*

注：*P< 0.05,**P< 0.01, vs模型組；#P< 0.05, vs CTX組。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, vs model group；#P< 0.05, vs CTX group.

表3 松花粉對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用(±s，n=10)

Tab.3 The effects of Pini Pollen on carbon clearance rate in model mice

表3 松花粉對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用(±s，n=10)

組別Groups劑量/mg/kgDosage廓清指數(shù)(K)Clearanceindex吞噬指數(shù)(α)phagocyticindex正常Normal—0.020±0.0054.99±0.55模型Model500.011±0.003##3.72±0.58##6000.017±0.004*4.55±0.22*松花粉PiniPollen3000.015±0.003*4.39±0.39*1500.014±0.0023.99±0.39

注：*P< 0.05, vs模型組；##P< 0.01, vs 正常組。

Note.*P< 0.05, vs model group；##P< 0.01, vs normal group.

表4 松花粉對小鼠血清溶血素水平、胸腺和脾臟系數(shù)的影響(±s，n=10)

Tab.4 The effects of Pini Pollen on hemolysin level, thymus and spleen coefficient in model mice

組別Groups劑量/mg/kgDosage溶血素水平/OD值Hemolysinlevel胸腺系數(shù)/g/100gThymusindex脾臟系數(shù)/g/100gSpleenindex正常Normal—0.53±0.050.33±0.050.48±0.11模型Model500.29±0.03##0.21±0.05#0.30±0.08##6000.42±0.04**0.29±0.04*0.43±0.09*松花粉PiniPollen3000.38±0.04**0.26±0.04*0.40±0.07*1500.35±0.060.24±0.050.35±0.09

注：*P< 0.05,**P< 0.01, vs模型組；#P<0.05,##P<0.01, vs 正常組。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01, vs model group；#P<0.05,##P<0.01, vs normal group.

3 討論

目前惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率逐漸上升，正嚴(yán)重危害著全人類的生命與健康，世界衛(wèi)生組織預(yù)測全球腫瘤發(fā)病率每年以10%的速度遞增，每年新發(fā)病例約1500萬。而我國每年新增腫瘤病人200多萬，因癌癥死亡約150萬人，已成了各類死因之首[6]。目前對于腫瘤的治療，仍以化療為主，但化療的毒副作用太大，且易出現(xiàn)耐藥性，這些弊端嚴(yán)重制約著化療藥物的使用，降低了腫瘤患者用藥的依從性。因此如何提高化療藥物的治療效果，降低化療帶來的毒副作用是臨床上急需要解決的問題。而中藥因其多成分、多靶點和多環(huán)節(jié)效應(yīng)以及副作用小等優(yōu)點在輔助化療藥物抗腫瘤方面可起到優(yōu)勢互補作用。中藥可通過改善機體的內(nèi)環(huán)境和調(diào)節(jié)機體免疫力等多個方面來緩解腫瘤病人癥狀，提高患者的生存質(zhì)量[7]。

環(huán)磷酰胺是廣泛應(yīng)用的抗癌藥物之一，對惡心淋巴瘤、肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌、乳腺癌等均有較好的療效，本藥也作為免疫抑制劑治療非腫瘤疾患。骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)和肝功能損傷是其主要的不良反應(yīng)。本研究采用S180腹水型小鼠腫瘤模型，通過檢測抑瘤率研究其對化療藥物的增效作用，選用環(huán)磷酰胺最常見的白細(xì)胞減少和肝功能損傷副作用，研究其對化療藥物的減毒作用。研究結(jié)果表明，小鼠給予CTX后出現(xiàn)WBC減少、AST和ALT肝功能指標(biāo)升高，提示出現(xiàn)明顯肝功能損傷，與臨床腫瘤病人使用CTX化療后出現(xiàn)的血液和肝功損傷副作用基本一致。CTX化療的同時給予松花粉后WBC數(shù)量顯著增多，血清中AST和ALT含量顯著降低，說明松花粉對CTX化療因其的血液系統(tǒng)和肝功能損傷副作用有顯著保護作用。抑瘤試驗結(jié)果顯示，CTX化療的同時給予松花粉可使抑瘤率明顯提高，合用后P值大于0.85，說明松花粉和CTX合用后療效具有協(xié)同作用，可顯著增加化療藥物的抑瘤效果。本文還采用CTX致免疫低下小鼠，通過檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶血素含量和胸腺、脾臟相對系數(shù)等免疫學(xué)指標(biāo)，評價了松花粉對免疫系統(tǒng)和免疫功能的影響，結(jié)果亦顯示與免疫低下模型小鼠比較，灌胃給予松花粉后小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力提高，血清中溶血素水平、胸腺和脾臟系數(shù)明顯提高，說明松花粉對免疫低下小鼠的免疫功能有明顯的提高作用。綜上所述本實驗結(jié)果充分證明，松花粉對化療藥物具有明顯的增效、減毒作用和免疫提高能力，但其確切的作用機制仍有待于進一步研究。

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[2] 謝嬌,王華,任廷遠(yuǎn),等.松花粉的功效及應(yīng)用展望[J].食品與藥品,2011,12(3):139-141.

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Synergism and attenuation effects of Pini Pollen on cyclophosphamide

GONG Ping1,SUN Tong2, DAI Xiao-li3MA Yu-kui3*

(1. People’s Hospital of Linqu County, Linqu 262600,China; 2. Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101; 3. Shandong Pharmaceutical Academy, Jinan 250100)

Objective To investigate the synergism and attenuation effects of Pini Pollen on cyclophosphamide chemotherapy in model mice．Methods The models of mouse were induced with S180 tumor and cyclophosphamide. The tumor inhibiting rates, hematology, Liver function, giant cell phagocytosis, hemolysin level and indexes of thymus and spleen were determined to evaluate the synergism and attenuation effects of Pini Pollen(150,300,600 mg/kg) on cyclophosphamide chemotherapy．Results Compared with cyclophosphamide chemotherapy group，the tumor inhibiting rates，white blood cell number，giant cell phagocytosis, hemolysin level and indexes of thymus and spleen were increased, at the same time liver function damage were alleviated significantly in cyclophosphamide plus Pini Pollen groups．Conclusions Pini Pollen has a remarkable synergism and attenuation effects on cyclophosphamide chemotherapy through its immune adjustment functions．

Pini Pollen; Synergism and attenuation; Immune adjustment; Cyclophosphamide

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX02104)。

鞏萍(1972-)，女，主治醫(yī)師，本科， 研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail： yaoliduli@163.com

馬玉奎 (1975-)，男，主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評價。 E-mail： yukuima@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0060-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.014

2016-09-18