Fkbp51基因敲除對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組基因可變剪接的影響

周志強(qiáng)，楊志偉，雍偉東

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

Fkbp51基因敲除對(duì)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組基因可變剪接的影響

周志強(qiáng)，楊志偉*，雍偉東*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 通過(guò)分析Fkbp51基因敲除(knock out，KO)與野生型(wild type，WT)小鼠肝臟表達(dá)譜，研究Fkbp51基因敲除對(duì)肝臟組織基因可變剪接的影響。方法 利用二代測(cè)序?qū)kbp51 KO與WT小鼠肝臟進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序，用TopHat對(duì)RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行可變剪接分析，篩選出KO與WT小鼠肝組織中差異的內(nèi)含子保留(intron retetion，RI)和外顯子跳躍(exon skipping，SE)。通過(guò)在線工具DAVID對(duì)這些差異可變剪接體進(jìn)行基因功能 (gene ontology, GO)和代謝通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，同時(shí)用NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些基因進(jìn)行注釋。結(jié)果 (1)Fkbp51缺失可導(dǎo)致小鼠肝臟mRNA可變剪接發(fā)生變化；(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝臟mRNA可變剪接表達(dá)量的變化；(3)通過(guò)GO與KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生差異可變剪切的基因主要與脂肪相關(guān)衍生物的代謝、免疫、膽汁酸分泌等通路相關(guān)。(4)與差異內(nèi)含子保留相關(guān)的基因主要與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控，氨基酸及其衍生物代謝相關(guān)。結(jié)論Fkbp51基因敲除能夠改變基因組中mRNA的可變剪切，進(jìn)而影響小鼠肝臟的代謝功能。

Fkbp51基因敲除小鼠；肝臟； RNA-seq；可變剪接；內(nèi)含子保留；外顯子跳躍

Fkbp51是一種大分子免疫親和蛋白，可介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用。同時(shí)，F(xiàn)kbp51作為共伴侶蛋白通過(guò)與熱休克蛋白HSP90/HSP70形成復(fù)合物參與激素受體復(fù)合物的形成與調(diào)控[1]。研究表明Fkbp51可通過(guò)調(diào)節(jié)糖、脂代謝來(lái)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。肝臟是進(jìn)行糖、脂代謝的主要器官。在肝臟中，糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)糖異生，但它的過(guò)度分泌會(huì)造成糖代謝綜合征，如向心性肥胖、糖尿病、胰島素抵抗和脂肪病變等。糖皮質(zhì)激素結(jié)合皮質(zhì)激素受體后，激活后續(xù)通路，促進(jìn)Fkbp51的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)反饋?zhàn)饔糜谔瞧べ|(zhì)激素受體，降低其對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性，以維持機(jī)體平衡[2-4]。近年來(lái)，F(xiàn)kbp51在脂肪細(xì)胞分化中所起的重要作用引起了研究者越來(lái)越多的關(guān)注，Stechschulte[5]發(fā)現(xiàn)脂肪生成需要Fkbp51的參與；Toneatto J[6]發(fā)現(xiàn)Fkbp51可抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。我們的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kbp51 KO小鼠能抵制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，說(shuō)明Fkbp51基因在能量代謝和脂肪代謝中發(fā)揮著重要的作用[7]。

可變剪接是mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式產(chǎn)生的剪接異構(gòu)體，可變剪接可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，同時(shí)也是產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的原因之一?？勺兗艚訁⑴c了多種重要的發(fā)育過(guò)程，如果蠅性別決定[8]、人類器官和組織發(fā)育[9, 10]、肌肉組織分化[11]、CD分子的差異表達(dá)[12]、mRNA產(chǎn)物的降解等[13]。異常的剪接會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如地中海貧血癥[14]，強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓型肌萎縮癥、色素性視網(wǎng)膜炎、囊性纖維化、帕金森式癥、荷爾蒙缺陷等復(fù)雜疾病[15, 16]。

本文通過(guò)分析Fkbp51 KO與WT小鼠肝臟表達(dá)譜，研究Fkbp51基因敲除對(duì)其他基因可變剪接(內(nèi)含子保留及外顯子跳躍)的影響，并分析差異可變剪接參與的生物學(xué)過(guò)程及代謝通路，以期進(jìn)一步探索Fkbp51在肝臟糖、脂代謝中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及測(cè)序

2月齡同窩SPF級(jí)Fkbp51 KO與WT雄鼠(C57BL/6)，各3只，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[SYXK(京)2014-0029，SCXK(京)2014-0004]，體重為20～24 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。脫頸處死，取肝臟，Trizol法提取總RNA，樣品交由華大基因建庫(kù)和測(cè)序。

1.2 差異可變剪接的識(shí)別

原始序列去除低質(zhì)量、污染序列及接頭后，得到干凈序列；用TopHat將干凈序列比對(duì)到參考基因組，分析比對(duì)結(jié)果，尋找外顯子間的結(jié)合位點(diǎn)。首先篩選出KO和WT表達(dá)量有差異的可變剪接(t檢驗(yàn)，P< 0.05)。然后篩選新引入和缺失的可變剪接，所有可變剪接位點(diǎn)支持?jǐn)?shù)都大于5。

1.3 差異可變剪接的GO功能和KEGG代謝通路分析

將發(fā)生差異可變剪接的基因通過(guò)DAVID在線工具[17, 18]，以全基因組為背景進(jìn)行GO功能及KEGG 代謝通路[19]富集分析。 統(tǒng)計(jì)方法為Fisher’s exact test，Benjamini算法校正P值，校正后p-value <0.05為差異有顯著性。

1.4 受差異可變剪接影響的通路

內(nèi)含子保留和外顯子跳躍共同參與了生物學(xué)過(guò)程和代謝通路的調(diào)節(jié)。通過(guò)對(duì)差異外顯子跳躍和內(nèi)含子保留基因做GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG代謝通路注釋，來(lái)確定相關(guān)基因以SE、 RI、或兩者的組合來(lái)參與生物學(xué)過(guò)程和代謝通路。

2 結(jié)果

2 差異可變剪接基因的識(shí)別

基因發(fā)生差異外顯子跳躍事件統(tǒng)計(jì)如下：KO與WT共有，KO特異，WT特異的基因數(shù)分別為991、311、571個(gè)；發(fā)生內(nèi)含子保留事件，KO與WT共有，KO特異，WT特異的基因數(shù)分別為1503、463、705個(gè)。以WT為例，我們定義Fkbp51KO造成WT中可變剪接消失的基因?yàn)閃T特異基因、缺失的可變剪接為WT特異可變剪接；同理，我們也定義Fkbp51基因敲除造成KO中可變剪接出現(xiàn)的基因?yàn)镵O特異基因、新增加的可變剪接為KO特異可變剪接。在KO和WT都出現(xiàn)相同可變剪接的基因?yàn)楣灿谢?，可變剪接為共有可變剪接。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子保留和外顯子跳躍事件中，占主要部分的是共有可變剪接，其次是WT特異、KO特異。

2.2 差異可變剪接的識(shí)別

以基因可變剪接位點(diǎn)是否表達(dá)以及表達(dá)量的多少為標(biāo)準(zhǔn)，我們篩選出了KO和WT差異共有(都表達(dá)，但表達(dá)量有差別)、KO特異、WT特異可變剪接。外顯子跳躍中，差異共有、KO特異、WT特異可變剪接分別為122、15、12個(gè)。內(nèi)含子保留中，分別為498、104、144個(gè)。Fkbp51基因敲除對(duì)SE和RI都有影響，但對(duì)RI影響較大，共有746個(gè)差異RI可變剪接，而SE只有139個(gè)。對(duì)SE和RI來(lái)說(shuō)，F(xiàn)kbp51基因敲除主要影響共有可變剪接的表達(dá)量，其次造成新可變剪接的引入和原有可變剪接的缺失。

2.3 差異可變剪接的GO功能注釋

為了研究發(fā)生差異可變剪接的基因的功能，我們用DAVID做了GO功能富集分析，如表1、2。外顯子跳躍基因的GO注釋主要富集到四個(gè)過(guò)程，一是脂肪代謝衍生物相關(guān)的代謝過(guò)程，如脂肪酸，有機(jī)酸，甾體和膽固醇的代謝過(guò)程；二是免疫相關(guān)，如急性炎癥反應(yīng)中血漿蛋白的激活，體液免疫應(yīng)答，急性炎癥反應(yīng)，激活免疫應(yīng)答；三是補(bǔ)體的激活，包括補(bǔ)體激活的經(jīng)典和替代途徑；四是蛋白加工和成熟，如多肽鍵裂解的蛋白成熟；其他包括輔酶的代謝過(guò)程和芳香族化合物的分解代謝過(guò)程。在細(xì)胞組分的定位中，主要位于過(guò)氧化物酶體，線粒體和細(xì)胞質(zhì)核周圍。氧化物酶體的主要功能是利于脂肪、醇、氨基酸的分解，其主要的分子功能是與輔因子、維生素、脂質(zhì)結(jié)合。

在表2中，差異內(nèi)含子保留基因主要富集的生物學(xué)過(guò)程為mRNA的代謝過(guò)程、類固醇的生物合成過(guò)程、一碳代謝過(guò)程，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織方式的調(diào)控，細(xì)胞氨基酸衍生物代謝過(guò)程，對(duì)未折疊蛋白的反應(yīng)。主要的細(xì)胞組分位于核膜，脂質(zhì)雙層膜的細(xì)胞器，最靠近能動(dòng)細(xì)胞的移動(dòng)方向部分，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。主要的分子功能包括與核苷酸的結(jié)合、RNA結(jié)合、GTP酶結(jié)合、酸性氨基酸連接酶活性、RAB鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子活性和腺嘌呤核苷酸結(jié)合。mRNA的代謝過(guò)程中，結(jié)合活性是非常重要的。

表1 KO與WT發(fā)生差異外顯子跳躍基因的GO注釋

注：P-值<0.05。

Note.P-value<0.05.

2.4 差異可變剪接的KEGG代謝通路分析

為了研究差異可變剪接基因參與哪些代謝通路，我們用DAVID做了KEGG代謝通路分析，如表3、4所示。差異SE基因主要富集的通路有補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)，初級(jí)膽汁酸合成，細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的異源物代謝，PPAR信號(hào)通路。在表3中，富集在PPAR信號(hào)通路上的cyp450家族有Cyp4a14，主要參與脂肪酸的氧化；Apoc3參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；Scp2和Ehhadh參與脂肪酸的氧化。在細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的異源物代謝過(guò)程中，Gstz1和Gsta3是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，參與對(duì)毒物，致癌物質(zhì)和藥理活性親電子化合物的轉(zhuǎn)化解毒；Gsta3屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α家族，編碼的酶具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性；Gstz1參與氧化應(yīng)激反應(yīng)；Cyp2c50催化花生四烯酸分解成中鏈和ω末端羥酸；Ugt1a6a編碼葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)化小的親脂性分子如固醇激素和膽紅素等。

表2 KO與WT發(fā)生差異內(nèi)含子保留基因的GO注釋

注：P-值<0.05。

Note.P-value<0.05.

從表4可以看出，差異RI基因主要富集的通路與氨基酸代謝相關(guān)，包括半胱氨酸和蛋氨酸、含硒氨基酸代謝；另外一些富集與免疫相關(guān)，包括急性髓系白血病和慢性粒細(xì)胞白血?。贿€有一些富集到趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)和黑素的合成等。已有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中異?？勺兗艚拥谋壤哂谡＜?xì)胞，而且可變剪接類型也不同。Skotheim的腫瘤研究結(jié)果表明，原本在正常細(xì)胞中占較小比例的內(nèi)含子保留類型在腫瘤中上升，而外顯子跳躍的比例則下降[20]。

2.5 受差異可變剪接影響的通路

Fkbp51基因敲除對(duì)生物是一種非生物脅迫，F(xiàn)kbp51KO后，機(jī)體需要通過(guò)一些基因的調(diào)節(jié)來(lái)彌補(bǔ)Fkbp51基因的功能，而可變剪接就是這樣一種轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。在表5中，在類固醇代謝過(guò)程，急性炎癥反應(yīng)中血漿蛋白的激活，補(bǔ)體激活，有機(jī)酸的代謝過(guò)程，羧酸代謝過(guò)程，胺的代謝過(guò)程，急性炎癥反應(yīng)，多肽鍵裂解的蛋白成熟等過(guò)程，都發(fā)現(xiàn)了基因通過(guò)不同的可變剪接來(lái)參與生物過(guò)程和代謝通路。

表3 KO與WT發(fā)生差異外顯子跳躍基因的KEGG pathway

注：P-值<0.05。

Note.P-value<0.05.

表4 KO與WT發(fā)生差異內(nèi)含子保留基因的KEGG pathway

注：P-值<0.05。

Note.P-value<0.05.

表5 幾個(gè)通路相關(guān)的基因可變剪接事件

注：‘+’代表該類型可變剪接事件出現(xiàn)，‘-’代表該類型可變剪接事件未出現(xiàn)。

Note. ‘+’ represents the occurrence of alternative splicing event, ‘-’ represents the opposite.

3 討論

Fkbp51在糖、脂代謝過(guò)程中所扮演的具體角色目前仍不清楚，其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，這是一個(gè)多基因、多途徑、多步驟、多信號(hào)通路相互作用和相互影響的過(guò)程。因此，基于RNA測(cè)序比較Fkbp51 KO與WT小鼠肝臟表達(dá)譜，鑒定差異可變剪接并分析其功能，是揭示Fkbp51基因在糖、脂代謝中作用的一個(gè)重要突破口。

我們觀察到，F(xiàn)kbp51KO小鼠，高脂飼喂時(shí)，體重明顯減輕，肝臟脂滴減少。在基礎(chǔ)和高脂誘導(dǎo)條件下，氧氣消耗量，二氧化碳產(chǎn)生量，呼吸交換速率及產(chǎn)熱量均高于WT[7]。已有研究報(bào)道可變剪接因子和其他一些基因的敲除能夠影響可變剪接[21]。因此我們想了解Fkbp51基因敲除是否能影響其他基因的可變剪接，進(jìn)而影響Fkbp51表型相關(guān)的生物過(guò)程和代謝通路。

首先，通過(guò)分析數(shù)據(jù)共篩選出139個(gè)差異外顯子跳躍。通過(guò)進(jìn)一步的基因功能(GO)和KEGG代謝通路分析，我們發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與脂肪衍生物相關(guān)的代謝過(guò)程，如脂肪酸，有機(jī)酸，類固醇和膽固醇的代謝過(guò)程。其中，PCTP是磷脂轉(zhuǎn)移蛋白，具有脂質(zhì)結(jié)合和磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)活性；APOC1是載脂蛋白，在結(jié)合磷脂酰膽堿和抑制磷脂酶中發(fā)揮重要作用；BAAT是膽汁酸輔酶A，具有受體結(jié)合和棕櫚酰輔酶A水解酶的活性，在膽汁分泌中扮演重要角色；Akr1c6編碼酮類還原酶，利用NADH/NADPH催化醛與酮之間的轉(zhuǎn)換；Apoc3是載脂蛋白，與脂質(zhì)結(jié)合和膽固醇結(jié)合相關(guān)。Fdps編碼法尼基焦磷酸合酶，可以催化合成香葉基焦磷酸酯和法尼基焦磷酸酯，而法尼基焦磷酸酯是膽固醇和甾醇生物合成過(guò)程中重要的中間物質(zhì)。Pex5是過(guò)氧化物酶體因子5，與酶和蛋白的N端結(jié)合相關(guān)。Hgd是尿黑酸1,2雙加氧酶，能催化尿黑酸的加氧。Ehhadh編碼的蛋白是一個(gè)雙功能酶，是過(guò)氧化物酶體β-氧化途徑4種酶的一種。Gstz1是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。因此深入研究Fkbp51與這些基因的關(guān)系，對(duì)于探究Fkbp51在脂代謝中的作用具有重要意義。

其次，我們篩選出746個(gè)差異內(nèi)含子保留，這些差異基因主要參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織方式的調(diào)控，氨基酸及其衍生物的代謝，與脂代謝和糖代謝相關(guān)性不大，但與類固醇的代謝相關(guān)。這說(shuō)明和內(nèi)含子保留相比，外顯子跳躍在脂代謝和糖代謝中的作用更重要。內(nèi)含子保留可能更多地參與翻譯前轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控，如通過(guò)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解，而不是通過(guò)翻譯成蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用。

本文主要討論了Fkbp51基因敲除對(duì)可變剪接的影響，對(duì)研究其在脂肪代謝中的作用提供一個(gè)新的思路。為了驗(yàn)證Fkbp51基因敲除造成的可變剪切的生物學(xué)意義，下一步我們將重點(diǎn)研究Ehhadh、Gsta3、Comt、Glo1、Acox1、Ahcy、Rpl17和Hc這些可變剪接體的變化，通過(guò)3‘或5’ RACE方法，對(duì)相應(yīng)剪切體克隆，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究這些可變剪切體的生物學(xué)功能，以期有新的發(fā)現(xiàn)。

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Effects ofFkbp51 gene knockout on the alternative splicing of liver transcriptome in mice

ZHOU Zhi-qiang, YANG Zhi-wei*, YONG Wei-dong*

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medical Center，Peking Union Medical College (PUMC); Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China)

Objective The purpose of this study is to understand the influence ofFkbp51 gene knockout on alternative splicing of mRNA in liver tissues. Methods mRNAs of liver from bothFkbp51 knockout(KO) and wild type(WT) mice were isolated. mRNA expression profiling was performed using RNA-seq reads. The mRNA reads produced from RNA-seq was analysed by TopHat for alternative splicing. Exon skipping and intron retetion were identified according to alignment analyses. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment were analyzed using online tools DAVID. All genes which had differently expressed alternative splicing between WT and KO were annotated using NCBI database. Results (1)Fkbp51 KO can introduce new mRNA alternative splicing; (2)Fkbp51 KO also cause mRNA alternative splicing expression change; (3) According to GO and KEGG analysis, it was found that the mRNA alternative splicing changes mainly enriched in fat metabolism, immune, bile acid secretion, and PPAR signaling pathway etc. (4) The genes which have different intron retetion events are mainly involved in regulation of actin cytoskeleton organization and amino acids metabolism. ConclusionsFkbp51 gene knockout can cause the change of mRNA alternative splicing, and thereby affect the metabolism of liver in mice.

FKBP51 knockout mice;Liver;RNA-seq;Alternative splicing;Intron retention;Exon skipping

艾滋病和病毒性肝炎傳染病重大專項(xiàng)(2014ZX10004002)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81272273)。

周志強(qiáng)(1986-)，男，碩士生，研究方向：基因與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: 522845911@qq.com

雍偉東(1968-)，男，研究方向：生殖與發(fā)育生物學(xué)。Email: wyong@cnilas.org； 楊志偉(1969-)，男，研究方向：高血壓。Email: zhw_yang@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0031-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.009

2016-11-15