液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用法確證肉食品中低濃度克侖特羅

王占良 張建麗 趙宇 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心食品藥品興奮劑檢測實驗室（北京 100029）

液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用法確證肉食品中低濃度克侖特羅

王占良 張建麗 趙宇 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心食品藥品興奮劑檢測實驗室（北京 100029）

目的：采用液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用法對肉食品中殘留的低濃度克侖特羅進行確證分析。方法：樣品勻漿處理后，酸化去除蛋白，經(jīng)液液萃取和MCX 3cc固相萃取柱兩步純化，以流動相為10 mmol/L的pH 3.5甲酸銨和乙腈為流動相，梯度洗脫，采用Eclipse C18（1.8μm，4.6×100 mm）色譜柱分離，電噴霧離子源，正離子多反應監(jiān)測模式掃描分析檢測。結(jié)果：D9-克侖特羅為內(nèi)標，克侖特羅的線性范圍為0.01～0.2μg/kg，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99，檢出限為0.005μg/kg，3個不同水平的加標回收率為78.8%～114.8%，相對標準偏差不大于10%。結(jié)論：該方法具有操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，可以完成肉食品樣品中痕量克侖特羅的確證分析。

克侖特羅；興奮劑；肉食品；液相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）

克侖特羅（Clenbuterol）化學名為2-[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇，一般以鹽酸鹽形式存在，化學結(jié)構(gòu)式見圖1。由于顯著促進動物生長的功效，并增加瘦肉率，以及較低中毒濃度等，克侖特羅在中國畜牧業(yè)中被禁止使用，但非法使用現(xiàn)象時有發(fā)生?？藖鎏亓_作為興奮劑被世界反興奮劑機構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）列為禁止運動員使用的一種蛋白同化制劑[1]，2013年1月1日，世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）技術(shù)文件《TD2013MRPL》[2]正式實施，該技術(shù)文件規(guī)定尿樣中克侖特羅的檢測限由2 ng/ml變更為0.2 ng/ml，2015版技術(shù)文件依然為0.2 ng/ml的MRPL。技術(shù)文件中檢測限的變化對興奮劑檢測提高了要求，同時運動員肉食品安全保障工作形勢更加嚴峻。

圖1 克侖特羅的化學結(jié)構(gòu)式

目前，肉食品和尿樣中克侖特羅的檢測主要有膠體金免疫層析法、氣象色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-串接質(zhì)譜法[3，4]。肉食品和尿樣中現(xiàn)行有效國家標準方法的檢測限為0.1μg/kg[5]，進出口檢驗檢疫標準方法的檢測限為0.05μg/kg[6]，采用液質(zhì)聯(lián)用高分辨質(zhì)譜檢測尿樣中的克侖特羅可以達到pg/ml的檢測水平。

經(jīng)人體試驗研究證實，運動員食用了克侖特羅殘留濃度為0.1μg/kg的豬肉或豬內(nèi)臟，就會造成運動員尿檢陽性[7]。另外，人體食用食源性克侖特羅后，尿中的排泄?jié)舛仍?/2 MRPL水平可以持續(xù)7～8日[8]。因此，國家標準檢測限濃度或相近濃度克侖特羅殘留的肉食品對于運動員是不夠安全的，無法避免運動員食源性克侖特羅問題。開發(fā)更加靈敏同時可以確證低濃度克侖特羅殘留樣品的檢測方法很有必要。弱陽離子固相萃取柱（MCX）價格較貴，吸附能力強，在肉食品中β2-受體激動劑殘留檢測中應用較多，該種填料對吸附堿性物質(zhì)具有良好的特異性，可以保證良好的回收率。由于填料的容量限制，在處理大容量樣品時，填料的吸附能力很快飽和，回收率明顯下降。

本研究采取液液萃取富集克侖特羅，并使用低填料容量MCX固相萃取柱純化相結(jié)合的方法，有效去除基質(zhì)干擾，獲得良好的重現(xiàn)性和低濃度檢測的穩(wěn)定性。在檢測靈敏度相對較低水平液質(zhì)串接質(zhì)譜聯(lián)用儀上實現(xiàn)了克侖特羅檢測的高靈敏度和良好重現(xiàn)性，檢測限達到pg/g的水平（ng/kg）。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1200 HPLC/6410A MS/MS液相色譜串接質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）；Waters 20孔固相萃取裝置和MCX3cc 60 mg固相萃取柱：美國沃特世公司產(chǎn)品；Sigma X3R高速冷凍離心機：美國西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品；Ika T18分散機：廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司德國伊爾姆真空泵：德國伊爾姆真空泵制造有限公司產(chǎn)品；Dri-block DB-3D氮氣吹干裝置：英國TECHNE公司產(chǎn)品；MILIQ純水機：美國密理博公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

克侖特羅購買自中國食品藥品檢定研究院，D9-克侖特羅購買自澳大利亞標物中心，精密稱取配制成1 mg/ml的甲醇溶液；氫氧化鈉、氨水、高氯酸為分析純：北京化學試劑廠產(chǎn)品；甲醇、甲酸銨：色譜純，美國DIK?MA公司產(chǎn)品；50 ml螺口玻璃離心管、螺口玻璃試管、進樣小瓶、進樣小瓶鋁蓋：美國National公司產(chǎn)品；美國西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18 100 mm×4.6 mm 1.8μm；流動相為10 mmol/L甲酸銨的水溶液和乙腈；梯度洗脫（0 min，乙腈20%；5 min，乙腈70%；7 min，乙腈75%；7.01 min，乙腈20%；）；流速為0.4 ml/min；柱溫15℃；進樣量10μl；樣品采集時間8 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，掃描方式為多反應檢測方式（MRM），采集離子對見表1；干燥氣流速為10 L/min；干燥氣溫度300℃；霧化氣壓力40 psi。

表1 克侖特羅的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 肉樣前處理方法

肉樣200 g，切成直徑約1 cm的肉丁，準確稱取10 g（誤差0.2 g）置于50 ml塑料離心管內(nèi)，加入質(zhì)量濃度為0.1μg/L的D9-克侖特羅20μL、50%的甲醇水溶液10 ml，12000 rmp/min的轉(zhuǎn)速勻漿1 min，4 ml的純凈水清洗刀頭兩次，合并清洗液于樣品塑料離心管內(nèi)，加入2 ml的濃高氯酸，超聲提取30 min，溫度－10℃下10000 rpm/min轉(zhuǎn)速離心8 min，收集提取液于50 ml的塑料離心管內(nèi)（提取液混濁時，采用濾膜濾過取出固體雜質(zhì)），加入濃度12 mol/L的NaOH溶液3 ml，叔丁基甲醚10 ml，水平振蕩提取10 min，溫度0℃下4000 rpm/min轉(zhuǎn)速離心4 min，收集上層提取液于10 ml的玻璃離心管內(nèi)，65℃下氮氣吹干，0.5 ml甲醇溶解殘渣，加入2.5 ml的0.1 mmol/L的高氯酸，待凈化。

MCX 3cc 60 mg的固相萃取柱（3 ml的5%的甲醇氨，3 ml的甲醇，3 ml的水，3 ml的0.1 mMol/L的高氯酸溶液依次活化），將玻璃離心管內(nèi)溶液全部上柱，3 ml的甲醇淋洗，3 ml的5%的甲醇氨洗脫，收集洗脫液，在溫度65℃下氮氣吹干，加入200μL的初始比例流動相溶解殘渣，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化和專屬性

據(jù)文獻報道[9]，低濃度克侖特羅在固相萃取柱和液液萃取的兩種方式的提取率有明顯差異，液液萃取更加有效提取樣品中低濃度克侖特羅。采用液液萃取的方式處理后，提取液的結(jié)果顯示良好的回收率；但是，基質(zhì)干擾很大，尤其是克侖特羅277-203的基峰離子對，有顯著的增益，無法符合WADA技術(shù)文件2015ID?CR[10]的要求。

本實驗采取藥液萃取的方式對樣品進行初步富集，有效提高了樣品中低濃度克侖特羅的提取效率，同時結(jié)合固相萃取柱純化，有效去除基質(zhì)效應和雜質(zhì)，尤其是克侖特羅基峰離子對的干擾。

稱取約10 g的空白肉食品樣品，添加0.005μg/kg的克侖特羅，按照1.4方法進行操作，所得到的多反應離子對監(jiān)測色譜圖示于圖2c。結(jié)果表明，克侖特羅的特征離子對分離良好，相互間沒有影響；在空白樣品中，克侖特羅出峰保留時間無干擾峰出現(xiàn)，該方法具有較好的專屬性，見圖2b。

2.2 校準曲線、檢測限和定量限

在空白樣品中，添加分析物質(zhì)量濃度為0.01～0.2 μg/kg的系列混合標準溶液，經(jīng)1.4的前處理方法處理并儀器分析后，以克侖特羅的定量離子對色譜峰面積與D9-克侖特羅的定量離子色譜峰面積之比（Y）為縱坐標，分析物標準溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標做校準曲線，結(jié)果見表2。由表2中數(shù)據(jù)可看出，克侖特羅校準曲線相關(guān)系數(shù)平方均大于0.99，表明目標分析物在質(zhì)量濃度0.01～0.2μg/kg內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，且無背景干擾。

表2 克侖特羅的線性方程、檢測限和定量限

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定。以3倍信噪比（S/ N=3）對應的目標物濃度作為檢出限，以S/N=10對應的目標物濃度作為定量限，獲得的各目標物的檢出限和定量限結(jié)果如表2所示。

2.3 回收率試驗

表3是添加水平為0.01，0.02及0.1μg/kg時的回收率及精密度。由數(shù)據(jù)可以看出，分析物在高中低三種加標水平下平均回收率為78.8%～114.8%之間，相對標準偏差為6%～9%之間。本實驗采用同位素內(nèi)標對樣品檢測過程監(jiān)控和定量校正，獲得良好回收率，可以滿足常規(guī)檢測中低濃度克侖特羅樣品確證的需要。

2.4 樣品的確證分析

樣品中克侖特羅的確證包括空白、樣品3份（平行樣品）、質(zhì)控樣品2份（空白中添加高、低濃度的克侖特羅），樣品前處理程序按照1.4所述的前處理方法進行，儀器分析部分則按照1.3中方法進行，樣品進樣順序采取空白、樣品、空白、質(zhì)控樣品的進樣序列進行儀器分析，質(zhì)譜圖結(jié)果見圖2。

表3 不同添加水平下各目標物的加標回收率和相對標準偏差（RSD）（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜串接質(zhì)譜法確證肉食品中低濃度克侖特羅檢測方法，樣品采取液液萃取和固相萃取相結(jié)合的方法達到凈化消除基質(zhì)效應，獲得良好回收率，該方法在檢測靈敏度較低水平液質(zhì)串接質(zhì)譜聯(lián)用儀上實現(xiàn)了克侖特羅檢測的高靈敏度和良好重現(xiàn)性，檢測限達到pg/g水平。

圖2 克侖特羅的色譜分離圖：陽性樣品（a），空白樣品（b）和質(zhì)控樣品（c）

[1] World anti-doping agency.WADA Prohibited list 2017. 2017：1-9.

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[5]動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，GBT 21313-2007.

[6]進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，SNT 1924-2011.

[7]張建麗，王占良，高照，等.人體食源性鹽酸克倫特羅尿樣興奮劑陽性可能性研究[J].中國運動醫(yī)學雜志，2010，29（5）：580-583.

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[10]World anti-doping agency.WADA TD2015IDCR.2015：1-4.

Determination of Low-concentration Clenbuterol in Edible Meat Using High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

Wang Zhanliang，Zhang Jianli，Zhao Yu，Zhang Yinong
China Anti-doping Agency，Beijing 100029，China Corresponding Author：Wang Zhanliang，Email：wangzhanliang@chinada.cn

ObjectiveTo determine low-concentration clenbuterol in edible meat based on the solidphaseextraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem massspectrometry（HPLC-MS/MS）.MethodThe homogenated sample was acidized to remove proteins，and purified using the liquid-liquid extraction and MCX Oasis solid prepared extraction column，then further treated with gradientelution with themobile phaseofammonium formate（10 mmol/L and pH 3.5） and acetonitrile.The clenbuterol was completely separated on Eclipse C18（1.8μm，4.6×100 mm）column and detected in multiple reaction monitoring（MRM）mode.ResultsA good linearity was achieved for clenbuterolin the arrange of0.01～0.2 μg/kg based on the internalstandard calibration ofD9-clenbuterol，with the linearity correlation coefficient greater than 0.99 and the detection limit of 0.005 μg/kg.The relative recovery of target compounds spiked in blank sample at three levels ranging from 78.8 to 114.8%，with the relative standard deviations less than 10%.ConclusionThe method in this research is simple，rapid，reliable and suitable to confirm low-concentration clenbuterol in edible meat.

clenbuterol，doping，edible meat，high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）

2016.01.26

王占良,Email:wangzhanliang@chinada.cn