丙戊酸對百草枯與脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性極化的作用

曾仁慶，吳曦子，趙洋子，鄧云蕾，于詩源，李蕙伊，劉暢，范晨玲，王紅，崇巍

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110001；3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州510080；4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001）

丙戊酸對百草枯與脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性極化的作用

曾仁慶1，吳曦子1，趙洋子1，鄧云蕾2，于詩源3，李蕙伊1，劉暢1，范晨玲4，王紅4，崇巍1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽110001；3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州510080；4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001）

目的分析組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑丙戊酸（VPA）對百草枯（PQ）和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性極化的作用。方法小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后分組，分別給予以下處理:（1）PQ；（2）PQ+VPA（HDACⅠ和Ⅱa類抑制劑）；（3）PQ+Apicidin（HDACⅠ類抑制劑）；（4）PQ+MC1568（HDACⅡa類抑制劑）；（5）LPS；（6）LPS+ VPA；（7）LPS+Apicidin；（8）LPS+MC1568。8 h后收集各組細(xì)胞上清及細(xì)胞團(tuán)，RT-PCR、ELISA及流式細(xì)胞檢測巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果PQ與LPS均促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎表型極化；VPA、Apicidin和MC1568均抑制PQ、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型極化作用，但抑制作用不完全相同。結(jié)論VPA抑制PQ和LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性，但對PQ和LPS的作用方式各有特點(diǎn)。

百草枯；脂多糖；丙戊酸；巨噬細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化

急性百草枯（paraquat，PQ）中毒和膿毒癥是我國醫(yī)院急診科常見的危重癥。無論是急性PQ中毒的氧自由基損傷，還是膿毒癥的病原體感染，均可引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致多臟器功能不全甚至死亡，目前尚無特效的治療手段。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是維持蛋白乙?；癄顟B(tài)的關(guān)鍵酶，參與免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）的激活、促炎及抗炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。HDAC抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）能使過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的乙?；Ш鉅顟B(tài)重新恢復(fù)平衡。HDACI根據(jù)所抑制的HDAC特異性分為非選擇性HDACI［pan-HDACI，包括丙戊酸（valproic acid，VPA），抑制Ⅰ、Ⅱa類HDAC］與選擇性的HDACI（iso-HDACI，包括Apicidin抑制Ⅰ類HDAC MC1568、抑制Ⅱa類HDAC）。有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［1-3］表明，二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）、曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）及VPA等pan-HDACI可減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α等基因和蛋白的表達(dá)［1，4］，但是目前尚不清楚pan-HDACI是通過抑制哪種HDAC亞型發(fā)揮抗炎效應(yīng)的。我們前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，SAHA抑制PQ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS、TNF-α，但是尚不清楚VPA的效應(yīng)機(jī)制。

巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者。根據(jù)其活化方式及活化后功能，可分成2種不同的功能表型，即促炎（M1）型和抑炎（M2）型。M1和M2型巨噬細(xì)胞處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)中。當(dāng)過度炎癥反應(yīng)時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)，大量釋放炎性細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致組織損傷。巨噬細(xì)胞功能表型標(biāo)志物有CD16/32、iNOS、IL-6、CD86、TGF-β1、ARG1、CD206和IL-10等，其中前4種屬于M1型標(biāo)志物，后4種屬于M2表型標(biāo)志物［6-8］，它們的表達(dá)情況決定了巨噬細(xì)胞的功能是促炎型還是抑炎型。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對象，分析VPA分別對PQ和LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞功能表型的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7（ATCC公司）培養(yǎng)條件如下：含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的細(xì)胞培養(yǎng)液、37℃、5%CO2的孵箱。待細(xì)胞生長達(dá)80%左右的接觸率時(shí)，吸出上清，更換為含0.5%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液。次日分組，分別給予以下處理：（1）PQ（0.1 mmol/L）；（2）PQ（0.1 mmol/L）+VPA（HDACⅠ和Ⅱa類，3 mmol/L）；（3）PQ（0.1 mmol/L）+ Apicidin（HDACⅠ類抑制劑，0.01 μmol/L）；（4）PQ（0.1 mmol/L）+MC1568（HDACⅡa類抑制劑，10 μmol/L）；（5）LPS（1 μg/mL）；（6）LPS（1 μg/mL）+ VPA（3 mmol/L）；（7）LPS（1 μg/mL）+Apicidin（0.01 μmol/L）；（8）LPS（1 μg/mL）+MC1568（10 μmol/L）。于8 h后收集各組細(xì)胞上清及細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行檢測。

1.2 RT-PCR檢測

將上述收集的細(xì)胞團(tuán)用RNeasy Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取總RNA，用High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒（美國Applied Biosystems公司）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體操作按各試劑盒說明書，加入熒光定量PCR試劑SYBR Green Master Mix（瑞士Roche公司）、GADPH及上下游引物（上海生物工程股份有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：GAPDH上游5’-CCTGGAGAAACCTG CCAAGTAT-3’，下游5’-CTCGGCCGCCTGCTT-3’；CD16上游5’-CATCAGCTCCTGTCTGGTTT-3’，下游5’-CTCTCTGCAGCCTGTGTATTT-3’；iNOS上游5’-GAACGGAGAACGTTGGATTTG-3’，下游5’-TCAG GTCACTTTGGTAGGATTT-3’；CD206上游5’-GTG GTCCTCCTGATTGTGATAG-3’，下游5’-CACTTGT TCCTGGACTCAGATTA-3’；ARG-1上游5’-GTCCCT AATGACAGCTCCTTTC-3’，下游5’-CCACACTGAC TCTTCCATTCTT-3’。運(yùn)用Roche LightCycler480檢測，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對含量。

1.3 ELISA檢測

留取各組細(xì)胞上清，用ELISA試劑盒（美國R&D公司）檢測細(xì)胞上清中IL-10蛋白和TNF-α蛋白的含量，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀（TECAN F200PRO，法國CISBIO公司）檢測。

1.4 流式細(xì)胞檢測

收集各組細(xì)胞團(tuán)，用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式熒光蛋白檢測（NOS2蛋白和ARG-1蛋白）。檢測抗體為抗小鼠NOS2-APC抗體（美國eBioscience公司）及抗小鼠ARG-1 FITC抗體（美國R&D公司）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用EXCEL軟件錄入數(shù)據(jù)。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)檢測3次，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQ和LPS分別對巨噬細(xì)胞功能表型的作用

如表1所示，與對照組相比，PQ升高全部4個(gè)巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2個(gè)M2型標(biāo)志物（CD206mRNA及ARG-1蛋白）水平，可見PQ以升高M(jìn)1型標(biāo)志物水平為主；與此相似，LPS也升高全部4個(gè)巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOS mRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2個(gè)M2型標(biāo)志物（IL-10蛋白及ARG-1蛋白）水平，可見LPS也是以升高M(jìn)1型標(biāo)志物為主。PQ與LPS的效應(yīng)均是促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎表型極化，進(jìn)一步分析可見，PQ與LPS的效應(yīng)還略有不同：PQ升高M(jìn)2型標(biāo)志物中CD206mRNA水平，而LPS則升高M(jìn)2型標(biāo)志物中IL-10蛋白水平。

表1 PQ和LPS分別對巨噬細(xì)胞功能表型的作用（Tab.1 Effect of PQ and LPS on macrophage phenotype

表1 PQ和LPS分別對巨噬細(xì)胞功能表型的作用（Tab.1 Effect of PQ and LPS on macrophage phenotype

1）P＜0.05 vs control（PQ）group；2）P＜0.05 vs control（LPS）group.

ItemControl（PQ）groupControl（LPS）groupPQ groupLPS group M1 maker CD16mRNA1.00±0.001.00±0.003.62±1.051）1.34±0.102）iNOSmRNA1.00±0.001.00±0.0015.74±1.631）2.12±0.192）TNF-α protein2 850.89±146.468 589.56±367.124 746.22±155.161）25 058.89±993.422）NOS2 protein46.76±5.7137.27±1.0556.53±2.851）79.40±5.012）M2 maker CD206mRNA1.00±0.001.00±0.003.08±0.791）1.91±0.54 ARG-1mRNA1.00±0.001.00±0.004.83±1.600.96±0.17 IL-10 protein57.40±5.43125.47±2.2655.23±3.38336.70±7.252）ARG-1 protein0.37±0.031.69±0.184.82±0.241）23.33±0.322）

2.2 VPA、Apicidin和MC1568分別對PQ作用的巨噬細(xì)胞功能表型作用的影響

如表2所示，與PQ作用的巨噬細(xì)胞相比，VPA降低2個(gè)M1型標(biāo)志物（iNOS mRNA及TNF-α蛋白）和1個(gè)M2型標(biāo)志物（IL-10蛋白）水平，可見VPA抑制PQ作用的巨噬細(xì)胞向促炎表型極化。Apicidin降低PQ作用的巨噬細(xì)胞3個(gè)M1型標(biāo)志物（CD16 mRNA、iNOSmRNA及TNF-α蛋白）和1個(gè)M2型標(biāo)志物（ARG-1mRNA）水平，其總體效應(yīng)相當(dāng)于降低了2個(gè)M1型標(biāo)志物，同時(shí)Apicidin還升高1個(gè)M2型標(biāo)志物（ARG-1蛋白）水平，由此可見Apicidin強(qiáng)于VPA的效應(yīng)。MC1568降低PQ作用的巨噬細(xì)胞3個(gè)M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOSmRNA及TNF-α蛋白）和3個(gè)M2型標(biāo)志物（CD206mRNA、ARG-1 mRNA及ARG-1蛋白）水平，可見MC1568對PQ作用的巨噬細(xì)胞表型極化的作用不明顯。因此，三者的效應(yīng)強(qiáng)弱關(guān)系為：Apicidin＞VPA＞MC1568。

表2 VPA、Apicidin和MC1568分別對PQ作用的巨噬細(xì)胞功能表型的作用Tab.2 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by PQ

表2 VPA、Apicidin和MC1568分別對PQ作用的巨噬細(xì)胞功能表型的作用Tab.2 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by PQ

1）P＜0.05 vs PQ group.

ItemPQ groupPQ+VPA groupPQ+Apicidin groupPQ+MC1568 group M1 makers CD16mRNA3.62±1.054.67±1.370.77±0.051）0.70±0.051）iNOSmRNA15.74±1.630.84±0.271）0.29±0.021）0.92±0.521）TNF-α protein4 746.22±155.16343.00±18.011）1 561.67±84.331）2 336.00±105.961）NOS2 protein56.53±2.8553.53±4.7348.57±4.8551.98±6.44 M2 makers CD206mRNA3.08±0.792.30±0.531.69±0.210.46±0.091）ARG-1mRNA4.83±1.601.43±0.340.45±0.081）0.83±0.061）IL-10 protein55.23±3.3841.70±1.141）64.00±5.9166.98±15.68 ARG-1 protein4.82±0.243.47±0.848.57±0.431）2.28±0.611）

2.3 VPA、Apicidin和MC1568分別對LPS作用的巨噬細(xì)胞功能表型作用的影響

如表3所示，VPA降低LPS作用的巨噬細(xì)胞4個(gè)M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和1個(gè)M2型標(biāo)志物（ARG-1蛋白）水平，同時(shí)還升高1個(gè)M2型標(biāo)志物（IL-10蛋白）水平，其總體效應(yīng)相當(dāng)于降低了4個(gè)M1型標(biāo)志物，可見VPA抑制LPS作用的巨噬細(xì)胞向促炎表型極化。Apicidin降低LPS作用的巨噬細(xì)胞全部4個(gè)M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）和2個(gè)M2型標(biāo)志物（IL-10蛋白及ARG-1蛋白）水平，可見Apicidin抑制LPS作用的巨噬細(xì)胞向促炎表型極化有一定的作用，但是較VPA弱。MC1568降低LPS作用的巨噬細(xì)胞4個(gè)M1型標(biāo)志物（CD16mRNA、iNOSmRNA、TNF-α蛋白及NOS2蛋白）水平，同時(shí)還升高2個(gè)M2型標(biāo)志物（ARG-1蛋白及IL-10蛋白）水平，可見MC1568抑制LPS作用的巨噬細(xì)胞向促炎表型極化的作用比VPA更強(qiáng)。因此，三者的效應(yīng)強(qiáng)弱關(guān)系為：MC1568＞VPA＞Apicidin。

表3 VPA、Apicidin和MC1568分別對LPS作用的巨噬細(xì)胞功能表型的作用（Tab.3 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by LPS（

表3 VPA、Apicidin和MC1568分別對LPS作用的巨噬細(xì)胞功能表型的作用（Tab.3 Effect of VPA，apicidin，and MC1568 on macrophage phenotype induced by LPS（

1）P＜0.05 vs LPS group.

ItemLPS groupLPS+VPA groupLPS+Apicidin groupLPS+MC1568 group M1 makers CD16mRNA1.34±0.100.57±0.221）0.62±0.241）0.51±0.131）iNOSmRNA2.12±0.190.3±0.051）1.4±0.171）0.57±0.121）TNF-α protein25 058.89±993.4221 271.31±640.791）7 927.11±177.721）19 388.73±557.421）NOS2 protein79.4±5.0166.97±2.061）56.37±2.241）55.4±4.991）M2 makers CD206mRNA1.91±0.540.73±0.122.55±0.740.92±0.07 ARG-1mRNA0.96±0.170.63±0.160.81±0.079.39±1.901）IL-10 protein336.70±7.25351.50±8.381）58.70±1.531）2 116.20±129.571）ARG-1 protein23.33±0.3212.09±4.071）11.86±1.411）18.77±7.35

3 討論

3.1 PQ和LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性的異同點(diǎn)

本研究發(fā)現(xiàn)PQ和LPS對M1型表型標(biāo)志物的作用是相似的，但對M2型標(biāo)志物的作用不完全一致，提示PQ和LPS均具有促炎活性，但是具體作用機(jī)制可能有差異。當(dāng)病原體感染宿主時(shí)，宿主通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、Nod樣受體（Nodlike receptor，NLR）及RIG樣受體（RIG-like receptor，RLR）等膜結(jié)合或跨膜模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），識別病原體的LPS等病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），激活胞內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)損傷作用于機(jī)體時(shí)，機(jī)體通過PRR識別損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。PAMP和DAMP共享許多PRR，如TLR4和跨膜受體（TLR3、TLR7-9、NLR及RLR）等，提示感染和損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)存在相似之處［9］。本研究發(fā)現(xiàn)的PQ和LPS均可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)這一現(xiàn)象驗(yàn)證了上述理論。

3.2 VPA主要通過抑制HDACⅠ類抑制PQ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性

本研究發(fā)現(xiàn)Apicidin對PQ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎活性的抑制效應(yīng)強(qiáng)于VPA，而VPA強(qiáng)于MC1568，因此VPA的作用主要是通過抑制HDACⅠ類實(shí)現(xiàn)的。KOCHANEK等［10］發(fā)現(xiàn)VPA減輕出血性休克動(dòng)物肺組織炎癥反應(yīng)，HU等［11］發(fā)現(xiàn)VPA改善燒傷性休克動(dòng)物的生存率，減少促炎因子水平。而SILLESEN等［12］在創(chuàng)傷患者的研究中發(fā)現(xiàn)HDACⅠ類（HDAC1、HDAC3）水平的升高與不良預(yù)后相關(guān)，CURTIS等［13］在鼠燒傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)HDACⅠ類（HDAC1）水平的升高與燒傷后肺炎相關(guān)，可見HDACⅠ類與損傷導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)相關(guān)。本研究也提示抑制HDACⅠ類減少PQ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性。

3.3 VPA主要是通過抑制HDACⅡa類來抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性

本研究發(fā)現(xiàn)VPA和MC1568抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎活性的作用均強(qiáng)于Apicidin，提示VPA的作用主要是通過抑制HDACⅡa類實(shí)現(xiàn)的。有研究［14］表明VPA調(diào)節(jié)TLR受體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，減少膿毒癥大鼠模型中組織損傷的標(biāo)志物、TNF-α、MPO［3，15］，也有研究發(fā)現(xiàn)VPA抑制LPS作用巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究首次提出VPA對膿毒癥的治療作用可能是通過抑制HDACⅡa類發(fā)揮的。

綜上所述，本研究提示VPA不僅能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎活性，還能抑制PQ誘導(dǎo)的促炎活性，但是對二者的作用機(jī)制略有不同，可能是通過不同的HDAC亞型發(fā)揮的作用。進(jìn)一步在動(dòng)物模型中驗(yàn)證VPA的治療作用及機(jī)制，可能為探索新的急性PQ中毒和膿毒癥治療策略提供理論基礎(chǔ)。

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（編輯 武玉欣）

The Effects of Valproic Acid on Macrophage Polarization Induced by Paraquat or Lipopolysaccharide

ZENG Renqing1，WU Xizi1，ZHAO Yangzi1，DENG Yunlei2，YU Shiyuan3，LI Huiyi1，LIU Chang1，F(xiàn)AN Chenling4，WANG Hong4，CHONG Wei1

（1.Department of Emergency Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001 China；2.Department of Nephrology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001 China；3.Department of Neurosurgery，Sun Yat-Sen University Cancer Center，Guangzhou 510080，China；4.Department of Endocrinology and Metabolism，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To analyze the effects of valproic acid（VPA），a histone deacetylase（HDAC）inhibitor，on macrophage polarization induced by paraquat（PQ）or lipopolysaccharide（LPS）.MethodsMouse RAW264.7 cells were cultured at 37℃with 5%CO2，passaged，and then given one of the following treatments:（1）PQ；（2）PQ+VPA（classⅠandⅡa HDAC inhibitor）；（3）PQ+apicidin（classⅠHDAC inhibitor）；（4）PQ+MC1568（classⅡa HDAC inhibitor）；（5）LPS；（6）LPS+VPA；（7）LPS+apicidin；（8）LPS+MC1568.The cells and culture supernatants were harvested after 8 h of treatment.RT-PCR，ELISA，and flow cytometry were conducted to assess the expression levels of macrophage phenotypic markers.ResultsBoth PQ and LPS skewed the macrophage functional polarity toward proinflammatory phenotype.VPA，apicidin，and MC1568 all inhibited PQ-and LPS-induced macrophages polarizing toward pro-inflammatory phenotype，but the inhibitory effects were different in some ways.ConclusionVPA inhibits the proinflammatory function of macrophages induced by PQ and LPS，but the effect of VPA on PQ-and LPS-induced macrophages has its own characteristics.

paraquat；lipopolysaccharide；valproic acid；macrophage；phenotypic polarization

R459.7

A

0258-4646（2017）06-0548-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.016

國家自然科學(xué)基金（81372970）

曾仁慶（1989-），女，碩士研究生.

崇巍，E-mail：chongweixiena@126.com.

2016-09-23

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