淺析耐頭孢西丁腸桿菌科細菌AmpC酶的檢測及耐藥性

李娟　鄧秋連　龍燕　黃鈺君　尚彥彥　席紅利

【摘要】 目的：研究并探討耐頭孢西丁腸桿菌科細菌AmpC酶的檢測及耐藥性。方法：收集2014年1月-2016年12月本院分離得到的耐頭孢西丁腸桿菌科細菌300株作為研究對象，對這300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌采用氯唑西林增效試驗法測定其中的AmpC酶，采用雙紙片確診試驗測定其中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶，再選用12種常用抗生素作為藥敏試驗藥物，對其耐藥性進行檢測，比較單產(chǎn)AmpC酶組與非產(chǎn)酶組對12種常用抗生素的耐藥性。結(jié)果：300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中共檢出單產(chǎn)AmpC酶菌85株，占比28.33%。在頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組的耐藥性均明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05）；在頭孢唑林、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均超過50%，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在頭孢吡肟、頭孢哌酮鈉舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均不足50%，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中，5重以上耐藥菌株共有130株，占比43.33%，單產(chǎn)AmpC酶組的5重以上耐藥菌株占比明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05）。結(jié)論：耐頭孢西丁腸桿菌科細菌的AmpC酶單產(chǎn)率較高，單產(chǎn)AmpC酶菌的多重耐藥性較高，臨床上治療由耐頭孢西丁腸桿菌科細菌AmpC酶菌所致感染時，應(yīng)根據(jù)其藥敏檢測結(jié)果，選用耐藥性較低的抗生素進行治療，如亞胺培南、阿米卡星等。

【關(guān)鍵詞】 耐頭孢西丁腸桿菌科細菌； AmpC酶； 耐藥性； 抗生素

Detection and Drug Resistance Analysis of Cefoxitin Resistant Enterobacteriaceae AmpC Enzyme/LI Juan，DENG Qiu-lian，LONG Yan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（14）：050-053

【Abstract】 Objective：To study and explore the detection and drug resistance of Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae AmpC enzyme.Method：A total of 300 strains of Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae from January 2014 to December 2016 in our hospital were obtained and collected as the research object.The AmpC enzyme of them were detected by Cloxacillin potentiated test method，the ESBLs of them were confirmed by double disk test.12 kinds of commonly used antibiotics were choosed as drug susceptibility test to detect the drug resistance，and drug resistance of 12 kinds of commonly used antibiotics of yield AmpC enzyme group and non enzyme group were compared.Result：In 300 strains of Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae，85 strains of yield AmpC enzyme bacteria were detected，accounting for 28.33%.In Ceftriaxone，Aztreonam，Piperacillin，Piperacillin Sulbactam，drug resistance of yield AmpC enzyme group were significantly higher than those of non Enzyme group（P<0.05）.In Cefazolin，Ciprofloxacin，ampicillin，Ampicillin Sulbactam，drug resistance of two groups were both more than 50%，but two groups had no significant difference（P>0.05）.In Cefepime，Cefoperazone Sulbactam，Amikacin，Imipenem，drug resistance of two groups were both less than 50%，but two groups had no significant differences（P>0.05）.In 300 strains of Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae，more than 5 weight resistant strains were 130 strains，accounting for 43.33%，and the proportion of more than 5 weight resistant strains of yield AmpC enzyme group was significantly higher than that of non enzyme group（P<0.05）.Conclusion：Yield rate of AmpC enzyme of Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae is higher，multi drug resistant of yield AmpC enzyme strains is also higher.Clinical treatment of infection by Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae AmpC enzyme bacteria should select low resistance to antibiotics，according to the drug sensitivity test results，such as Imipenem，Amikacin.

【Key words】 Cefoxitin resistant Enterobacteriaceae； AmpC enzyme； Drug resistance； Antibiotics

First-authors address：Cancer Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.014

近年來，隨著細菌中β內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，革蘭陰性桿菌中的耐藥菌株增多，導(dǎo)致臨床治療過程中采用β內(nèi)酰胺類抗生素治療革蘭陰性桿菌感染的效果欠佳，尤其是AmpC酶菌，在持續(xù)采用頭孢西丁治療過程中，腸桿菌科細菌AmpC酶的耐藥性逐漸增高，頭孢西丁對腸桿菌科細菌AmpC酶感染的抑菌作用逐漸減弱，因此，有必要針對腸桿菌科細菌AmpC酶感染的耐藥性進行深入研究和分析，為腸桿菌科細菌AmpC酶感染患者選擇合適的抗生素治療[1-3]。目前，臨床上關(guān)于AmpC酶耐藥性的研究報道增多，普遍發(fā)現(xiàn)AmpC酶對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，為證實這一點，且為探討耐頭孢西丁腸桿菌科細菌AmpC酶的檢測及耐藥性，本次研究收集2014年1月-2016年12月本院分離得到的耐頭孢西丁腸桿菌科細菌300株，對其進行AmpC酶檢測和耐藥性分析?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2014年1月-2016年12月本院分離得到的耐頭孢西丁腸桿菌科細菌300株作為研究對象，包括109株大腸埃希菌、128株陰溝腸桿菌、63株產(chǎn)氣腸桿菌。所有菌株均經(jīng)由法國生物梅里公司生產(chǎn)的VITEK2全自動微生物鑒定儀及配套鑒定卡確認，將大腸埃希菌ATCC25922設(shè)為AmpC酶陰性對照，將已知AmpC酶陰溝腸桿菌設(shè)為AmpC酶陽性對照組。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC28753。

1.1.2 抗生素及培養(yǎng)基 抗生素選擇頭孢西丁、頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮鈉舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南。培養(yǎng)基選擇法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的M-H培養(yǎng)基，選擇法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的GNB鑒定卡和GNB藥敏卡。

1.2 方法

1.2.1 AmpC酶檢測 采用紙片擴散法對頭孢西丁紙片進行測定，如抑菌環(huán)直徑不足17 mm，即為頭孢西丁耐藥，將其菌株作為初篩菌株。對耐頭孢西丁腸桿菌科細菌采用氯唑西林增效試驗法測定其中的AmpC酶，采用滅菌純化水與氯唑西林混合成濃度為10 g/L的溶液，采用微量加樣器取氯唑西林20 μL置于藥敏紙片中心，制成氯唑西林復(fù)合片，在超凈臺晾干，再置于零下20 ℃的冰箱中保存。將氯唑西林復(fù)合片與標(biāo)準藥敏紙片同時貼在一塊涂有受檢菌株的M-H培養(yǎng)基上，如氯唑西林復(fù)合片的抑菌環(huán)直徑相比于標(biāo)準藥敏紙片的抑菌環(huán)超過至少5 mm，即為AmpC陽性，反之則為陰性[4]。

1.2.2 超廣譜β內(nèi)酰胺酶檢測 采用雙紙片確診試驗測定其中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶，采用K-B紙片擴散法操作，將含克拉維酸與不含克拉維酸的紙片放置于35 ℃環(huán)境下保存過夜，如含克拉維酸紙片的抑菌環(huán)直徑相比于不含克拉維酸紙片的抑菌環(huán)超出至少5 mm，即可判斷為超光譜β內(nèi)酰胺酶陽性，反之則為陰性[5]。

1.2.3 藥敏試驗 藥敏試驗檢測方法為最小抑菌濃度法，檢測結(jié)果的判讀標(biāo)準為美國國家臨床實驗室標(biāo)準委員會于2004年頒布的標(biāo)準。藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準，（1）敏感（S）：高濃度微孔、低濃度微孔均未出現(xiàn)變色，即菌株對該種抗生素敏感；（2）中介（I）：高濃度微孔未出現(xiàn)變色，低濃度微孔變紅，即菌株對該種抗生素中介敏感；（3）耐藥（R）：高濃度微孔、低濃度微孔均變紅，即菌株對該種抗生素耐藥[6]。

1.3 觀察指標(biāo) 比較單產(chǎn)AmpC酶組與非產(chǎn)酶組對12種常用抗生素的耐藥性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中單產(chǎn)AmpC酶的檢出情況 300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中共檢出單產(chǎn)AmpC酶菌85株、單產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶菌81株、雙產(chǎn)酶菌59株，其余75株為非產(chǎn)酶菌，其中，單產(chǎn)AmpC酶菌占比28.33%。

2.2 單產(chǎn)AmpC酶菌與非產(chǎn)酶菌的藥敏結(jié)果比較 為避免超廣譜β內(nèi)酰胺酶對藥敏結(jié)果產(chǎn)生干擾，本次研究僅對單產(chǎn)AmpC酶菌與非產(chǎn)酶菌的藥敏結(jié)果進行比較。在頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組的耐藥性均明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05）；在頭孢唑林、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均超過50%，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在頭孢吡肟、頭孢哌酮鈉舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均不足50%，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 單產(chǎn)AmpC酶菌與非產(chǎn)酶菌5重以上耐藥情況比較 300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中，5重以上耐藥菌株共有130株，占比43.33%，單產(chǎn)AmpC酶組的5重以上耐藥菌株占比明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05），見表2。

3 討論

AmpC酶的全稱為“AmpCβ內(nèi)酰胺酶”，是一種由腸桿菌科細菌、綠膿假單胞菌、質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶，屬于β內(nèi)酰胺酶的一種，在β內(nèi)酰胺酶中按照分子結(jié)構(gòu)分類法被歸為“C類”，按照功能分類法被歸為“第一群”，是一種可作用于頭孢菌素且不受到克拉維素抑菌作用的β內(nèi)酰胺酶，又被稱為“頭孢菌素酶”[7-11]。含有AmpC酶的菌株可對頭孢菌素類抗生素、單酰胺類抗生素進行水解，且不受到β內(nèi)酰胺酶抑制劑的影響，因此，AmpC酶菌引起的感染治療難度較大。因此，臨床上應(yīng)對AmpC酶的耐藥性進行深入分析，研究AmpC酶對各類抗生素的藥物敏感性，以尋求對AmpC酶可有效抑制的抗生素[12-13]。

現(xiàn)階段，AmpC酶的檢測主要是利用AmpC酶水解頭孢西丁原理，即含有AmpC酶的菌株對頭孢西丁不敏感，而超廣譜β內(nèi)酰胺酶等其他β內(nèi)酰胺酶對頭孢西丁無法進行分解，即其對頭孢西丁較為敏感，臨床上利用這點，常采用頭孢西丁紙片對AmpC酶菌株進行初篩，但臨床實際工作中，紙片擴散法對AmpC酶的檢測步驟較多[14-18]。本次研究中采用雙紙片氯唑西林增效試驗對AmpC酶進行檢測，檢測后發(fā)現(xiàn)，300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中共檢出單產(chǎn)AmpC酶菌85株，占比28.33%，說明耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中含有AmpC酶的概率較高。本次研究還發(fā)現(xiàn)，300株耐頭孢西丁腸桿菌科細菌中共有5重以上耐藥菌株130株，占比43.33%，單產(chǎn)AmpC酶組的5重以上耐藥菌株占比明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05），進一步說明AmpC酶菌感染的治療難度較大，對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，臨床治療時應(yīng)嚴格把握AmpC酶菌對抗生素的耐藥性。

本次研究為探討AmpC酶對各類抗生素的耐藥性，對單產(chǎn)AmpC酶菌與非產(chǎn)酶菌的藥敏結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)在頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組的耐藥性均明顯高于非產(chǎn)酶組（P<0.05），這提示我們在治療腸桿菌科細菌AmpC酶感染時，應(yīng)謹慎選擇頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦；在頭孢唑林、環(huán)丙沙星、氨芐西林、氨芐西林舒巴坦中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均超過50%，而在頭孢吡肟、頭孢哌酮鈉舒巴坦、阿米卡星、亞胺培南中，單產(chǎn)AmpC酶組和非產(chǎn)酶組的耐藥性均不足50%，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），這提示在治療腸桿菌科細菌AmpC酶感染時，應(yīng)避免使用頭孢唑林等耐藥性較高的藥物，而盡可能選用藥物敏感性較高的亞胺培南、阿米卡星等藥物，尤其是亞胺培南，AmpC酶對其基本不耐藥，可作為腸桿菌科細菌AmpC酶感染治療時的首選抗生素[19-20]。

綜上所述，耐頭孢西丁腸桿菌科細菌的AmpC酶單產(chǎn)率較高，單產(chǎn)AmpC酶菌的多重耐藥性較高，臨床上治療由耐頭孢西丁腸桿菌科細菌AmpC酶菌所致感染時，應(yīng)根據(jù)其藥敏檢測結(jié)果，選用耐藥性較低的抗生素進行治療，如亞胺培南、阿米卡星等。

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（收稿日期：2017-03-27） （本文編輯：程旭然）