鐮刀菌毒素對全價日糧發(fā)酵淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響

周敏，李會榮，李祥明，楊在賓，楊維仁，張桂國，姜淑貞*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省飼料質(zhì)量檢驗所，山東濟南250022）

飼料衛(wèi)生

鐮刀菌毒素對全價日糧發(fā)酵淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響

周敏1，李會榮2，李祥明2，楊在賓1，楊維仁1，張桂國1，姜淑貞1*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省飼料質(zhì)量檢驗所，山東濟南250022）

本試驗以鐮刀菌毒素為研究對象，研究鐮刀菌毒素對全價日糧發(fā)酵淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響。試驗分為3個處理，對照組為基礎(chǔ)日糧，試驗1組（25M yco.）和2組（50M yco.）分別用25%和50%含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉。采用復(fù)合菌種對全價日糧進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵開始前所有處理日糧水分調(diào)節(jié)至50%。試驗結(jié)果表明：（1）本試驗條件下，日糧的淀粉含量隨發(fā)酵時間呈線性下降（P＜0.05），日糧的丁酸、乙酸含量隨發(fā)酵時間呈先線性上升（P＜0.05），而后下降；（2）日糧（0 d）的淀粉和乙酸含量隨著鐮刀菌毒素水平的提高顯著降低（P＜0.05）；（3）發(fā)酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各處理組差異不顯著（P＞0.05）。由此說明，鐮刀菌毒素及其水平可顯著影響全價日糧發(fā)酵的淀粉、丁酸和乙酸水平。

鐮刀菌毒素；發(fā)酵產(chǎn)物；淀粉；乙酸；丁酸

鐮刀菌毒素是一些霉菌在谷類作物或者飼料加工過程中滋生繁殖、分泌產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物（彭杰等，2009）。在自然界中分布極為廣泛，每年全世界受霉菌污染的原料損失量占總損失量的比例最高（孫飛等2014）。在我國，越來越多的作物原料、飼料產(chǎn)品遭受霉菌的污染甚至是重度污染（王金勇，2012）。鐮刀菌可侵染多種禾谷類作物，能引起作物出現(xiàn)根腐、萎蔫、穗腐等多種腐爛病，不僅能夠?qū)е罗r(nóng)作物減產(chǎn)，而且降低谷類作物品質(zhì)和食用價值。此外，鐮刀菌產(chǎn)生的多種毒素能使人畜中毒，霉變的作物對人類和動物的健康造成嚴重威脅（肖湘等，2012；伍慶斌，2011）。隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，微生物發(fā)酵飼料已在全世界廣泛應(yīng)用（王秀，2010）。因物理、化學(xué)方法具有降解成效不穩(wěn)定、營養(yǎng)物質(zhì)流失和影響動物飼料適口性等缺點，生物降解以其降解程度高、無污染等優(yōu)點備受關(guān)注和研究（喬霞等，2014；計成，2012；陸文清等2008）。Gourama等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，通過嗜酸乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌和植物乳酸桿菌等多種乳酸桿菌共同發(fā)酵可以抑制寄生曲霉孢子的產(chǎn)生；葉丙奎等（2009）研究證明，飼喂固態(tài)發(fā)酵日糧可以提高育肥豬的采食量和日增重；余淼等（2013）研究證明，肉牛食用微生物發(fā)酵的飼料，有效改善了消化吸收功能且提高了免疫力。國內(nèi)外有關(guān)發(fā)酵研究主要集中在發(fā)酵可改善常規(guī)飼料和原料的營養(yǎng)價值、降解原料中的抗營養(yǎng)因子，而鐮刀菌毒素對發(fā)酵參數(shù)的研究還鮮有報道。本試驗旨在研究復(fù)合菌種發(fā)酵對鐮刀菌毒素日糧淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響，為生產(chǎn)中霉變飼料的處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料發(fā)酵菌種：乳酸菌（Lactobacillus），5×109cfu/g；酵母菌（Yeast），4.6×109cfu/g，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），1.9×1010cfu/g；北京科為博生物科技有限公司提供。

鐮刀菌毒素原料選擇：本課題組于2014年6月至12月相繼從山東省13個飼料廠和12個養(yǎng)殖場抽檢飼料原料樣品共計135個，檢測其霉菌毒素含量，調(diào)查霉菌毒素污染狀況。從中選擇毒素水平低于檢測限的原料配制對照日糧，選擇含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉配制試驗日糧。

1.2 試驗設(shè)計試驗分3個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)18桶。對照組為基礎(chǔ)日糧，試驗1組（25Myco.）和試驗2組（50Myco.）分別用25%和50%的含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉，使50%鐮刀菌素日糧的玉米赤霉烯酮含量剛剛超過我國仔豬小于500mg/kg的限量標準（GB 13078.2-2006）。

1.3 試驗日糧斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧是參考美國NRC（1998）營養(yǎng)需要來配制的，用已知鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉配制成含有100%鐮刀菌毒素日糧，隨后用100%鐮刀菌素日糧和對照日糧按照1∶3比例配制成25Myco.日糧，用100%的鐮刀菌素日糧和對照日糧按照1∶1比例配制成50Myco.日糧。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品的制備與采集發(fā)酵試驗開始前將一定比例發(fā)酵菌種（乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌分別為6.33×106cfu/g、1.05×106cfu/g和8.94×106cfu/g）配制成水溶液，均勻噴灑在所有試驗日糧中，然后噴灑蒸餾水，調(diào)節(jié)水分含量至50%，攪拌均勻，裝入塑料桶（50±0.36 kg），密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度為16~18°C。

日糧密封前采樣作為第0天的樣品，然后分別于日糧發(fā)酵的第3、6、9、12、15、18天采集樣品，每個重復(fù)隨機選擇3桶，采樣完畢棄去。采樣方法：距離桶邊約20 cm做一個圓，在圓上劃一個“十”字，“十”字與圓的4個交點和圓心作為取樣點；分別在距離發(fā)酵桶上表面約20 cm處、桶底約20 cm處和桶的中央采樣，每個采樣點采樣約500 g，然后將每個桶的上、中、下15個點的樣品混合，立即進行感官評價。按照四分法縮樣，最后將樣品平均分成2份（每份約500 g），一份置于60℃烘箱中制成風(fēng)干樣，粉碎用于測定DM、CP、Ca、P常規(guī)營養(yǎng)成分和毒素含量（張麗英，2003），另一份置于-20℃保存，用于淀粉和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量測定。

1.4.2 樣品測定

1.4.2.1 毒素測定采用免疫親和柱層析凈化，以液相色譜法熒光檢測器測定玉米赤霉烯酮的含量，外標法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定伏馬毒素B1和嘔吐毒素的含量，外標法定量。玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、T-2毒素和嘔吐毒素的最低檢測限為分別為0.1 mg/kg、1.0μg/kg、0.5μg/kg、0.25 mg/kg、0.02μg/kg和0.1mg/kg。

1.4.2.2 淀粉的測定采用蒽酮比色法測定日糧淀粉含量。（1）試劑的配制。試劑一：80%乙醇溶液；試劑二：52%高氯酸溶液；蒽酮-硫酸試劑：準確稱取0.4 g蒽酮溶于100mL 88%硫酸溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配。（2）淀粉標準液及標準曲線繪制。淀粉標準液：準確稱取200mg淀粉于燒杯中，加入5mL蒸餾水和65mL試劑二，攪拌溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，此淀粉溶液濃度為2 mg/mL；移取上述溶液10 mL于250 mL容量瓶中，蒸餾水定容，作為淀粉標準溶液，此淀粉標準溶液的濃度為80μg/mL。

標準曲線：分別移取換算成淀粉含量分別為0、10、20、40、60、80μg標準液于試管中，加蒸餾水使各試管中溶液均為2mL，冰水浴中冷卻2min，加入6 mL蒽酮-硫酸試劑，搖勻，再在冰水浴中冷卻2 min。隨后將試管放入沸水浴中5 min，冷卻至室溫。用0μg淀粉作為空白參比，用分光光度計，于640 nm波長下比色，測定吸光度，以吸光度為橫坐標，淀粉濃度作為縱坐標，繪制標準曲線。

步驟：①準確稱取2.5 g發(fā)酵飼料樣品于50mL離心管中；②滴加2滴試劑一濕潤樣品，再加入5 mL蒸餾水搖勻，加入25 mL熱的試劑一，漩渦振蕩器搖勻，靜置5 min；③在2 500 r/min離心5 min，棄除上清液；④加入30mL試劑一和5mL水于殘渣中，搖勻后靜置5 min，2500 r/min離心5 min，棄除上清液；⑤加入30 mL試劑二和5 mL水于殘渣中，攪拌混合10 min，以2500 r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中作為提取液；⑥再加入35 mL試劑二和5 mL水于殘渣中，攪拌混合10 min，以2500 r/min離心10 min，上清液與⑤中提取液合并，以蒸餾水定容；⑦定量濾紙過濾提取液于干凈錐形瓶中，移取10 mL濾液于250mL容量瓶中，蒸餾水定容；⑧?、咧械矸厶崛∫? mL于試管中，冷水浴2 min，然后加入6mL蒽酮-硫酸試劑，旋窩振蕩器上充分混勻。再冷水浴2 min，沸水浴5 min，此時各試管中溶液呈藍綠色，冷去至室溫，用分光光度計，于640 nm波長下進行比色，測定吸光度。

計算公式：淀粉/%＝G/M×100；

式中：G為由飼料樣品提取液測定的吸光度，由標準曲線回歸公式計算出來的淀粉毫克數(shù)；M為飼料樣品的質(zhì)量。

1.4.2.3 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定樣品中VFA含量是采用氣相色譜法（美國安捷倫Agilent Technotogies 7890A）測定的。

樣品處理：稱取3 g發(fā)酵飼料樣品，加入10mL 20%偏磷酸溶液，置于振蕩器上振蕩1.5 h，然后通過有機濾膜（水系，0.22μm）3層，存入1.5mL離心管中，放在4℃冰箱中待測。

色譜參數(shù)：采用程序升溫法，初始溫度為110℃，以10℃/min升溫至150℃，保持5min。檢測器參數(shù)：FID溫度為230℃，H2流量40mL/min，空氣流量450mL/min，尾吹流量45mL/min。進樣口參數(shù)：溫度200℃，載氣高純氮氣，分流比為20∶1，進樣量為1μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計，用單因素方差進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s進行多重比較。其中不同發(fā)酵時期理化指標變化采用Excel進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌毒素對全價飼料發(fā)酵淀粉含量的影響由圖1可知，發(fā)酵初始（0 d）對照組淀粉含量顯著高于25%鐮刀菌素組和50%鐮刀菌素組（P＜0.05），25%毒素組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵的進行，各處理組不同時間點淀粉水平差異不顯著（P＞0.05）。各處理組日糧淀粉隨發(fā)酵時間的延長均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。結(jié)果表明，對照組、25%毒素組和50%毒素組均在發(fā)酵15 d時達到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵淀粉隨時間的斜率逐漸增大（表2），但3個處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 飼糧淀粉隨時間變化的折線圖

表2 淀粉的普通截距多元線性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.2 鐮刀菌毒素對全價飼料發(fā)酵乙酸含量的影響由圖2可知，毒素水平顯著影響發(fā)酵0、3、6、9 d和12 d的乙酸水平（P＜0.05）。對照組（發(fā)酵第0天和3天）乙酸含量顯著高于25%毒素組（P＜0.05），25%毒素組又顯著高于50%毒素組（P＜0.05）；對照組（發(fā)酵第9天和12天）乙酸含量顯著高于25%毒素組和50%毒素組（P＜0.05），而25%毒素組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）。日糧乙酸含量隨發(fā)酵時間呈線性升高（P＜0.05），而后呈現(xiàn)下降趨勢。分析表明，25%毒素組和50%毒素組在發(fā)酵12 d時就達到穩(wěn)定狀態(tài)，而對照組在發(fā)酵15 d時達到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵乙酸隨時間的斜率先減小后增大（表3），但3個處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 飼糧乙酸隨時間變化的折線圖

表3 乙酸的普通截距多元線性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.3 鐮刀菌毒素對全價飼料發(fā)酵丁酸含量的影響由圖3可知，毒素水平顯著影響發(fā)酵6、9、12 d的丁酸水平（P＜0.05）。發(fā)酵第6天時，25%毒素組和50%毒素組丁酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），而25%和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）；第9天時，25%毒素組丁酸含量顯著高于對照組和50%毒素組（P＜0.05），而對照組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）；第12天時，25%毒素組顯著高于50%毒素組（P＜0.05）。日糧中丁酸隨發(fā)酵時間呈線性上升（P＜0.05），而后下降至穩(wěn)定。分析表明，對照組和25%毒素組在發(fā)酵15 d時就達到穩(wěn)定狀態(tài)，而50%毒素組在發(fā)酵12 d時達到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵丁酸隨時間的斜率先減小后增大（表4），但三個處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 日糧丁酸隨時間變化的折線圖

表4 丁酸的普通截距多元線性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

3 討論

3.1 鐮刀菌毒素對全價飼料發(fā)酵淀粉的影響淀粉是影響畜禽生長性能的重要指標之一（王海東等，2008）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌均能夠利用碳水化合物發(fā)酵糖類（李永凱等，2009）。黃治國等（2012）跟蹤白酒生產(chǎn)整個發(fā)酵期并對采集酒醅樣品進行測定發(fā)現(xiàn)，淀粉消耗量比較大，并且呈現(xiàn)迅速下降趨勢，在本試驗發(fā)酵過程中，淀粉也表現(xiàn)出隨時間迅速降低的趨勢。霉菌在生長繁殖過程中分泌的酶也會分解和消耗飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)（史瑩華等，2006）。因此，25%毒素組和50%毒素組的淀粉含量低于對照組。

3.2 鐮刀菌毒素對全價飼料發(fā)酵VFA的影響Cohen等（1984）和Ren等（1997）研究表明，可溶性碳水化合物的發(fā)酵以丁酸型發(fā)酵為主，終產(chǎn)物主要為丁酸、乙酸及少量的丙酸，產(chǎn)丁酸菌同時會受到發(fā)酵終產(chǎn)物的抑制（艾斌凌，2014）。因此，丁酸出現(xiàn)先升后降的趨勢。發(fā)酵初始階段以產(chǎn)乙酸菌為主，乙酸的產(chǎn)生速率大于消耗速率，出現(xiàn)乙酸增加，后期由于產(chǎn)甲烷菌活性的加大，乙酸的消耗速率大于產(chǎn)生速率，因此乙酸呈下降趨勢（Zhao等，2008）。陳斌等（2015）在研究玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，乙酸產(chǎn)生也呈先增后降的趨勢。本試驗中乙酸、丁酸含量也有相同的規(guī)律。本研究中毒素處理組乙酸水平低可能與處理組淀粉含量低于對照組有關(guān)，但是毒素對VFA的影響機理尚需進一步證明。

4 結(jié)論

4.1 本試驗條件下，日糧中淀粉含量隨著發(fā)酵時間呈線性下降，丁酸和乙酸含量隨著發(fā)酵時間呈先升高后下降趨勢，但是不同處理的線性斜率差異不顯著。

4.2 日糧（0 d）的淀粉和乙酸含量隨著鐮刀菌毒素水平的提高顯著降低。

4.3 發(fā)酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各處理組間差異不顯著。

[1]艾斌凌.基于混合菌群的水稻秸稈丁酸發(fā)酵過程優(yōu)化與機制研究：[博士學(xué)位論文][D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2014.

[2]陳斌，楊天學(xué)，耿向永，魏自民，席北斗，趙越，李雪.玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵乙酸產(chǎn)生規(guī)律及其對發(fā)酵的影響[J].環(huán)境科學(xué)研究，2015，28（4）：647～652.

[3]黃治國，侯海波，羅惠波，等.濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中淀粉和還原糖的變化規(guī)律研究[J].中國釀造，2012，31（7）：107～110.

[4]計成.飼料中霉菌毒素生物降解的研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（1）：153～158.

[5]陸文清，胡起源.微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應(yīng)用[J].飼料與畜牧：新飼料，2008，7：5～9.

[6]李永凱，毛勝勇，朱偉云.益生菌發(fā)酵飼料研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].畜牧與獸醫(yī)，2009，3：90～93.

[7]彭杰，吳曉鵬，黃惠琴，等.鐮刀菌毒素研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，2：25～27.

[8]喬霞，杜軍，周學(xué)章.霉菌毒素降解劑的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（1）：108～112.

[9]孫飛，方熱軍.飼料中霉菌毒素的研究進展[J].湖南飼料，2014，2：34～37.

[10]史瑩華，王成章，孫宇，等.飼料中霉菌毒素的危害及其控制[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，40（6）：683～686.

[11]王海東，董致遠，呂小文，等.顆粒飼料淀粉糊化度的快速檢測方法[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（12）：249～253.

[12]王金勇.2011年全球霉菌毒素調(diào)查報告[J].國際資訊，2012，48（14）：49～52. [13]伍慶斌.霉菌毒素是養(yǎng)雞業(yè)的隱性殺手[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2011，8：11～12.

[14]王秀.發(fā)酵飼料在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用與研究進展[J].江西飼料，2010.1. [15]肖湘，李文平.霉菌毒素的毒性作用及對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害研究進展[J].湖南飼料，2012，1：25～27.

[16]葉丙奎，李青旺，謝偉華，等.混合固態(tài)發(fā)酵對生長育肥豬生產(chǎn)性能的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，18（5）：22～26.

[17]余淼，嚴錦繡，彭忠利，等.微生物發(fā)酵飼料對肉牛免疫機能的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（4）：114～117.

[18]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局國家標準化管理委員會.飼料中儲曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量（GB 13078.2-2006）.中華人民共和國國家標準，2006.

[19]張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M].北京：中國標準出版物，2006.

[20]Cohen A，Van Gemert，JM，Zoetemeyer R J，et al.Main characteristics and stoich iometric aspects of acidogenesis of soluble carbohydrate containing waste water[J].Process Biochem.，1984，19：228.

[21]Gourama H，Bullerman L B.Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus：Aflatoxigenic fungiof concern in foodsand feeds：A review[J].Journal of Food Protection誖，1995，58（12）：1395～1404

[22]Ren N，Chen X L，Zhao D.Control of fermentation types in continuous-flow acidogenic reactor[J].Biotechnology&Bioengineering，1997，54（5）：428.

[23]Zhao Q B，Yu H Q.Fermentative H2production in an upflow anaerobic sludge blanket reactor at various pH values[J].Bioresource technology，2008，99（5）：1353～1358.

This experimentwas conducted to study the effects of fusarium toxin on fermentation parameters of starchand and volatile fatty acid of compound feed.The experiment was divided into 3 treatments，the control group was the basal diet，the testgroup 1（25Myco.）and 2（50Myco.）were the basal diet that corn and corn glutenmealwere replaced by 25%or 50%fusarium toxin contaminated-corn and contaminated-corn gluten meal，respectively.The results showed as follows：（1）The dietary starch decreased significantly along with the fermentation time（P＜0.05），and acetic acid and butyric acid were increased first and then decreased（P＜0.05）；（2）The starch and acetic acid of diet（0 d）decreased significantly with the elevated levels of fusarium toxins（P＜0.05）；（3）The starch，acetic acid and butyric acid parameters at the end of fermentation（18 d）had no difference among three treatments（P＞0.05）.Under the experimental conditions，the fermentation products of starch，acetic acid，and butyric acid of the compound feed were significantly affected by fusarium toxin and its levels.

fusarium toxin；fermentation products；starch；acetic acid；butyric acid

S816.3

A

1004-3314（2017）06-0030-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170607

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬項目（SDAIT-08-04）；山東省財政廳農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項目

*通訊作者