牛奶中氨基糖苷類藥物殘留膠體金免疫層析技術(shù)研究

武晉孝，王成

（山西省飼料獸藥監(jiān)察所，山西太原030027）

檢測分析

牛奶中氨基糖苷類藥物殘留膠體金免疫層析技術(shù)研究

武晉孝，王成

（山西省飼料獸藥監(jiān)察所，山西太原030027）

為建立可同時(shí)檢測牛奶中6種氨基糖苷類藥物殘留的膠體金免疫層析技術(shù)，本研究采用棋盤法篩選膠體金顆粒標(biāo)記鏈霉素、慶大霉素及卡那霉素抗體的最佳pH值和最適抗體用量，將3種標(biāo)記好的金標(biāo)抗體按一定的比例混合凍干。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該多殘留膠體金免疫試紙條對牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、小諾霉素、卡那霉素和妥布霉素的cut-off值分別為50、50、20、20、50、50 ng/m L。牛奶樣本無需前處理，同步檢測這6種藥物的時(shí)間在10m in以內(nèi)。采用膠體金方法檢測100份從全國不同區(qū)域采集的原奶樣品，并用高效液相色譜（HPLC）方法進(jìn)行鑒定，兩種方法的檢測結(jié)果基本一致，說明建立的膠體金免疫層析方法準(zhǔn)確性高，可靠性好。

氨基糖苷類；鏈霉素；慶大霉素；卡那霉素；膠體金；牛奶

氨基糖苷類藥物（AGs）主要包括鏈霉素（STR）、雙氫鏈霉素（DHS）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、新霉素（NEO）和大觀霉素（SPE）等，具有抗菌譜廣、使用方便和價(jià)格低廉等優(yōu)勢，臨床上主要用于革蘭氏陰性菌所引起的感染（Li等，2009）。AGs最常見的不良反應(yīng)為耳毒性和腎毒性（宋飚，2014）。研究表明，長期高劑量接觸此類抗生素可引起動(dòng)物的蓄積毒性，并通過食物鏈對人類健康產(chǎn)生潛在的危害（高月等，2016）。因此，研究和制定出一套動(dòng)物源性食品中AGs簡單、快速、靈敏且可靠的殘留快速檢測方法對完善我國的食品安全監(jiān)測體系具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外用于動(dòng)物性食品中AGs殘留檢測的方法主要有微生物法（Grasmick等，1982）、薄層色譜法（Bhushan和Arora，2001）、毛細(xì)管電泳法（Lin等，2008）、免疫分析法（Jin等，2005；Loomans等，2003；Verheijen等，2000）和HPLC（趙靜等，2015；錢疆等，2011；楊慧元等，2011；劉曉茂等，2008）等。目前，儀器方法的應(yīng)用檢測較多。儀器方法具有靈敏度高、特異性好、抗干擾性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但儀器方法成本高、前處理繁瑣、且對操作人員有專業(yè)性要求，不適合現(xiàn)場大批量樣本的快速篩選。膠體金免疫層析技術(shù)因具備前處理簡單、操作人員無專業(yè)要求、檢測結(jié)果可快速獲得等優(yōu)勢，在動(dòng)物源性食品安全檢測領(lǐng)域備受青睞，近年來，更是向多殘留、高通量、高靈敏度及定量檢測方向發(fā)展。本研究的目的是為建立同時(shí)檢測牛奶中6種常用的AGs多殘留膠體金免疫層析方法，為動(dòng)物性食品中AGs殘留檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素抗原、抗體均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥理與毒理實(shí)驗(yàn)室提供。鏈霉素（STR）、雙氫鏈霉素（DHS）、慶大霉素（GEN）、小諾霉素（MIC）、卡那霉素（KAN）、妥布霉素（TOB）、新霉素（NEO）、大觀霉素（SPE）、阿米卡星（AMI）均購自中國獸藥監(jiān)察所。牛血清白蛋白（BSA）、氯金酸、Tween-20、檸檬酸三鈉、海藻糖、碳酸鉀等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硝酸纖維素膜（NC膜），美國Millipore公司。吸水紙、PVC底板、濾血膜等購自上海金標(biāo)公司。

智能磁力攪拌電熱套（ZNCL-TS），河南百澤儀器有限公司；磁力攪拌器（IKA誖RCT basic），德國IKA集團(tuán)；純水設(shè)備，美國Millipore公司；高速冷凍離心機(jī)（Lynx 4000），德國Thermo Fisher Scientific公司；電子分析天平，天津德安特傳感技術(shù)有限公司；XYZ 3060劃膜儀，美國BioDot公司；斬切機(jī)ZQ2000、裁條機(jī)CT300，上海金標(biāo)生物科技有限公司；凍干機(jī)，美國Millrock公司。

1.2 金標(biāo)抗體的制備本研究采用方陣法確定膠體金標(biāo)記STR、GEN和KAN抗體的最佳pH值和最適抗體用量（Li等，2015）。膠體金顆粒（40 nm）采用檸檬酸三鈉還原法制備（Li等，2015）。將膠體金標(biāo)記STR、GEN和KAN抗體的燒杯分別標(biāo)注為1、2和3號。分別準(zhǔn)確稱量制備好的100 mL膠體金溶液倒入1、2和3號燒杯中，將各燒杯置于磁力攪拌器上，設(shè)置攪拌速度為600 r/min，分別在1、2和3號燒杯中加入2.4、1.6和3.2 mL 0.1 M K2CO3，然后在相應(yīng)燒杯中分別加入40、20、60μg的STR、GEN和KAN抗體（抗體加入之前均用1、2和3號配方稀釋液稀釋至20mL），攪拌20min后，分別加入20%BSA（w/v）溶液各2mL，持續(xù)攪拌10min后，將各金標(biāo)抗體溶液取出分裝，然后4℃，12000 r/min離心20 min，棄掉上清，底部紅色沉淀分別用0.02 M PB（5%海藻糖，0.5%BSA，0.5%吐溫-20，0.03%procline-300，pH 7.4）懸溶至200 mL，超聲充分溶解后，4℃冰箱放置備用。

1.3 金標(biāo)抗體干燥方式的選擇將懸溶好的金標(biāo)STR、GEN和KAN抗體溶液取出，用三合一多殘留膠體金試紙條進(jìn)行調(diào)試，最終確定微孔中加入金標(biāo)STR、GEN和KAN抗體溶液的比例為20μL∶20μL∶15μL，將三種金標(biāo)抗體溶液按上述比例混合，每孔加入混合金標(biāo)抗體溶液為55μL，分別放入凍干機(jī)中冷凍16 h或37℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干16 h后取出，在濕度＜30%的環(huán)境中將干燥好的金標(biāo)抗體微孔放入裝有干燥劑的鋁箔袋中，密封保存待用。

1.4 抗原包被條件的選擇抗原包被濃度：經(jīng)調(diào)試，最終確定STR、GEN和KAN抗原的包被濃度分別為0.2、0.2、0.5mg/mL，將三種抗原用合適的包被液稀釋后，按一定的順序噴涂在NC膜上，37℃干燥16 h，密封保存待用。

抗原包被液：本研究篩選了三種不同配方的抗原包被液，分別為0.02 M PB（pH 7.4）、0.02 M PBS（pH 7.4，0.15 M NaCL）和0.05 M CB（pH 9.6），研究使用不同的包被液對試紙條顯色和靈敏度等的影響。

NC膜：本研究篩選了三種不同爬速的NC膜。分別為MDI 90，Millipore 135和Millipore 180，研究使用不同的NC膜對試紙條跑樣速度、顯色和靈敏度等的影響。

包被位置：本研究是將三個(gè)不同的抗原噴涂在同一個(gè)NC膜上，除質(zhì)控線（C線）固定在最上面之外，三條檢測線（T線）總共有6種位置組合，考察不同的位置組合對試紙條顯色和靈敏度等的影響。

1.5 樣品墊的選擇樣品墊材質(zhì)：本研究篩選了三種不同的樣品墊材質(zhì)，分別為濾血膜（HG-2）和玻璃纖維素膜（SB08和8904），研究使用不同的樣品墊對試紙條層析效果、顯色和靈敏度等的影響。

樣品墊處理液：本研究篩選了四種不同配方的樣品墊處理液，研究使用不同配方處理的樣品墊對試紙條層析效果、顯色和靈敏度等的影響。

1.6 膠體金免疫層析技術(shù)參數(shù)確認(rèn)

1.6.1 cut-off值按照上述確定的最佳條件，將噴涂好STR、GEN和KAN抗原以及羊抗鼠二抗的NC膜，處理好的樣品墊（15 mm）、吸水紙（29 mm）分別組裝在PVC底板上，組裝示意圖見圖1（A）。將組裝好的試紙條切割成4.5mm的成品，放入裝有干燥劑的鋁箔袋中，密封保存待用。

將STR、GEN和KAN工作標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加到牛奶樣本中，其中，STR和KAN的添加濃度分別為0、20、30、40、50、60 ng/mL，GEN的添加濃度分別為0、5、10、15、20、25 ng/mL，分別取添加好的牛奶樣本200μL加入金標(biāo)抗體微孔中，輕輕來回吹打5～6次使金標(biāo)抗體完全溶解，室溫孵育3 min后，將試紙條垂直插入微孔中，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果，檢測結(jié)果見圖1（B），將各T線顯色完全消失的濃度定為試紙條檢測各藥物的cut-off值。

1.6.2 交叉反應(yīng)分別將DHS、MIC、TOB、AMI、NEO和SPE標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白牛奶中配制成不同濃度梯度的樣品：1000、100、50、20、10、0 ng/mL，用試紙條檢測其特異性。

圖1 （A）膠體金試紙條組裝示意圖、（B）檢測結(jié)果示意圖

1.6.3 穩(wěn)定性將三批多殘留試紙條產(chǎn)品放入裝有干燥劑的鋁箔袋中密封保存，同時(shí)進(jìn)行低溫、加速和長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。低溫穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的設(shè)置條件為：4℃冰箱15 d，濕度＞60%，檢測時(shí)間點(diǎn)為第0、7天和第15天。加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的設(shè)置條件為：45℃烘箱15 d，濕度＞60%，檢測時(shí)間點(diǎn)為第0、7天和第15天。長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的設(shè)置條件為：溫度18～24℃，濕度＜30%，檢測時(shí)間點(diǎn)為第0、3、6、9和12個(gè)月。觀察三種條件下試紙條的顯色強(qiáng)度和靈敏度變化。

1.7 實(shí)際樣本檢測從全國不同區(qū)域采集100份原奶樣本，同時(shí)用膠體金方法和HPLC方法進(jìn)行檢測，對比兩種方法的檢測結(jié)果，驗(yàn)證膠體金方法的準(zhǔn)確性與可靠性。HPLC方法是錢疆等（2011）建立的檢測乳制品中9種氨基糖苷類藥物殘留的液相熒光法。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體稀釋液對試紙條顯色和靈敏度的影響本研究篩選了三種不同配方的抗體稀釋液，分別為雙蒸水、0.02 M PB和0.5%BSA，不同抗體稀釋液對抗體用量、試紙條顯色和靈敏度的影響見表1。

由表1可知，抗體稀釋液選擇0.5%BSA時(shí)，三種抗體用量最少，三條檢測線的顯色最好，靈敏度沒有差異，說明抗體稀釋液的pH值、離子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)含量對膠體金標(biāo)記抗體的影響很大，可能與以上三個(gè)因素對抗體活性的影響有關(guān)。

2.2 金標(biāo)抗體干燥方式對試紙條顯色和靈敏度的影響本研究對比了冷凍和熱處理干燥兩種方式對金標(biāo)抗體溶解難易程度、視覺效果、穩(wěn)定性以及試紙條顯色和靈敏度的影響。

由表2可知，兩種不同的干燥方式對試紙條顯色強(qiáng)度和靈敏度短期內(nèi)影響不大，但凍干有利于金標(biāo)抗體的溶解、視覺美感和穩(wěn)定性。冷凍干燥與熱處理干燥相比，具有以下優(yōu)勢：（1）冷凍干燥是在凍結(jié)的狀態(tài)下干燥，體積幾乎不變，蛋白質(zhì)等可保持原來的結(jié)構(gòu)，最大限度保證了生物制劑的活性；（2）冷凍干燥后的物質(zhì)呈海綿狀，疏松多孔，加水后溶解迅速且完全，可立即恢復(fù)原來的性狀；（3）冷凍干燥可排除95%～99%的水分，干燥后的產(chǎn)品可長期保存不至于失活。

2.3 抗原包被液對試紙條顯色和靈敏度的影響三種不同配方包被液對試紙條顯色效果、靈敏度和穩(wěn)定性的影響見表3。

由表3可知，三種抗原用0.05M CB（pH 9.6）包被，放置一段時(shí)間后NC膜均泛黃，嚴(yán)重影響試紙條的穩(wěn)定性。STR和KAN抗原用0.02M PB（pH 7.4）包被后有擴(kuò)散現(xiàn)象，加入0.15M NaCL以后擴(kuò)散現(xiàn)象消失，因此，STR和KAN抗原均選擇0.02M PBS（pH 7.4，0.15M NaCL）作為包被液，GEN抗原用含鹽離子濃度的PB包被，疏水性太強(qiáng)導(dǎo)致T線顯色太窄，因此，GEN抗原包被液選擇0.02M PB（pH7.4）。

表1 抗體稀釋液對抗體用量、試紙條顯色強(qiáng)度和靈敏度的影響

表2 金標(biāo)抗體干燥方式比較

表3 包被液對試紙條顯色效果、靈敏度和穩(wěn)定性的影響

三種不同NC膜對試紙條的影響見圖2。

圖2 NC膜對試紙條顯色和靈敏度的影響

由圖2可知，NC膜爬速越慢，抗原與NC膜的親水性越強(qiáng)，T線條帶越寬。NC膜爬速對試紙條顯色強(qiáng)度和靈敏度影響不大，因此從視覺美感的角度，我們選擇Millipore 135進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

本研究還考察了六種不同的抗原位置組合對試紙條顯色和靈敏度的影響，結(jié)果表明，不同的位置組合對試紙條顯色和靈敏度基本沒有影響。這可能與我們檢測的均是小分子物質(zhì)有關(guān)，膠體金的粒徑是40 nm，而NC膜的平均孔徑大約是8μm，因而不會(huì)對金標(biāo)抗體的層析產(chǎn)生空間位阻。

2.4 樣品墊的材質(zhì)及用不同處理液處理對試紙條顯色和靈敏度的影響本研究篩選了三種不同的樣品墊材質(zhì)（濾血膜HG-2、SB08和8904），研究其對試紙條層析速度、顯色和靈敏度的影響。因SB08和8904為玻璃纖維素膜，是一種疏水性材料，導(dǎo)致樣品的層析速度很慢，嚴(yán)重影響金標(biāo)抗體的釋放，且沒有完成整個(gè)層析過程就中斷了。而濾血膜親水性強(qiáng)，樣品擴(kuò)散速度快，且對蛋白質(zhì)的吸附低，是POCT診斷行業(yè)中理想的樣品墊材料選擇。

四種不同配方的樣品墊處理液對試紙條顯色和靈敏度的影響見表4。

表4 樣品墊處理液對試紙條顯色和靈敏度的影響

由表4可知，配方4為最佳樣品墊處理液，其配方為：0.02 M PB（pH 7.4，0.8%Tween-20）。樣品墊處理液中表面活性劑的含量太低，則會(huì)影響金標(biāo)抗體的釋放以及在NC膜上的表現(xiàn)。

2.5 膠體金免疫層析技術(shù)參數(shù)確定

2.5.1 cut-off值多殘留膠體金方法檢測STR、GEN和KAN標(biāo)準(zhǔn)品添加系列濃度的牛奶樣品結(jié)果見圖3。由圖3可知，本研究研制的膠體金免疫層析試紙條檢測牛奶中STR、GEN和KAN的cut-off值分別為50、20、50 ng/mL。直接檢測牛奶樣本，同步檢測這三種藥物的時(shí)間＜10 min。

2.5.2 交叉反應(yīng)試紙條檢測其他AGs的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可知，該試紙條對DHS、MIC和TOB有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，其cut-off值分別為50、20、50 ng/mL，對AMI、NEO和SPE基本無交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，本研究研制的試紙條可同時(shí)檢測STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB六種AGs。

圖3 試紙條檢測牛奶中STR、GEN和KAN的cut-off值

表5 試紙條交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 穩(wěn)定性將三批多殘留膠體金試紙條產(chǎn)品同時(shí)進(jìn)行低溫、加速和長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品在低溫或高溫且濕度大的環(huán)境下放置15 d后，試紙條的顯色強(qiáng)度由1000下降至843，變化范圍＜20%，而STR、GEN和KAN的cut-off值基本不變，結(jié)果表明，試紙條抗低溫和高溫能力較強(qiáng)。產(chǎn)品在室溫、干燥避光環(huán)境下保存12個(gè)月后，試紙條的顯色由1000下降至825，變化范圍＜20%，并且STR、GEN和KAN的cut-off值基本不變，長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條的保質(zhì)期可達(dá)12個(gè)月。

2.6 實(shí)際樣品檢測為驗(yàn)證膠體金方法的準(zhǔn)確性與可靠性，從全國不同區(qū)域采集100份原奶樣本，同時(shí)用膠體金方法和HPLC-MS/MS方法進(jìn)行檢測。采用膠體金方法共檢測出4份GEN陽性樣本（編號分別為28、36、59和83），2份STR陽性樣本（編號分別為65、77），未檢測到樣本中含KAN，膠體金試紙條的檢測結(jié)果與HPLC的檢測結(jié)果一致，說明本研究建立的多殘留膠體金免疫層析方法未出現(xiàn)假陽性和假陰性，準(zhǔn)確性高，可靠性好。

3 討論

影響膠體金免疫層析方法靈敏度的因素有很多（Li等，2014），比如：膠體金粒徑、抗體稀釋液、膠體金標(biāo)記抗體的最佳pH值和最適抗體用量、金標(biāo)抗體復(fù)溶液、層析方式、樣品前處理等等?？贵w稀釋液對試紙條顯色和靈敏度的影響非常關(guān)鍵，目前報(bào)道最多的抗體稀釋液成分為雙蒸水或PB緩沖液（任文潔等，2015；Chen等，2008）。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用0.5%BSA作為抗體稀釋液，發(fā)現(xiàn)與雙蒸水和PB緩沖液相比，不僅降低了抗體的消耗量，還可以起到增強(qiáng)顯色和提高靈敏度的作用，這與李向梅（2016）的報(bào)道一致。可能與BSA作為惰性蛋白，可以保護(hù)目的蛋白的活性，并且具有分散膠體金顆粒骨架，維持膠體金的膠體穩(wěn)定，同時(shí)消除非特異性反應(yīng)的作用有關(guān)。

本研究是在同一個(gè)NC膜上包被三個(gè)不同的抗原，形成三條檢測線，達(dá)到多殘留檢測的目的。因結(jié)構(gòu)的相似度較高，STR、GEN和KAN抗體分別對DHS、MIC和TOB有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率在90%以上。因此，本多殘留膠體金試紙條可以同步檢測六種常用的AGs。

本文還研究了三條檢測線共六種位置組合對試紙條顯色和靈敏度的影響。結(jié)果表明，三種抗原位置的任意調(diào)換不會(huì)影響各自的檢測性能。這可能與我們檢測的藥物均為小分子物質(zhì)，抗體分子質(zhì)量一般在150 KDa，膠體金的粒徑為40 nm，而抗原抗體發(fā)生反應(yīng)的載體NC膜的平均孔徑一般在8μm左右，因此對抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生空間位阻的可能性較少，這與Li等（2015）的研究報(bào)道一致。

目前，國內(nèi)外檢測AGs的膠體金免疫層析方法報(bào)道較多。但本研究的優(yōu)勢為6種常用AGs的多殘留檢測，可以同時(shí)檢測STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB，并且同步檢測這6種藥物的時(shí)間在10min以內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究成功建立了可同時(shí)檢測牛奶中6種常用AGs殘留的膠體金免疫層析技術(shù)。該方法對STR、DHS、GEN、MIC、KAN和TOB的cut-off值分別為50、50、20、20、50、50 ng/mL，同步檢測這6種藥物的時(shí)間在10 min以內(nèi)。采用膠體金方法與HPLC方法同時(shí)檢測從全國不同區(qū)域采集的100份原奶樣本，兩者的檢測結(jié)果一致，說明建立的膠體金方法準(zhǔn)確性高，可靠性好。

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A colloidal gold immunochromatographicmethod was developed for the simultaneous detection of 6 aminoglycosides residues inmilk.The optimum pH and amount of Abswhich colloidal gold labeled streptomycin（STR），gentamicin（GEN）and kanamycin（KAN）Abswere screened using checkerboardmethod.The 3 gold-labeled Absweremixed by a certain percentage and then lyophilized.The results showed that the cut-off value for STR，dihydrostreptomycin（DHS），GEN，micronomicin（MIC），KAN and tobramycin（TOB）were 50，50，20，20，50，50 ng/mL，respectively.Milk sample without pre-treatment，the synchronization detection time of 6 drugswere within 10 min.A total of 100 raw milk samples collected from different regions were detected by the colloidal gold method，with HPLCmethod for identification.The test results showed that the colloidal gold immunoassaymethod has high accuracy and good reliability.

aminoglycosides；streptomycin；gentamicin；kanamycin；colloidal gold；milk

S816.17

A

1004-3314（2017）06-0024-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170606