養(yǎng)正消積膠囊對(duì)荷MFC胃癌小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

周群琴 張愛(ài)琴 陳莎莎 錢(qián)祥

·論著·

養(yǎng)正消積膠囊對(duì)荷MFC胃癌小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

周群琴1張愛(ài)琴2陳莎莎3錢(qián)祥2

目的探討?zhàn)B正消積膠囊對(duì)荷MFC胃癌小鼠的療效及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法雄性615小鼠50只，皮下接種法建立小鼠胃癌腫瘤模型，隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)正消積膠囊組、5-氟脲密啶（5FU）組、聯(lián)合組，每組各10只，另設(shè)正常組10只。觀察荷MFC胃癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況以及體質(zhì)量等的變化。于末次給藥后完整剝?nèi)∫浦擦?、胸腺、脾臟并稱(chēng)重，計(jì)算各組荷MFC胃癌小鼠移植瘤體積和抑瘤率。流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。結(jié)果（1）模型組、聯(lián)合組、養(yǎng)正消積膠囊組、5FU組小鼠瘤重分別為（4.46±0.89）g、（2.21±0.27）g、（3.50±0.42）g、（3.30± 0.41）g，與模型組瘤重比較，聯(lián)合組、養(yǎng)正消積膠囊組、5FU組抑瘤率分別為50.92%、22.29%、25.89%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）聯(lián)合組、養(yǎng)正消積膠囊組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例分別為（4.73±0.35）%、（5.43±0.47）%，均低于模型組的（7.26±1.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論養(yǎng)正消積膠囊具有抗MFC胃癌移植小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，該作用可能與其下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)相關(guān)。

小鼠；胃癌；養(yǎng)正消積膠囊；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃癌的發(fā)生與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞能夠逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。從免疫逃逸角度探索胃癌治療的新方法成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。養(yǎng)正消積膠囊是國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)（Z20040095）抗癌中成藥，已被證實(shí)對(duì)實(shí)體瘤有抗癌作用，并可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，但其機(jī)制尚不明確。本課題旨在通過(guò)觀察養(yǎng)正消積膠囊抗MFC胃癌荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)，及對(duì)荷瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例的影響，探討該方調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫的機(jī)制，為該方臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠MFC前胃癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞室培養(yǎng)傳代。SPF級(jí)雄性615小鼠50只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所，合格證號(hào)：SCXR（津）2009-0002。由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代為飼養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑儀器養(yǎng)正消積膠囊粉末購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；5-氟脲密啶（5FU）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；抗小鼠CD4-FITC，購(gòu)自美國(guó)BD公司，批號(hào)5027567；抗小鼠CD25-APC，購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗小鼠Foxp3-PE，購(gòu)自美國(guó)BD公司；FBS，購(gòu)自美國(guó)BD公司；Mouse Foxp3 Buffer set（Permeabi1izationConcentrate、FixationConcentrate），購(gòu)自美國(guó)BD公司；紅細(xì)胞裂解液美國(guó)BD公司，批號(hào)5075567；流式細(xì)胞儀：購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 動(dòng)物分組與給藥含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，最終將細(xì)胞懸液稀釋為5×106/mL的濃度備用。用隨機(jī)數(shù)字表法選出10只615小鼠為正常組，余40只615小鼠每只按每只0.2mL在每只小鼠右前肢腋窩處皮下接種以造模，造模后再按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、養(yǎng)正消積膠囊組、5FU組、聯(lián)合組，每組10只。全部615小鼠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中。養(yǎng)正消積膠囊每粒0.39g，成人用量1天3次，每次4粒，按《中藥藥理研究方法學(xué)》用量折算法，計(jì)算得小鼠每日用量為0.01g。5FU注射液，每只小鼠按20mg/kg隔日腹腔注射給藥。養(yǎng)正消積膠囊組、聯(lián)合組每天予養(yǎng)正消積膠囊藥液0.2mL灌胃，5FU組、聯(lián)合組隔天予5FU藥液0.2mL腹腔注射。給藥時(shí)間從造模后第1天起至第15天。正常組和模型組不予處理。

1.4 觀察成瘤率、腫瘤體積、體質(zhì)量、平均瘤重、胸腺重、脾臟重自接種第3天開(kāi)始，經(jīng)造模的各組小鼠右前肢腋窩皮下均觸及小米粒樣腫塊，成瘤率100%。自造模起，每天稱(chēng)小鼠體質(zhì)量。自接種第6天開(kāi)始，每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤最長(zhǎng)徑L（mm）和垂直方向的最大橫徑W（mm），計(jì)算移植瘤體積[V（mm3）=L×W2/2]。在停藥24h后，用摘眼球采血法留取五組小鼠血液，而后脊髓脫臼處死小鼠，完整剝離移植瘤、胸腺、脾臟并稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例向200μL肝素抗凝血中加入2mL紅細(xì)胞裂解液，用FBS將裂解紅細(xì)胞后的細(xì)胞稀釋至1×107個(gè)/mL；將20μL CD4-FITC與CD25-APC加入流式管底部，再加入100μL稀釋好的細(xì)胞，混勻，室溫避光孵育20min；加入2mLFBS，250×g離心10min，棄上清；加入2mL Fixation Buffer，混勻，4℃避光孵育30min；500×g離心5min，棄上清；加入2mL Permeabilization buffer，500×g離心5min，棄上清；再加入2mL Fixation Buffer，37℃避光孵育30min；500×g離心5min，棄上清；加入2mL FBS，500×g離心5min，棄上清；加入20μL抗小鼠Foxp3-PE，混勻，室溫避光孵育20min；加入2mL FBS，500×g離心5min，棄上清；再加入2mL FBS，500×g離心5min，棄上清；加入500μL FBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，以CD4+T設(shè)門(mén)，檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS Statistics 17.0軟件。計(jì)量資料用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時(shí)多組間兩兩比較用最小極差法（LSD法），方差不齊時(shí)多組間兩兩比較用Dunnett's T3法，任意兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P<0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量、移植瘤體積、腫瘤抑制率比較5FU組小鼠體質(zhì)量增加較少，其余各組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)稍好，明顯優(yōu)于5FU組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。各組小鼠移植瘤體積逐漸增大，其中模型組小鼠移植瘤體積增長(zhǎng)較快，各用藥組移植瘤增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，其中聯(lián)合組增長(zhǎng)最為緩慢，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。各用藥組瘤重均低于模型組，其中養(yǎng)正消積膠囊組、5FU組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），養(yǎng)正消積膠囊組與5FU組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見(jiàn)表2。

圖1 各組MFC胃癌荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況（g，）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況（g，）

組別正常組5FU組模型組養(yǎng)正消積膠囊組聯(lián)合組鼠數(shù)10 10 10 10 10初體質(zhì)量20.30±0.94 20.11±0.71 19.26±0.62 20.07±0.82 20.20±0.89末體質(zhì)量31.23±1.35 30.08±1.99 29.20±2.77 29.74±1.72 31.35±0.95體質(zhì)量變化11.2±0.94 9.94±1.95 9.64±1.47 10.97±1.07 11.15±0.81

表2 各組荷MFC胃癌小鼠移植瘤抑制率情況

表2 各組荷MFC胃癌小鼠移植瘤抑制率情況

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別模型組養(yǎng)正消積膠囊組5FU組聯(lián)合組鼠數(shù)10 10 10 10瘤重（g）4.46±0.89 3.50±0.42* 3.30±0.41* 2.21±0.27**抑瘤率（%）－22.29 25.89 50.92

2.2 各組小鼠胸腺、脾臟重量比較與正常對(duì)照組比較，各組小鼠胸腺的重量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟重量增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），養(yǎng)正消積膠囊組和與聯(lián)合組干預(yù)后脾重接近正常水平（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 小鼠脾臟和胸腺重量比較（mg）

表3 小鼠脾臟和胸腺重量比較（mg）

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

組別正常組模型組5FU組養(yǎng)正消積膠囊組聯(lián)合組鼠數(shù)10 10 10 10 10脾重127.70±9.096 221.56±41.69#211.36±52.58 146.85±19.31* 143.31±21.33*胸腺重62.33±4.08 67.79±8.64 66.20±6.27 64.55±4.39 63.45±3.89

2.3 各組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例與正常組相比，模型組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；與模型組相比，荷胃癌小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例經(jīng)養(yǎng)正消積膠囊單藥和與5FU聯(lián)合給藥干預(yù)后下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；經(jīng)5FU單藥干預(yù)后，小鼠外周血Treg細(xì)胞比例有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例流式圖，見(jiàn)圖2。

表4 各組小鼠Treg細(xì)胞比例比較（）

表4 各組小鼠Treg細(xì)胞比例比較（）

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

組別正常組模型組5FU組養(yǎng)正消積膠囊組聯(lián)合組鼠數(shù)10 10 10 10 10 Treg細(xì)胞比例（%）3.26±0.38 7.26±1.12#7.69±1.79 5.43±0.47* 4.73±0.35*

圖2 各組MFC胃癌荷瘤小鼠外周血Treg細(xì)胞比例流式圖

3 討論

《臨證指南醫(yī)案》曰：“經(jīng)幾年宿病，病必在絡(luò)”。故而胃癌當(dāng)屬“絡(luò)病”范疇。其根本原因是由于脾胃虧虛，臟腑功能失調(diào)，加之長(zhǎng)期的飲食不節(jié)，情志失調(diào)，勞倦內(nèi)傷，或感受外邪，導(dǎo)致脾胃功能受損，運(yùn)化失常，精氣失充，絡(luò)氣虧虛，虛而留滯，形成痰凝熱毒血瘀等病理產(chǎn)物，繼而阻塞絡(luò)脈，膠結(jié)蘊(yùn)阻于胃絡(luò)，積聚成積。養(yǎng)正消積膠囊是在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制而成，是運(yùn)用絡(luò)病理論分析胃癌的病機(jī)與治療方法的成藥。方中黃芪、女貞子、人參、靈芝、茯苓、炒白術(shù)健脾補(bǔ)腎，土蟞蟲(chóng)、莪術(shù)、雞內(nèi)金散結(jié)通絡(luò)，白花蛇舌草、半枝蓮、絞股藍(lán)、蛇莓、白英、茵陳蒿、徐長(zhǎng)卿解毒抗癌。其組方原則與中醫(yī)對(duì)該病的治療方法基本一致，均以健脾益腎為本，以充養(yǎng)精氣，濡養(yǎng)絡(luò)脈，調(diào)暢氣機(jī)；以祛瘀散結(jié)通絡(luò)，清熱解毒散結(jié)為輔，使瘀祛絡(luò)通積自消，從而發(fā)揮“養(yǎng)正積自除”之功。

本研究結(jié)果顯示，模型組、5FU組小鼠體質(zhì)量與其他各用藥組相比呈下降趨勢(shì)，而養(yǎng)正消積膠囊組荷瘤小鼠體質(zhì)量較好，聯(lián)合組最佳；養(yǎng)正消積膠囊組和聯(lián)合組荷瘤小鼠脾臟重量及Treg細(xì)胞比例低于模型組，其中聯(lián)合組最低，但均高于正常組；養(yǎng)正消積膠囊組、5FU組、聯(lián)合組抑瘤率分別為22.29%、25.89%、50.92%；結(jié)合已有研究報(bào)道，可以認(rèn)為，養(yǎng)正消積膠囊可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高患者生活質(zhì)量，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與化療聯(lián)合給藥效果更佳[1-2]。

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞是一類(lèi)免疫抑制性細(xì)胞，在維持外周免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，既可以通過(guò)防止免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)和自身抗原的免疫應(yīng)答來(lái)維持對(duì)自身成分耐受，又可以通過(guò)阻止機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[3-5]。在胃癌小鼠模型中，隨著胃癌的進(jìn)展，Treg細(xì)胞比例呈增高趨勢(shì)；應(yīng)用Treg細(xì)胞可以促進(jìn)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，降低胃癌細(xì)胞的凋亡；應(yīng)用Treg細(xì)胞拮抗劑Anti-GITR則可以增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗胃癌作用[6]。機(jī)體內(nèi)天然生成的CD4+CD25+Foxp3+Treg是從胸腺中直接發(fā)育而來(lái)，通過(guò)“另類(lèi)陰性選擇”過(guò)程[7]接受某種信號(hào)從而獲得免疫抑制能力，故胸腺內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定；而脾臟是外周免疫器官，經(jīng)特異性抗原或免疫抑制因子的刺激如腫瘤、藥物等使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)生成具有免疫抑制活性的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，解剖時(shí)可見(jiàn)模型組和各用藥組小鼠脾臟均不同程度變黑腫大。臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量較健康志愿者高，且其細(xì)胞數(shù)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況關(guān)系密切，其數(shù)量變化可以反應(yīng)胃癌患者荷瘤狀態(tài)[8]。并且，在腫瘤局部聚集著比正常組織更多的各類(lèi)免疫細(xì)胞，而對(duì)胃癌預(yù)后有影響的是腫瘤局部組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，它可以作為胃癌免疫治療的靶點(diǎn)[9]。Ahonen等[10]在研制多因子移植瘤疫苗（CD40和TLR促效劑）中，就將移植瘤組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的減少數(shù)量作為評(píng)價(jià)其效果的指標(biāo)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，癌癥患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞增多，并且大量的Treg細(xì)胞導(dǎo)致了患者的低存活率[11-12]，而針對(duì)靶向Treg的治療有望提高宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，荷瘤機(jī)體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞呈高表達(dá)狀態(tài)，可能和腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而養(yǎng)正消積膠囊組及聯(lián)合組Treg細(xì)胞比例增長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明養(yǎng)正消積膠囊可以抑制移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能和抑制Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)正消積膠囊及養(yǎng)正消積膠囊與5FU聯(lián)合給藥有抑制Treg細(xì)胞表達(dá)的作用，近期療效顯著，但遠(yuǎn)期療效還需深入研究。

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（收稿：2016-09-13修回：2016-11-24）

Effect ofYangzheng Xiaoji Capsule on Regulatory T Cells(Treg)of MFC Tumor bearing 615Mice

ZHOU Qunqin1,ZHANG Aiqin2,CHEN Shasha3,QIAN Xiang2
1 Keqiao Hospital of TCM,Shaoxing(312030),China;2 Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;3 Taizhou Cancer Hospital,Wenling(317500),China

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effects ofYangzheng Xiaoji Capsule and theunderlying immune regulation mechanism.MethodsForty of MFC tumor bearing 615 mice models were established by inoculated subcutaneously way,then were randomly divided into 4 groups（n=10 in each group）:model group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,5FU group,and comprehensive treatment group.Another 10 mice served as control group.The growth of tumor in mice and the change of mouse weight were observed.After last dosing,the mice were sacrificed to obtain and weigh the tumor,thymus and spleen,then the tumor volume and the inhibitory rate were calculated.CD4+CD25+ Foxp3+Treg cells proportion in mouse peripheral blood was detected with Flow cytometry.ResultsThe tumor weight in model group,comprehensive group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,and 5FU group were 4.46±0.89g,2,21± 0.27g,3,50±0.42g,and 3.30±0.41g,respectively.Compared to model group,the inhibitory rateof comprehensive treatment group,Yangzheng Xiaoji Capsule group,and 5FU group were 50.92%,22.29%,and 25.89%,respectively, with significant difference（P<0.05）.The expression of CD4+CD25+Foxp3+Tregcellsin comprehensive treatment group and Yangzheng Xiaoji Capsule group waslower than that of model group（4.73%±0.35%,5.43%±0.47%vs 7.26%± 1.12%,P<0.05）.ConclusionYangzheng Xiaoji Capsule can suppress the growth of MFC gastric carcinoma,which may be involved in decreasing the level of CD4+CD25+Foxp3+Treg.

Smice;gastric carcinoma;Yangzheng Xiaoji Capsule;CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014ZB020）

1浙江省紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（紹興312030）；2浙江省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科（杭州310022）；3浙江省臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科（臺(tái)州317500）

張愛(ài)琴，Tel：13777462976；E-mail：zhanghaojianbb@163.com