大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

楊威，徐闖，陳媛媛，鄭家三，張洪友，夏成

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

楊威，徐闖，陳媛媛，鄭家三，張洪友，夏成

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

利用不同高脂飼料配方建立大鼠非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）模型，為非酒精性脂肪肝的研究提供參考依據(jù)。大鼠飼喂單純高脂飼料以及分別含有去氧膽酸、丙基硫氧嘧啶的高脂高膽固醇飼料，經(jīng)6周的實(shí)驗(yàn)周期。結(jié)果顯示，單純飼喂高脂飼料大鼠（H6）呈現(xiàn)出顯著的體重增加以及肝臟脂肪浸潤。飼喂添加去氧膽酸鹽的高脂飼料后大鼠肝臟膽固醇水平顯著降低，但血液丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著高于H6大鼠。丙基硫氧嘧啶介導(dǎo)甲狀腺機(jī)能減退脂肪肝模型（HP6）組大鼠呈現(xiàn)前期體重生長緩慢后期的體重減輕且高的血清甘油三酯（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、ALT。四環(huán)素刺激下的甲狀腺機(jī)能減退大鼠（HPT6）呈現(xiàn)嚴(yán)重肝臟病變以及低下肝臟脂肪蓄積和高水平的血清ALT。表明HP6大鼠存在進(jìn)行性非酒精性脂肪肝的發(fā)生。而在四環(huán)素刺激下，甲狀腺機(jī)能減退大鼠存在進(jìn)行性肝纖維化以及肝臟疾病晚期的可能。為非酒精性脂肪肝研究提供了有力的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

高脂飲食；非酒精性脂肪肝；丙硫氧嘧啶；去氧膽酸鹽；鹽酸四環(huán)素

近年來，人類脂肪肝的發(fā)病呈不斷上升趨勢，對人類的健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅。非酒精性脂肪肝病作為最常見的肝臟疾病之一，根據(jù)其嚴(yán)重程度不同可從簡單的肝臟脂肪沉積到非酒精性脂肪肝炎，最后可發(fā)展為肝臟纖維以及肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。數(shù)據(jù)顯示，大約10%～24%人群患有非酒精性脂肪肝，而20%～30%的非酒精性脂肪肝患者將發(fā)展成非酒精性脂肪性肝炎。非酒精性脂肪肝與肥胖、糖尿病、甲狀腺功能減退、胰島素抵抗有關(guān)，數(shù)據(jù)顯示，80%的非酒精性脂肪肝是由肥胖引起[3，4]。目前一致認(rèn)為高脂飲食與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)，但高脂飲食與脂肪肝發(fā)生相關(guān)性仍有爭議，因此，研究擬建立高脂飲食的大鼠非酒精性脂肪肝模型，為非酒精性脂肪肝研究提供基礎(chǔ)。

目前高脂飲食大鼠非酒精性脂肪肝模型研究較為廣泛，且模型建立方法多樣，但常用的方法仍為高脂誘導(dǎo)，且大部分研究同時(shí)添加了丙基硫氧嘧啶、膽鹽等藥物刺激，此外還有部分研究采用四環(huán)素建立脂肪肝動(dòng)物模型[5-6]。丙基硫氧嘧啶比甲巰基咪唑致畸作用小，被認(rèn)為更適合用于治療甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的藥物[7]。而研究表明丙基硫氧嘧啶能引起肝細(xì)胞損傷并增加慢性酒精攝入病人肝細(xì)胞需氧量，引起29.4%的病人因服用丙基硫氧嘧啶而的暴發(fā)性肝衰竭死亡[8]。四環(huán)素作為一種口服廣譜抗生素藥物被廣泛用于細(xì)菌感染以及家畜的食品添加劑，但易引起食物殘留[9-10]。此外四環(huán)素被認(rèn)為可引發(fā)肝臟線粒體損傷而介導(dǎo)肝臟脂肪沉積[11]。因此，研究采用含有上述不同藥物的高脂飼料建立大鼠非酒精性脂肪肝模型，通過對其效果評價(jià)，旨在為大鼠非酒精性脂肪肝的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只八周齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成6組：對照組（C6），6只，大鼠飼喂正常飼料；高脂飼喂組（H6），6只，大鼠飼喂高脂飼料；高脂去氧膽酸鹽飼喂組（HD6），6只，大鼠飼喂含有0.2%去氧膽酸鹽高脂飼料；鹽酸四環(huán)素組（CT6），于實(shí)驗(yàn)前1天大鼠腹腔注射鹽酸四環(huán)素（100 mg·kg-1體重），之后飼喂正常飼料；甲狀腺減退高脂組（HP6），6只，大鼠飼喂含有0.1%丙基硫氧嘧啶的高脂飼料；鹽酸四環(huán)素處理的甲狀腺減退高脂組（HPT6），6只，于實(shí)驗(yàn)前1天大鼠腹腔注射鹽酸四環(huán)素（100 mg·kg-1體重），之后飼喂含有0.1%丙基硫氧嘧啶的高脂飼料。各組大鼠的實(shí)驗(yàn)周期為6周。相關(guān)飼料配方如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所需飼料成分Table 1Detailed composition of the diets used in the experiments

1.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)期間每周對大鼠進(jìn)行體重測量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，大鼠禁食10 h至14 h之后，斷頸處死，后腔靜脈采血，分離血清于-80℃保存。取出大鼠肝臟，生理鹽水清洗后，肝臟組織固定于4%甲醛中用于伊紅美藍(lán)染色（HE）染色。

1.3 血清及肝臟生化分析

血清甘油三酸酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）利用自動(dòng)生化分析儀（Beckman Coulter Synchron DXC800，Beckman Coulter.Inc.，USA）檢測。肝臟TG、TC利用酶生化試劑盒檢測（天根生化科技有限公司，北京）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS19.0分析軟件對各組間進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)定為差異顯著。所有數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)期大鼠體重變化

試驗(yàn)選用的雄性Wistar大鼠初始體重180～200 g，隨機(jī)分為6組。如圖1所示，各組間大鼠初始體重?zé)o差異。實(shí)驗(yàn)第2周C6、CT6、H6和HD6大鼠體重明顯高于丙基硫氧嘧啶飼喂組HP6和HPT6大鼠。實(shí)驗(yàn)第6周H6大鼠體重顯著高于其他各組，而C6、CT6 和HD6大鼠體重差異不明顯，而HP6和HPT6組大鼠體重顯著低于其他組。

2.2 血清、肝臟部分生化指標(biāo)分析

如表2所示，喂食高脂飼料6周后，H6組大鼠表現(xiàn)為典型的非酒精性脂肪肝，肝臟中TG和TC含量著高于C6大鼠，H6大鼠血液TG、TC、LDL-c、AST水平高于C6大鼠，但差異不顯著。HDL-c被認(rèn)為是血脂異常的主要標(biāo)志，但H6大鼠血液HDL-c水平顯著低于其他各組。飼喂含有去氧膽酸鹽高脂飼料的HD6大鼠血液ALT和AST水平以及肝臟TG含量顯著高于H6大鼠，但肝臟中TC顯著低于H6大鼠。飼喂含有丙基硫氧嘧啶高脂飼料的HP6大鼠血清TC、HDL-c、LDL-c、ALT以及肝臟TG含量顯著高于H6大鼠，但HP6大鼠肝臟TG含量低于H6大鼠，且兩組間血清TG含量無顯著差異。與C6相比，給予鹽酸四環(huán)素刺激的CT6大鼠血清呈現(xiàn)了高水平HDL-c，但其他血液和肝臟指標(biāo)與C6大鼠無顯著差異。HPT6血液TG、TC、LDL-c及肝臟TG含量顯著低于HP6大鼠，但血液ALT高于HP6大鼠，表明HPT6大鼠存在嚴(yán)重的肝損傷。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重變化Fig.1Body weight measurements of the rats in each group weekly

表2 血清和肝臟生化指標(biāo)分析Table 2Analysis of biochemical parameters in the serum and liver

2.3 肝臟病理HE染色觀察

大鼠肝臟經(jīng)HE染色，結(jié)果如圖2所示，C6大鼠肝臟結(jié)構(gòu)紋理正常，CT6大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)微粒性脂肪滴，細(xì)胞間隙充滿紅細(xì)胞。高脂飼喂的H6、HD6、 HP6、HPT6大鼠肝臟細(xì)胞存在不同程度的小泡或大炮性脂肪變性。此外HPT6大鼠肝臟呈現(xiàn)不同程度的纖維化以及囊腫的形成。

3 討論

圖2 肝臟組織病理學(xué)分析Fig.2Representative liver histopathology

非酒精性脂肪肝是人類最常見的肝臟疾病之一，大約10%～24%的人患有非酒精性脂肪肝，而其中80%的非酒精性脂肪肝患者是肥胖的。一項(xiàng)針對發(fā)達(dá)國家非酒精性脂肪肝疾病研究顯示，習(xí)慣性高脂飲食與脂肪肝發(fā)病率的關(guān)系極為密切。研究通過給大鼠飼喂含10%豬油及1%膽固醇的高脂飼料建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。與對照組大鼠相比，H6大鼠在第6周顯示典型的非酒精性脂肪肝，包括體增重增加和明顯的肝細(xì)胞脂肪浸潤。H6大鼠肝臟中高水平的TC則與高濃度的膽固醇攝入以及膽固醇排泄受阻有關(guān)。膽汁是膽固醇的主要代謝途徑，禁食大約12小時(shí)可能導(dǎo)致大鼠（無膽囊動(dòng)物）肝臟高濃度的TC。然而，肝臟中TG、TC水平升高會(huì)促進(jìn)氧化應(yīng)激并導(dǎo)致脂肪肝[12]。血清HDL-c是機(jī)體清除細(xì)胞及血管膽固醇的主要工具，可以有效的預(yù)防冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生，而本實(shí)驗(yàn)中H6大鼠低水平的血清HDL-c可能成為增加動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素[13]。

去氧膽酸作為利膽藥已被廣泛用于預(yù)防和溶解膽結(jié)石[14]，它能通過降低腸道膽固醇的吸收降低乳糜微粒膽固醇含量方式調(diào)節(jié)膽固醇水平[15]。與H6相比，HD6組大鼠肝臟膽固醇含量低下，可能是由于去氧膽酸降低的了腸道的膽固醇吸收所致。此外去氧膽酸也能通過加快肝臟膽固醇經(jīng)膽汁排出從而降低了肝臟膽固醇水平[16]。研究指出去氧膽酸能夠促進(jìn)胰島素抗藥性，而胰島素抵抗能夠促進(jìn)肝臟游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯，從而導(dǎo)致HD6大鼠肝臟TG升高[17]。HD6血液高HDL-c的水平也反應(yīng)了去氧膽酸有效的改善了膽固醇代謝。ALT和AST作為肝損傷指標(biāo)，兩者的不同之處在于ALT主要在肝臟中產(chǎn)生，而AST除見于肝臟也見于心臟，骨骼、腎腦、和紅細(xì)胞中。因此HD6大鼠血清高濃度的AST表明去氧膽酸引起高脂飲食下大鼠全身性反應(yīng)，而近期多項(xiàng)臨床研究指出去氧膽酸能夠引起血液AST含量升高，但其機(jī)制仍未被闡明[18]。

丙基硫氧嘧啶作為減少甲狀腺釋放的藥物常用于治療甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥[19]，但因其可引發(fā)嚴(yán)重的肝損傷，包括肝功能衰竭和死亡，丙基硫氧嘧啶不再被推薦作為孕婦和兒童甲亢的首選治療藥物。但丙基硫氧嘧啶已被廣泛用于誘導(dǎo)甲狀腺功能減退實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。甲狀腺激素通過促進(jìn)肝臟羥甲基戊二酰輔酶A合成來增加肝臟膽固醇合成，但其主要作用還是促進(jìn)肝臟膽固醇經(jīng)膽汁排出。因此，甲狀腺功能減退的患者血清中會(huì)呈現(xiàn)高的膽固醇水平[20]，而研究HP6組大鼠血清中的TC和LDL-c含量顯著高于H6大鼠。雖然高濃度的ALT與非酒精性脂肪性肝炎、進(jìn)行性纖維化無特異性相關(guān)性。但高水平ALT仍被作為非酒精性脂肪性肝炎和其他慢性肝病的診斷指標(biāo)[21]。研究中HP6大鼠高水平的血清ALT也預(yù)示著嚴(yán)重肝臟損傷的存在。而HP6大鼠肝臟低下的TG是否與嚴(yán)重肝臟損傷有關(guān)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究利用鹽酸四環(huán)素建立大鼠肝臟損傷模型，結(jié)果顯示CT6肝臟和血液生化指標(biāo)與健康組差異不顯著，但HPT6大鼠血液TG、TC、LDL-c及肝臟TG含量顯著低于HP6大鼠，且血液ALT高于HP6大鼠，此外HPT6大鼠嚴(yán)重的肝臟病理變化，包括囊腫和纖維化等，都預(yù)示了HPT大鼠進(jìn)行性肝硬化的可能[22]。

4 結(jié)論

單純飼喂高脂飼料大鼠（H6）6周可建立大鼠脂肪肝模型。去氧膽酸鹽能有效降低高脂飼料導(dǎo)致大鼠肝臟膽固醇水平，但HD6大鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重的肝功損傷。利用丙基硫氧嘧啶介導(dǎo)甲狀腺機(jī)能減退脂肪肝模型，HP6大鼠前期體重生長緩慢后期的體重減輕且高的血清甘油三酯（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、ALT，則預(yù)示HP6大鼠進(jìn)行性非酒精性脂肪肝的發(fā)生。而在四環(huán)素刺激下，HPT6大鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重肝臟病變以及低下肝臟脂肪蓄積和高水平的血清ALT，預(yù)示進(jìn)行性肝纖維化以及肝臟疾病晚期的可能。

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Establishment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease Model in Rats

Yang Wei，Xu Chuang，Chen Yuanyuan，Zheng Jiasan，Zhang Hongyou，Xia Cheng
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

To study nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD），wistar rats were fed with different high-fat diets to develop NAFLD.In this study，wistar rats were fed with high-fat diets（with or without deoxycholic acid or propylthiouracil）for 6 weeks.Our results showed that rats fed a high-fat diet（H6）gained a significant amount of weight and severe steatosis.Compared with H6 rats，rats which fed with high-fat diets with deoxycholic acid showed decreased liver cholesterol and significant higher serum alaninetransaminase （ALT）and aspartate aminotransferase（AST）.The hypothyroid rats induced by propylthiouracil had a fleshless body，significantly higher concentrations of total cholesterol（TC），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-c）and ALT concentrations in serum. Hypothyroid rats that had a previous prepared with tetracycline demonstrated severe pathological changes in the liver，lower liver triglyceride accumulation and high serum ALT concentrations.The results suggested that propylthiouracil-induced hypothyroidism played an important role in progressive NAFLD，Hypothyroid rats that had a previous prepared with tetracycline could develop an end-stage liver disease.This find was important for NAFLD research.

high-fat diet；nonalcoholic fatty liver disease；propylthiouracil；deoxycholic acid；tetracycline

S856.4

A

1002-2090（2017）03-0015-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.004

2016-04-01

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31502133）；國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD12B03-2和2013BAD21B01）。

楊威（1985-），男，講師，吉林大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事動(dòng)物營養(yǎng)代謝病方面的研究工作。

夏成，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：xcwlxyf2014@163.com。