江漢油田區(qū)典型農(nóng)田土壤烴類降解微生物功能基因bssA的遺傳多樣性研究*

左小虎 王明霞 姚炎紅 李振輪 周志峰

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716）

江漢油田區(qū)典型農(nóng)田土壤烴類降解微生物功能基因bssA的遺傳多樣性研究*

左小虎 王明霞 姚炎紅 李振輪 周志峰?

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716）

油田區(qū)土壤易受烴類物質(zhì)影響并可能富集了特異的石油烴降解微生物類群。針對(duì)江漢油田區(qū)5個(gè)不同油井口附近的典型旱地農(nóng)田土壤，采用石油烴（Petroleum hydrocarbons，PHs）中苯系物代謝的關(guān)鍵功能基因-bssA（苯甲基琥珀酸合成酶基因）作為分子標(biāo)識(shí)物，通過(guò)克隆文庫(kù)結(jié)合末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）的方法，研究該油田區(qū)土壤含有bssA基因的烴類降解微生物群落結(jié)構(gòu)，并探討其環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制。結(jié)果表明，土壤中PAHs含量在0.21～2.01 mg kg-1之間，石油烴污染程度較低。T-RFLP的分析表明不同土壤樣品中的bssA基因多樣性差異明顯，PAHs（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，多環(huán)芳烴）含量最高土壤中bssA基因多樣性最高，其優(yōu)勢(shì)bssA基因類群與硫酸鹽還原菌或地桿菌有較近的親緣關(guān)系。冗余分析進(jìn)一步表明，土壤硝態(tài)氮、有效磷、PAHs含量均是影響bssA基因多樣性的重要因子。這些結(jié)果表明：江漢油田區(qū)典型農(nóng)田土壤中含有bssA基因的主要類群為β-變形菌和δ-變形菌，并與地桿菌屬（Geobacter）、索氏菌屬（Thauera）和固氮菌屬（Azoarcus）具有較近的系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系。這些微生物可能通過(guò)硝酸鹽、硫酸鹽及鐵還原代謝過(guò)程降解土壤PAHs。

土壤；厭氧降解；苯甲基琥珀酸合成酶基因（bssA）；群落結(jié)構(gòu)

石油烴（Petroleum hydrocarbons，PHs）污染是油田開(kāi)發(fā)面臨的重要問(wèn)題，尤其是油田區(qū)域的農(nóng)田土壤，其污染物微生物修復(fù)得到了廣泛關(guān)注。石油烴是由烷烴、烯烴、芳香烴、雜環(huán)芳烴等多組分的復(fù)雜分子組成的均質(zhì)混合物，其中的多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）和苯系物（苯、甲苯、乙苯、二甲苯等）備受關(guān)注，是土壤中常見(jiàn)的有機(jī)污染物［1-3］，不僅嚴(yán)重危害土壤環(huán)境質(zhì)量，也會(huì)直接或間接危害人類健康［4-5］。因此，土壤中PAHs和苯系物降解微生物一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)［6-7］。一般認(rèn)為，在純培養(yǎng)體系有氧條件下PAHs及苯系物的微生物降解更易發(fā)生，但在復(fù)雜土壤和沉積物等自然環(huán)境中，石油烴大多閉蓄于微孔介質(zhì)等厭氧或微氧生境，厭氧微生物降解可能發(fā)揮了重要的作用［3，8］。例如，在苯系物、烴類及萘等低分子量PAHs的厭氧降解過(guò)程中，由甘氨酰自由基合成酶所催化的延胡索酸加入途徑起著十分重要的紐帶作用［9］。該途徑最早發(fā)現(xiàn)于β-變形菌厭氧降解甲苯的過(guò)程中，該過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由苯甲基琥珀酸合成酶（Benzylsuccinate synthase，BSS）基因所編碼的BBS催化延胡索酸加入到甲苯［10］，形成的（R）-苯甲基琥珀酸酯［11-13］可經(jīng)隨后的一系列反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵中間代謝物苯甲酰-CoA［9］。隨后的研究表明，該反應(yīng)普遍存在于苯系物，烷烴及PAHs的厭氧降解過(guò)程中。如，硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）和硝酸鹽還原菌（Nitrate-reducing bacteria，NRB）在厭氧條件下也可以對(duì)n-烷烴進(jìn)行類似于甲苯添加延胡索酸的活化降解，該過(guò)程由烷基琥珀酸合成酶（ASS）催化完成［14-15］，而SRB則是通過(guò)萘基-2-甲基-琥珀酸合成酶（NMS）催化延胡索酸加入2-甲基萘［16-17］，來(lái)完成厭氧代謝2-甲基萘的第一步反應(yīng)。因此，近年來(lái)，編碼BSS，ASS及NMS的關(guān)鍵功能基因（bssA；assA；nmsA）被嘗試作為分子標(biāo)識(shí)物，研究環(huán)境中苯系物等PHs類化合物厭氧代謝的微生物類群［10，18-19］，表征環(huán)境受污染程度及微生物降解的潛在能力。如，F(xiàn)rederick等［20］以bssA、nmsA和assA作為特異性標(biāo)識(shí)物，研究了一些石油烴污染環(huán)境（陸地及海洋）中的厭氧PHs降解菌群，并發(fā)現(xiàn)了一些與16S rRNA基因分類迥然不同的δ-變形菌和梭菌類群。Alejandro 等［21］比較了bssA、nmsA和assA基因的遺傳多樣性，研究了原油泄漏區(qū)域海水及沉積物中PHs厭氧降解菌的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這些基因的豐度及多樣性具有明顯的差異，并與受污染的程度密切相關(guān)。但已有的研究均表明，與nmsA和assA分子標(biāo)靶基因相比較，以bssA為代表的編碼延胡索酸加入的關(guān)鍵基因具備較強(qiáng)的專一性，是未來(lái)研究石油污染環(huán)境微生物修復(fù)的重要標(biāo)識(shí)物。但目前相關(guān)的bssA基因研究多見(jiàn)于海洋石油污染環(huán)境，油田區(qū)土壤中可能富集了大量的石油烴類降解微生物［7，22］，研究其中的關(guān)鍵功能基因多樣性對(duì)污染環(huán)境生物修復(fù)具有重要意義。

油田區(qū)域的土壤有受原油污染的風(fēng)險(xiǎn)，而土壤中極可能存在著厭氧/微氧環(huán)境［23］。據(jù)此，本研究針對(duì)具有50年油氣開(kāi)發(fā)歷史的江漢油田區(qū)，在約20 km2的范圍內(nèi)，選擇了5個(gè)不同油井附近的典型旱地農(nóng)田土壤，以bssA基因?yàn)榉肿訕?biāo)識(shí)物，通過(guò)克隆文庫(kù)結(jié)合T-RFLP的方法研究了油田區(qū)典型農(nóng)田土壤中苯系物厭氧降解微生物的群落結(jié)構(gòu)，初步探討了其群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究PHs類有機(jī)污染物的土壤厭氧代謝的微生物機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

江漢油田位于湖北省潛江市境內(nèi)，該油田已有50多年的油氣開(kāi)發(fā)歷史，是新中國(guó)最早開(kāi)發(fā)的油氣田之一。本研究的土壤樣品采集于2014年7月。在江漢油田區(qū)域共選擇5個(gè)不同的油井，編號(hào)為JH-1 至JH-5，每個(gè)油井口30～40 m半徑范圍內(nèi)，采集農(nóng)田0～20 cm表層新鮮土壤（潮土，黏壤）。在每個(gè)采樣點(diǎn)中心周圍30 m2的范圍內(nèi)，隨機(jī)選擇9個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行多點(diǎn)混合采樣并初步剔除石塊和雜物，以完成單個(gè)土樣的采集，且各樣點(diǎn)內(nèi)均按上述方法采集3個(gè)重復(fù)的土壤樣品。采集好的樣品裝于自封袋后，置于放有冰袋的箱子中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。隨后，過(guò)2 mm篩后分裝，部分放于4 ℃用于基本性質(zhì)測(cè)定，部分置于-20 ℃冰箱用于DNA的提取。

1.2 土壤性質(zhì)及PAHs含量測(cè)定

土壤pH采用2.5∶1的水土比，用“PHS-3C型”pH儀測(cè)定。土壤總有機(jī)質(zhì)、有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的測(cè)定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》［24］進(jìn)行，分別使用重鉻酸鉀氧化還原滴定法（K2Cr2O7-H2SO4法）、鉬銻抗比色法、靛酚藍(lán)分光光度法和萘乙二胺分光光度法測(cè)定。

土壤中PAHs含量的測(cè)定采用經(jīng)典的索氏提取法［25］。具體步驟如下：稱取10 g經(jīng)冷凍干燥的土壤樣品、10 g無(wú)水硫酸鈉及少量銅粉置于同一燒杯中混勻，無(wú)損移入濾紙桶，加入150 ml丙酮–正己烷（1∶1）混合液浸泡土壤樣品12 h，將濾紙桶裝入索氏提取器中75 ℃提取6 h；提取液于-46 kPa，45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 ml，然后用硅膠層析柱（1 cm無(wú)水硫酸鈉，6 cm活化硅膠和3 cm氧化鋁）凈化；以15 ml色譜級(jí)正己烷預(yù)洗后，用70 ml二氯甲烷和正己烷的混合液（3∶7，V/V）洗脫；收集洗脫液，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1～2 ml，再加入25 ml甲醇進(jìn)行溶劑置換，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并用甲醇定容至1 ml；最后用高效液相色譜儀（HITACHI L-7100，日本）測(cè)定各樣品中PAHs含量。

1.3 土壤DNA提取

土壤DNA提?。菏褂肞owerSoil?DNA Isolation Kit（MO BIO，美國(guó)）試劑盒提取土壤DNA。稱取0.5 g土壤樣品，具體操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。提取到的總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA產(chǎn)物，并用DU 800 spectrophotometer （Beckman Coulter Inc，美國(guó)）測(cè)定其濃度，最后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 克隆文庫(kù)構(gòu)建及T-RFLP分析

為了全面解析所采土壤樣品中bssA、nmsA和assA基因的類群，將所有5個(gè)土壤樣品的bssA、nmsA和assA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別混合并構(gòu)建其混合克隆文庫(kù)，為后續(xù)T-RFLP分析中限制性內(nèi)切酶的選擇提供依據(jù)，同時(shí)也有助于確定T-RFLP分析中所獲取的各末端片段所對(duì)應(yīng)的類群。具體步驟如下：分別以5個(gè)不同土壤樣品的DNA為模板，利用表1中的引物及相應(yīng)的擴(kuò)增條件對(duì)上述各目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)主要包括：0.25 μl TaKaRa Ex Taq（5 U μl-1）、2.5 μl 10×Ex Taq Buffer、2 μl dNTP Mixture（2.5 m mol-1）、前后引物各0.5 μl（10 μm mol-1）、2 μl DNA模板，加入滅菌水補(bǔ)足至25 μl反應(yīng)體系。將不同土壤樣品bssA、nmsA及assA基因的PCR產(chǎn)物分別混合，混合后的PCR產(chǎn)物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega，美國(guó)）進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector（Promega，美國(guó)）連接，之后轉(zhuǎn)入Escherichia coli JM109 （TakaRa，日本）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，各自隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆子送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，從而完成各目的基因混合克隆文庫(kù)的構(gòu)建。

表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序Table 1 Primer sets and PCR procedures

使用DNAMAN（Version 6.0.3.48，Lynnon Biosoft，美國(guó)）對(duì)所得序列進(jìn)行同源性分析，相似度＞9 5%的序列歸入同一分類操作單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），每個(gè)OTU選擇一條具有代表性的序列，采用鄰位相鄰法（Neighbor-Joining），用MEGA（version 6.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。之后，使用DNAMAN軟件對(duì)各OTU的代表性序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)果表明限制性內(nèi)切酶Alu I（Takara，日本）能夠較好地對(duì)bssA基因克隆文庫(kù)中優(yōu)勢(shì)的OTU進(jìn)行分型，可作為后續(xù)T-RFLP分析中的限制性內(nèi)切酶。本研究所獲得的序列已提交至GenBank并獲取了相應(yīng)的序列號(hào)（KX148522-KX148545）。據(jù)此，進(jìn)一步分別以各土壤樣品的DNA為模板，用前引物5′端帶FAM標(biāo)記的引物對(duì)（7772f/8546r）對(duì)bssA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物純化后，用Alu I在37 ℃酶切4 h，酶切產(chǎn)物用醋酸鈉和冰乙醇純化［26］，隨后用核酸測(cè)序儀ABI PRISM3700（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行基因掃描，用GeneMapper （Applied Biosystems，美國(guó)）軟件對(duì)T-RFLP圖譜進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行處理分析，樣品之間的平均值差異采用One–Way ANOVA單因素方差分析，p＜0.05表示差異顯著。用CANOCO （4.5）中的冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對(duì)bssA基因多樣性與環(huán)境因子之間的關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 土壤PAHs含量及理化性質(zhì)

不同油田附近典型農(nóng)田土壤PAHs含量及基本性質(zhì)見(jiàn)表2。各土壤樣品PAHs含量具有明顯差別，其中JH-5（2.01 mg kg-1）和JH-1（1.23 mg kg-1）的含量較高，其余各樣品均低于1 mg kg-1。供試土壤均呈堿性，且各樣品pH之間的差異性不顯著。不同土壤樣品的有機(jī)質(zhì)含量差異性顯著（p ＜0.05），其中樣品JH-5和JH-2的有機(jī)質(zhì)含量較高，分別為40.2 g kg-1和38.3 g kg-1，而JH-9的有機(jī)質(zhì)含量最低，僅為11.3 g kg-1。有效磷含量最高的樣品是JH-5（25.4 mg kg-1），其次是JH-3（15.9 mg kg-1）和JH-4（11.5 mg kg-1），其余各樣品的有效磷含量均低于10 mg kg-1。各土壤樣品的銨態(tài)氮含量差異不明顯，均在4.10～4.30 mg kg-1之間。硝態(tài)氮含量最高的是JH-5（31.1 mg kg-1），其次是JH-3和JH-4，其余樣品均低于5 mg kg-1。

表2 樣點(diǎn)土壤基本性質(zhì)Table 2 Basic properties of the tested soil samples

2.2 混合克隆文庫(kù)中bssA序列及其末端限制性片段組成

對(duì)bssA、nmsA和assA克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明只成功擴(kuò)增到土壤樣品中的bssA基因。從bssA混合克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選220個(gè)陽(yáng)性克隆子測(cè)序，并在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，共得到95條有效的bssA序列。在95%的相似水平下，可分為24個(gè)OTUs。各OTU代表性序列經(jīng)Alu I酶切后的末端限制性片段（Terminal-restriction fragment，T-RF）長(zhǎng)度及其所含序列占克隆文庫(kù)總序列數(shù)的百分比如下表3所示。可見(jiàn)，其序列數(shù)占克隆文庫(kù)總序列數(shù)的比例超過(guò)10%的優(yōu)勢(shì)OTUs為OTU-3 （10.5%）、5（11.55%）、6（17.85%）和23 （13.65%）。從表中還可看出，限制性內(nèi)切酶Alu I能夠較好地將這些優(yōu)勢(shì)OTUs進(jìn)行分型，適于后續(xù)的T-RFLP分析。

從每個(gè)OTU中選擇一條代表性的序列來(lái)構(gòu)建bssA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。從圖1可知，該油田區(qū)典型農(nóng)田土壤bssA基因可分為4個(gè)不同的簇（Clusters1-4）。其中，Cluster1含有8個(gè)OTUs，且包括占優(yōu)勢(shì)的OTU-3（571bp T-RF）和OTU-6 （409bp T-RF），它們與β-變形菌有較近的親緣關(guān)系。而Cluster2和Cluster4中各含有2個(gè)和4個(gè)OTUs，其所含序列數(shù)分別占克隆文庫(kù)總序列數(shù)的4.2%和11.2%。其余的10個(gè)OTUs 均屬于Cluster3，包含占據(jù)優(yōu)勢(shì)的OTU-5（388bp T-RF）和OTU-23（433bp T-RF）。此外，Cluster2、 Cluster3 和 Cluster4均與δ-變形菌的親緣關(guān)系較近。通過(guò)對(duì)bssA基因混合克隆文庫(kù)的構(gòu)建及相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育分析，可為后續(xù)T-RFLP中確認(rèn)不同長(zhǎng)度末端限制性片段（T-RFs）所代表的具體bssA類群提供依據(jù)。

2.3 土壤bssA基因的遺傳多樣性及其影響因子

各樣品bssA基因的T-RFs組成如圖2所示。由圖可知，樣品JH-1和JH-2中bssA的群落組成較為相似，均含有3種T-RFs類群（96、154、409 和433bp），且409bp和433bp的T-RFs是其共有的優(yōu)勢(shì)類群。結(jié)合2.2的結(jié)果可知，409bp T-RF可能屬于OTU-1、OTU-6或OTU-18，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中位于Cluster1，與β-變形菌門的紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）下的索氏菌屬（Thauera）和固氮弓菌屬（Azoarcus）有較近的親緣關(guān)系。而433bp的T-RFs則屬于OTU-23，位于Cluster3，與δ-變形菌門的地桿菌科（Geobacteraceae）的地桿菌屬（Geobacter）有較近的親緣關(guān)系。樣品JH-3中只檢測(cè)到一個(gè)252bp（不確定類群）獨(dú)特的bssA類群。樣品JH-4中的bssA由89bp（Cluster2或4）、175bp（Cluster3）、205bp（不確定類群）和295bp（不確定類群），共4種T-RFs所組成。

而在PAHs含量最高的JH-5中，含有的T-RFs類群最多，即89bp（Cluster4）、96bp（不確定類群）、175bp（Cluster3）、205bp（不確定類群）、295bp（不確定類群）、388bp（Cluster2或3）、409bp（Cluster1）及433bp（Cluster3），共8種T-RFs。其中388bp T-RF（Cluster2或3，硫酸鹽還原菌或地桿菌）的類群是其特異性類群。值得注意的是，在PAHs含量較高的JH-1和JH-5中，盡管bssA基因的組成差異明顯，但是組成JH-1中3種bssA類群（96，409和433bp）均出現(xiàn)在后者中，且96bp（不確定類群）是其所獨(dú)有的T-RFs。由此可見(jiàn)，96bp及388bp 的bssA類群可能受到土壤PAHs的富集。將土壤基本性質(zhì)及T-RFLP圖譜（去除過(guò)于單一的JH-3）分別作為環(huán)境變量和物種變量，對(duì)土壤環(huán)境因子與bssA群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析的結(jié)果（圖3）表明，四個(gè)樣品的bssA基因群落組成差異明顯，均不在一個(gè)象限。此外，除有效磷、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等因子外，土壤PAHs含量也是影響bssA群落組成的關(guān)鍵因子之一，且96bp（不確定類群）和388bp（硫酸鹽還原菌或地桿菌）T-RFs所代表的bssA類群與PAHs含量呈正相關(guān)。

表3 克隆文庫(kù)中的OTUs及Alu I 酶切的末端片段Table 3 OTUs in the bssA clone library and Alu I-digested TRFs

3 討 論

圖1 基于bssA克隆文庫(kù)構(gòu)建的N-J（Neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree based on bssA clone library

本研究中，土壤樣品的PAHs含量范圍為0.21～2.01 mg kg-1，低于中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)部2008年頒布的《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》修訂版（征求意見(jiàn)稿）中擬定的農(nóng)業(yè)用地土壤16種優(yōu)先控制PAHs總含量的篩選值（4.90～10.1 mg kg-1）［27］。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)江上游重慶金佛山土壤16種優(yōu)先控制PAHs的含量范圍為0.24～2.12 mg kg-1［28］。而對(duì)位于長(zhǎng)江下游長(zhǎng)江三角洲的蘇州市土壤PAHs含量的調(diào)查表明，該區(qū)域土壤總PAHs含量范圍為0.045～3.70 mg kg-1［29］。由此可見(jiàn)，本研究各樣點(diǎn)土壤中PAHs含量均在上述調(diào)查結(jié)果的范圍之內(nèi)，雖源于油井口附近，卻未遭受嚴(yán)重的污染。同時(shí)檢測(cè)到了苯系物厭氧代謝的關(guān)鍵基因-bssA，表明這些農(nóng)田土壤具有降解石油烴污染物的遺傳基礎(chǔ)?？寺∥膸?kù)的結(jié)果表明，該油田區(qū)土壤bssA類群主要為β-變形菌（Cluster1）和δ-變形菌（Cluster2、Cluster3和Cluster4），它們所含序列數(shù)分別占克隆文庫(kù)總序列數(shù)的42.6%和57.4%。已有的研究表明，變形菌門是多數(shù)PHs污染土壤中的優(yōu)勢(shì)bssA類群［20-21］，這與本研究的結(jié)論一致。其中，β-變形菌門的一些反硝化細(xì)菌可以芳香烴為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)［30-31］。而δ-變形菌中的一些硫酸鹽還原菌、鐵還原菌等也具備厭氧代謝芳香烴的能力［32］。從屬的水平來(lái)看，江漢油田區(qū)土壤中β-變形菌的bssA類群與索氏菌屬（Thauera）和固氮弓菌屬（Azoarcus）有較近的親緣關(guān)系，它們均具備在反硝化條件下厭氧代謝芳香烴化合物的能力［33］。而該區(qū)域土壤中δ-變形菌的bssA類群則與硫酸鹽還原菌TRM1（Sulfate-reducing bacterium TRM1）及地桿菌屬（Geobacter）有較近的親緣關(guān)系，上述兩種菌常見(jiàn)于PHs污染土壤中，它們分別能夠以硫酸根及鐵離子為電子受體在厭氧條件下降解芳香烴化合物［34］。如，Winderl等［18］報(bào)道，德國(guó)慕尼黑煤氣廠附近的水體沉積物中的主要bssA類群為地桿菌屬。Sun等［22］則在分別添加了硝酸鹽和硫酸鹽的甲苯污染土壤中，分別檢測(cè)到索氏菌DNT-1（Thauera sp. DNT-1）和硫酸鹽還原菌PRTOL1（sulfate-reducing bacterium PRTOL1）。此外，據(jù)報(bào)道，δ-變形菌N47和 NaphS2均含有nmsA基因［17，20］，而脫硫腸桿菌屬（Desulfotomaculum）的一些菌株則含有assA基因［19］。本研究中含有bssA基因的類群，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們同時(shí)含有nmsA或assA基因，這可能是后兩種基因不能成功從該區(qū)域土壤中成功擴(kuò)增的原因。

圖2 土壤樣品中bssA群落結(jié)構(gòu)的組成Fig. 2 Structural composition of the bssA community in the soil samples

圖3 基于bssA基因T-RFLP剖面與土壤性質(zhì)的RDA分析Fig. 3 RDA analysis based on T-RFLP of bssA and soil properties

本研究中T-RFLP的結(jié)果（圖2）表明，該油田區(qū)域不同樣點(diǎn)土壤樣品中的bssA微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯。其中，在PAHs含量最高JH-5中，具有最多的bssA基因類群，且388bp（Cluster2或3，硫酸鹽還原菌或地桿菌）是其特異性的優(yōu)勢(shì)T-RFs，這可能表明較高含量的PHs有機(jī)污染物對(duì)土壤中硫酸鹽還原菌或鐵還原菌具有一定富集作用。Alejandro等［21］也發(fā)現(xiàn)，海洋沉積物中受原油污染程度越大、時(shí)間越久，bssA基因的多樣性越高。結(jié)合上述分析可知，硫酸鹽還原或鐵還原條件可能是重度PHs污染土壤中污染物去除的重要厭氧代謝途徑［31］。在PAHs含量?jī)H次于JH-5的JH-1中，雖然僅檢測(cè)到3種bssA類群，但它們均出現(xiàn)在JH-5的bssA類群中，且96bp（不確定類群）的bssA類群只出現(xiàn)在它們中，這可能體現(xiàn)出PHs類污染物對(duì)土壤bssA類群的選擇性。此外，在PAHs含量較低的樣品中也出現(xiàn)了上述優(yōu)勢(shì)bssA類群，如409bp和433bp 也是JH-2的優(yōu)勢(shì)bssA類群，而JH-4的bssA類群多于JH-1，且其bssA類群均出現(xiàn)在JH-5中。可能原因有以下兩點(diǎn)：首先，所有的土壤樣品均采自同一區(qū)域，且類型相同，因此其土著微生物群落結(jié)構(gòu)（包含bssA類群）也應(yīng)該具有一定的同源性。其次，除PAHs外，土壤的其他理化性質(zhì)，如NO3-、NH4+、有效磷等也會(huì)對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［35］。JH-3中僅檢測(cè)到一個(gè)bssA類群，這可能是由于某些未知的土壤環(huán)境因子或人為干擾所導(dǎo)致。隨后的RDA分析（圖3）進(jìn)一步表明，除能夠作為微生物生長(zhǎng)所必須的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及有效磷外，土壤PAHs含量也是影響bssA群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子。與T-RFLP結(jié)果一致的是，96bp（不確定類群）和388bp（硫酸鹽還原菌或地桿菌）T-RFs所代表的bssA類群與土壤PAHs含量呈正相關(guān)，表明PHs污染可能對(duì)它們有較強(qiáng)的富集作用。綜上所述，江漢油田區(qū)域土壤含有PHs類污染物厭氧降解的遺傳基礎(chǔ)，可能通過(guò)不同的細(xì)菌在多種代謝途徑下進(jìn)行，如以硝酸鹽為電子受體的反硝化作用，以硫酸鹽為電子受體的硫酸鹽還原作用及以鐵離子為電子受體的鐵還原作用等。同時(shí)，土壤環(huán)境條件及受污染程度均可能影響bssA類群及其對(duì)PHs的降解效率。

4 結(jié) 論

本研究以典型PHs類污染物-苯系物厭氧代謝的功能基因bssA作為標(biāo)識(shí)，通過(guò)克隆文庫(kù)結(jié)合T-RFLP的方法，研究了典型油田區(qū)域土壤

PHs降解微生物的遺傳多樣性。該油田區(qū)主要的bssA類群為β-變形菌和δ-變形菌，包括索氏菌屬（Thauera）、固氮弓菌屬（Azoarcus）、硫酸鹽還原菌以及地桿菌屬（Geobacter），已知的這些微生物具有硝酸鹽還原、硫酸鹽還原及鐵還原代謝能力，可能是江漢油田區(qū)土壤厭氧微域中PHs降解的主要微生物類群。土壤氮、磷及PHAs含量均是影響bssA基因遺傳多樣性的關(guān)鍵因子，較高含量的PAHs可能對(duì)含有bssA基因的硫酸鹽還原菌及地桿菌屬的微生物具有一定的富集作用。

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Genetic Diversity of Hydrocarbons Degrading Microbial Functional Gene （bssA）in the Farmland Soil Typical of Jianghan Oilfield

ZUO Xiaohu WANG Mingxia YAO Yanhong LI Zhenlun ZHOU Zhifeng?
（College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China）

Farmland soils in oil fields are liable to get polluted with petroleum hydrocarbons（PHs），which consequently leads to enrichment of some special PHs degrading microbial groups in the soils. In this study，soil samples were collected from typical farmland fields near five different oil wells in the Jianghan Oilfield located in Qianjiang City，Hubei Province for analysis of PHs degrading microbial groups，using bssA （benzylsuccinate synthase gene），a functional gene key to anaerobic benzenes degradation as biomarker，and community structure of the PHs degrading microbial groups was determined with T-RFLP（Terminalrestriction fragment length polymorphism）and clone library. On such a basis，environmental factors affecting community composition of the soil bssA were discussed. Results show that the content of polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in the soil varied in the range of 0.21～2.01 mg kg-1，which indicates that the soil in this region was not seriously contaminated with PHs. Meanwhile，the T-RFLP analysis indicates that bssA diversity varied significantly from soil sample to soil sample in this oilfield，being the highest in the soil sample the highest in PAHs content，and its dominant group was in a fairly close kinship with sulfatereducing bacterium or Geobacter. Furthermore，RDA（Redundancy analysis）reveals that the contents of soil available nitrogen，phosphorus and PAHs were all main factors affecting soil bssA diversity. To sum up，all the findings indicate that the bssA-bearing microbial groups in the soil of this oilfield are Beta-proteobacteria and Deta-proteobacteria，and in close kinships with Thauera，Azoarcus and Geobacter in phylogenesis. All these microbes might degrade PAHs through reducing metabolic processes of nitrate，sulfate，and iron.

Soil；Anaerobic degradation；Benzylsuccinate synthase gene（bssA）；Community structure

S154.1

A

（責(zé)任編輯：盧 萍）

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41371477）和中央高校專項(xiàng)基金項(xiàng)目（XDJK2014B047）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41371477）and the Fundamental Research Funds for the Central Universities（No. XDJK2014B047）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：zhouzhf@swu.edu.cn

左小虎（1990—），男，湖北漢川人，碩士研究生，主要從事土壤微生物學(xué)研究。E-mail：375332084@qq.com

2016-11-04；

2017-01-10；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2017-02-28

10.11766/trxb201611040324