基于高通量測序的兩種植被恢復(fù)類型根際土壤細(xì)菌多樣性研究*

戴雅婷閆志堅解繼紅吳洪新徐林波侯向陽?高 麗崔艷偉

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010）

（2 農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復(fù)治理重點(diǎn)實(shí)驗室，呼和浩特 010010）

基于高通量測序的兩種植被恢復(fù)類型根際土壤細(xì)菌多樣性研究*

戴雅婷1，2閆志堅1解繼紅1吳洪新1徐林波1侯向陽1，2?高 麗1，2崔艷偉1

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010）

（2 農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復(fù)治理重點(diǎn)實(shí)驗室，呼和浩特 010010）

為研究庫布齊沙地生態(tài)恢復(fù)過程中不同植被恢復(fù)類型土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性的變化特征，以流動沙地為對照，運(yùn)用高通量測序技術(shù)，對自然恢復(fù)的油蒿群落、人工種植的中間錦雞兒群落根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，并分析了土壤理化性質(zhì)對其分布的影響。結(jié)果表明：（1）與流沙對照相比，兩種植被恢復(fù)類型對細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了正效應(yīng)，細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度明顯增加。其中，自然恢復(fù)的油蒿群落土壤細(xì)菌豐度高于人工種植的中間錦雞兒群落；（2）變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌類群，其中變形菌門在各樣地豐度比例最高，變形菌的4個亞群變化趨勢一致，α-變形菌相對含量在油蒿和中間錦雞兒群落根際土壤中明顯增加，尤其是自然恢復(fù)的油蒿群落根際土壤中α-變形菌得到了很好的恢復(fù)；（3）土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量是影響土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性的主要土壤因子，典型相關(guān)分析表明土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀、速效鉀、速效氮含量對于研究區(qū)土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性的變化起著重要作用。

根際土壤；細(xì)菌群落多樣性；高通量測序

土壤微生物參與碳、氮循環(huán)，有機(jī)化合物分解以及能量傳輸、運(yùn)送等多種過程的維護(hù)和調(diào)節(jié)［1-2］，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具有生命活力的重要組成部分。微生物群落多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)，在維持土壤肥力和土壤生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用［3］，其結(jié)構(gòu)和功能對于周圍環(huán)境條件特別敏感，是土壤變化的重要指示之一［4］。細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最多的類群，通常占土壤微生物的70%～90%，具有最為豐富的遺傳多樣性［5］，能有效促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解、營養(yǎng)物質(zhì)的釋放［6］，參與碳、氮等物質(zhì)循環(huán)過程，維持了生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)［7］。

庫布齊沙地是我國西北沙漠與東部農(nóng)業(yè)的生態(tài)屏障，由于自然和人為原因，該地區(qū)土壤沙化和荒漠化問題嚴(yán)重，已成為退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建的重點(diǎn)區(qū)域，植被恢復(fù)與重建是荒漠化綜合防治最主要途徑［8］。在庫布齊沙地植被恢復(fù)過程中形成了自然恢復(fù)狀態(tài)下的植被群落和人工種植的植被群落類型，其中半灌木油蒿是當(dāng)?shù)胤植甲顝V泛的自然植被固沙群落，灌木中間錦雞兒是當(dāng)?shù)貜V泛種植的沙地建群種，兩種植物均是多年來被廣泛用于當(dāng)?shù)毓躺车闹脖活愋?。大量研究表明，流動沙地建立植物群落后，土壤微生物?shù)量和活性顯著提高［9］，根際土壤微生物以其獨(dú)特的環(huán)境和性質(zhì)在改善沙地土壤環(huán)境、促進(jìn)植物根系生長、參與物質(zhì)能量流動等方面發(fā)揮著重要作用［10］。不同植被恢復(fù)方式［11］、固沙植物［12］、土壤類型［13］對土壤微生物群落的影響不同。微生物種類及多寡是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，它們對環(huán)境極為敏感，又是恢復(fù)環(huán)境的先鋒，提高了生態(tài)系統(tǒng)的緩沖能力，微生物指標(biāo)已經(jīng)用來評價退化生態(tài)系統(tǒng)中生物群系與恢復(fù)功能之間的聯(lián)系并能為退化土壤恢復(fù)提供有用信息［14］。筆者前期對油蒿和中間錦雞兒群落根際和非根際土壤微生物數(shù)量、土壤理化性質(zhì)等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)植被恢復(fù)后土壤理化性質(zhì)、微生物數(shù)量均有不同程度的提高，油蒿群落對土壤的改善作用優(yōu)于中間錦雞兒群落，但對兩種植被恢復(fù)類型下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性的具體變化情況尚不明確。目前針對固沙植被根際土壤細(xì)菌群落的組成和多樣性的報道較少，且主要集中在可培養(yǎng)微生物、PCRDGGE分析等方面，傳統(tǒng)DNA測序方法耗時長且信息量少，制約著人們對土壤微生物群落深入研究，高通量測序技術(shù)具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度等優(yōu)勢。為此，本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)，以庫布齊流動沙地為對照，研究自然恢復(fù)的油蒿群落、人工種植的中間錦雞兒群落根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性，并分析土壤理化性質(zhì)對其分布的影響，為構(gòu)建庫布齊沙地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)技術(shù)體系提供科學(xué)參考和理論支持，并為庫布齊沙地相關(guān)微生物資源的研究、保護(hù)和開發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本試驗以農(nóng)業(yè)部鄂爾多斯沙地草原生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗站為研究地點(diǎn)。該區(qū)域位于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗黃河南岸的庫布齊沙帶東段，地處庫布齊沙漠和沿河平原的交界處，氣候干旱，風(fēng)沙較大，形成典型的荒漠草原干旱、半干旱的風(fēng)沙地貌。該區(qū)域?qū)儆跍貛Т箨懶詺夂颍昶骄鶜鉁?.1 ℃，最低溫度為-32.3 ℃，最高溫度為38.3 ℃，年降水量310 mm左右，而且均集中在6、7、8三個月中，夏季降水變率在33%～43%之間，地表蒸發(fā)強(qiáng)烈，全年蒸發(fā)量為2 130 mm，濕潤度為0.4，無霜期156 d。該區(qū)域植被在長期的人類活動影響下，形成天然灌叢、人工灌叢、人工草地等多種植被群落類型，主要為耐風(fēng)蝕與干旱的灌木中間錦雞兒（Caragana intermedia）、油蒿（Artemisia ordosica）、羊柴（Hedysarum mongolicum）、沙柳（Salix psammophila）、白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）等。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

本試驗在研究區(qū)選擇兩種不同的植被恢復(fù)類型：油蒿群落（Artemisia ordosica）、中間錦雞兒群落（Caragana intermedia），并以流動沙地（LS）作對照（表1）。其中，油蒿群落（YH）是研究區(qū)固定沙地自然恢復(fù)19年的植被群落；中間錦雞兒群落（ NT ）是研究區(qū)人工種植19年后形成的植被群落。文中以YH_R表示油蒿根際，NT_R表示中間錦雞兒根際，YH_S表示油蒿非根際，NT_ S表示中間錦雞兒非根際。土壤樣品于2014年8月采集，每個植被群落選擇3個樣地，在各樣地中分散設(shè)置3個區(qū)域為采樣區(qū)，每個采樣區(qū)按蛇型選取9株植物，采集0～20 cm土層根際、非根際土壤，多點(diǎn)混合，然后再將每個樣地的3個采樣區(qū)土壤樣品混合。根際、非根際土壤采集方法參考Riley和Barber［15］的抖落法，附著植物根系周圍1 cm的土壤作為根際土壤，采集離植物根系20 cm以外的土壤作為非根際土壤。將土樣分為兩部分，一部分用于土壤理化性質(zhì)測定，另一部分裝入無菌袋中包扎密封，低溫條件下帶回實(shí)驗室，于-70 ℃保存用于DNA提取。各樣地土壤理化性質(zhì)見表2。

1.3 測定方法

土壤理化性質(zhì)測定：土壤含水量采用烘干法，pH采用1∶2.5土水比浸提酸度計法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱容量法，全氮采用凱氏定氮法，速效氮采用堿解蒸餾法，全磷采用NaOH熔融―鉬銻抗比色法，有效磷采用Olsen法，速效鉀采用乙酸銨浸提―火焰光度計法測定。

細(xì)菌總DNA的提取：采用OMEGA土壤提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，用Qubit2.0檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。每個樣品3個重復(fù)，將同一樣品的土壤DNA混合，作為每份土壤樣品的總DNA。細(xì)菌的PCR擴(kuò)增采用的是16S rRNA 基因中的V3-V4高變區(qū)通用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCA）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。擴(kuò)增條件設(shè)置：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃延伸20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)。進(jìn)一步采用匹配Illumina測序接頭和標(biāo)簽引物擴(kuò)增，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat：SK8131）對DNA進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將所有樣品按照1∶1的比例進(jìn)行混合，該混合樣品可用于后續(xù)的測序，從而省去建庫過程。

表1 研究樣地基本情況Table 1 Basic information of the plots under study

表2 不同樣地土壤的基本理化性質(zhì)Table 2 Physico-chemical properties of the soils in the plots

16S rRNA V3-V4區(qū)高通量測序：16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序，測序儀器為Illlumina 公司Miseq，測序所得結(jié)果，采用prinseq軟件對reads1、reads2的3端進(jìn)行質(zhì)控，截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)序列融合比率。通過Flash 軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列。采用prinseq軟件對各個樣品進(jìn)行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用uclust軟件對序列進(jìn)行聚類，序列相似性定為0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能接近于屬。采用軟件RDP classifier進(jìn)行物種分類。采用mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析和構(gòu)建venn圖。

采用SPSS 18.0對土壤理化數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較，使用R語言分析微生物多樣性數(shù)據(jù)，運(yùn)用Canoco軟件分析環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 兩種植被恢復(fù)類型根際與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐度與多樣性

通過對V3-V4區(qū)測序，各樣地土壤樣品共獲得有效序列57 314條，平均長度為427 bp，測序覆蓋率除YH_R、NT_R樣品在65%～68%，其他樣品覆蓋率均在78%以上。由此可以得出在97%相似度下的聚類也沒有全部調(diào)查出土壤細(xì)菌遺傳多樣性，尤其是油蒿和中間錦雞兒群落根際土壤實(shí)際細(xì)菌遺傳多樣性比測序獲得的數(shù)據(jù)更豐富。但是，基于這樣的測序深度基本能夠反映該區(qū)域細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu)，可以定量比較整個群落組成和多樣性的相對差異［16］。

如表3所示，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)由高到低的順序均為：YH_R＞NT_R＞YH_S＞NT_S＞LS，Chao1指數(shù)在各樣地間差異顯著，Shannon指數(shù)在兩種植被恢復(fù)類型根際、非根際土壤間無顯著差異；ACE指數(shù)由高到低排列的結(jié)果為：YH_ R＞NT_R＞NT_S＞YH_S＞LS，各樣地間差異顯著。可以看出，LS的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)均為最低，顯著低于其他樣地。YH_R的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)為最高，NT_R次之。YH_ R與NT_R、YH_S與NT_S的Shannon指數(shù)無顯著差異。結(jié)果表明，與流沙對照相比，兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度均明顯增加，其中，油蒿根際土壤細(xì)菌群落豐度和均勻度顯著高于中間錦雞兒根際，在非根際土壤中，細(xì)菌群落豐度表現(xiàn)為油蒿高于中間錦雞兒，細(xì)菌群落均勻度表現(xiàn)為中間錦雞兒高于油蒿。在細(xì)菌群落多樣性方面兩種植被恢復(fù)類型根際、非根際土壤間沒有明顯差異。

表3 土壤樣品細(xì)菌多樣性與豐度Table 3 Diversity and richness of soil bacteria in soil sample

2.2 兩種植被恢復(fù)類型根際與非根際土壤細(xì)菌類群的相關(guān)性

為分析不同樣地土壤細(xì)菌群落組成的差異，以各樣地土壤樣品分布的OTU數(shù)為依據(jù)，用mothur軟件對各樣地土壤細(xì)菌菌種的多樣性進(jìn)行相關(guān)分析，并構(gòu)建韋恩圖（圖1）。從不同樣地土壤細(xì)菌種類多樣性的相互關(guān)系看，各樣地土壤樣品的共有OTU比例僅為10.6%～14.5%，兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌菌群中有79.7%～84.4%的OUT在LS土壤中沒有出現(xiàn)。分析兩種植被恢復(fù)類型土壤樣品相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)YH_R有66%的OTU在其他樣品中沒有出現(xiàn)，NT_R這一數(shù)值為63.6%，YH_S、NT_S這一數(shù)值分別為54.3%、57.2%。同一種植被類型內(nèi)，YH_R、NT_R分別有68.6%、66.8%的OTU與其非根際土壤無關(guān)。根據(jù)這些數(shù)值推斷，各樣地土壤細(xì)菌菌種多樣性差異比較明顯，尤其是兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌菌種多樣性與流沙對照差異較為明顯。兩種植

被恢復(fù)類型根際和非根際間土壤細(xì)菌菌群的OTU具有一定的相似性，但總體表現(xiàn)為差異顯著。其中，根際土壤細(xì)菌種類與其他環(huán)境差異更明顯。結(jié)果表明植被恢復(fù)后，土壤細(xì)菌菌種的多樣性明顯改變，尤其是根際土壤。兩種植被恢復(fù)類型根際和非根際間土壤細(xì)菌菌群有一定的相似性，但總體表現(xiàn)為差異顯著。

2.3 兩種植被恢復(fù)類型根際與非根際土壤細(xì)菌類群

在門分類水平上，各樣地土壤細(xì)菌主要包含9個類群（相對豐度＞1%），分別是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi），占據(jù)約88.67%～94.19%。還含有硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、侯選門TM7（Candidate division TM7）、侯選門OD1（Candidate division OD1）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠菌門（Chlorobi）等，相對豐度較低（相對豐度＜1%）（圖2）。此外，各樣品中還有3.96%～8.19%的菌，依據(jù)目前分類學(xué)研究無法劃分到任何菌門中。

圖1 各樣地土壤細(xì)菌OTUs venn圖Fig. 1 OTUs venn of soil bacteria in the soil samples from different plots

圖2 各樣地細(xì)菌群落在門水平上的組成和相對豐度Fig. 2 Composition at the phylum level and relative abundance of the bacterial communities in the soil samples from different plots

各樣地土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌群為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門。變形菌門在土壤樣品中的豐度最高，其中豐度比例最高的為LS，相對含量為63.69%，其次為YH_R（42.35%）和YH_S （45.08%），相對含量較少的為NT_R（34.52%）和NT_S（35.23%）。可以看出，隨著植被恢復(fù)，兩種植被恢復(fù)類型土壤中變形菌相對含量明顯減少，同時伴隨著其他微生物類群相對豐度呈不同程度增加趨勢。變形菌的4個亞群變化趨勢一致，與流沙對照相比，兩種植被恢復(fù)類型土壤α-變形菌和δ-變形菌相對含量呈增加趨勢（圖3），尤其是油蒿根際土壤中α-變形菌相對含量增加了106.46%，中間錦雞兒根際土壤中α-變形菌增加了70.60%。兩種植被恢復(fù)類型β-變形菌和γ-變形菌相對含量呈減少趨勢，尤其是γ-變形菌從LS樣地相對含量的46.53%下降至11.08%～27.41%。油蒿和中間錦雞兒根際土壤中變形菌的4個亞群分布關(guān)系均為α-＞γ-＞β-＞δ-變形菌，而兩種植被非根際、流沙對照土壤則為γ-＞α-＞β-＞δ-變形菌。

圖3 各樣品中變形菌亞群所占比例Fig. 3 Proportions of proteobacteria subgroups in the soil samples from different plots

酸桿菌門在樣品中的豐度占有較大比例，豐度比例最高的為NT_R，相對含量為23.39%，NT_S、YH_R、YH_S相對含量分別為18.88%、18.76%、17.15%，LS相對含量最低，僅為6.99%。表明隨著植被恢復(fù)，酸桿菌門明顯增加，尤其是中間錦雞兒土壤環(huán)境更有利于酸桿菌門生長，其分布與土壤pH、有機(jī)碳、全氮、碳氮比、磷、土壤水分、溫度等有關(guān)［17］；放線菌門在土壤樣品中也是優(yōu)勢菌門，因其形態(tài)多樣生理活性豐富，又能產(chǎn)生種類繁多的胞外酶和次生代謝產(chǎn)物，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。與流沙對照相比，兩種植被恢復(fù)類型土壤放線菌門所占比例呈增加趨勢，但差異較不明顯；擬桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、硝化螺旋菌門在兩種植被恢復(fù)類型土壤中所占比例總體表現(xiàn)為較流沙對照樣地有不同程度的提高。

在屬的分類水平上，假單胞菌屬（Pseudomonas）是LS、YH_R、YH_S和NT_S的優(yōu)勢分類單元，相對含量分別為42.07%、13.5%、23.94%和13.07%，在NT_R中優(yōu)勢地位不明顯（8.28%），Gp6是NT_R的優(yōu)勢菌屬（圖4）。在不同樣地土壤中還有一些豐度發(fā)生顯著變化的屬，如具有芳香化合物的生物降解作用的Sphingomonas、Sphingosinicella在油蒿根際土壤中顯著高于其他樣地，流沙對照中相對含量很少。與碳元素循環(huán)相關(guān)的Porphyrobacter，在油蒿根際中顯著高于其他樣地1.6倍至2.85倍，該屬可降解有機(jī)污染物。分屬于黏細(xì)菌的Chondromyces、Phaselicystis在油蒿根際中最高，中間錦雞兒根際次之，流沙對照中較少。黏細(xì)菌具有分解復(fù)雜有機(jī)質(zhì)（纖維素、幾丁質(zhì)、脂等）的能力；Gp6、Gp4、與磷代謝相關(guān)的芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、嗜熱能降解纖維素的Ktedonobacter屬菌群在中間錦雞兒群落相對含量最高，油蒿群落次之，流沙對照最低；氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）在流沙對照土壤中相對豐度明顯高于其他樣品。該屬細(xì)菌可降解多種有機(jī)污染物，尤其對芳烴類污染物有很好的降解作用，但利用碳水化合物能力弱，隨著植被恢復(fù)而大量減少。Escherichia、Enterococcus一般被認(rèn)為是土壤中的致病菌，從流沙對照樣地（1.86% 和0.16%）到植被恢復(fù)后逐步消失。根據(jù)數(shù)值推斷，Pseudomonas、Gp6、Gp4、Gemmatimonas、Sphingomonas、Hydrogenophaga等菌屬在植被恢復(fù)過程中有著很好的響應(yīng)，隨著植被恢復(fù)，升高或下降較為明顯。

圖4 各樣地細(xì)菌群落在屬水平上的組成和相對豐度Fig. 4 Composition at genus level and relative abundance of the bacteria communities in the soil samples from different plots

有許多研究已經(jīng)證明一些具有固氮功能的菌群，在研究區(qū)不同樣地土壤中固氮細(xì)菌群落不同，流動沙地中主要以假單胞菌屬（Pseudomonas）、硫桿菌（Thiobacillus）、固氮菌屬（Azotobacter）、芽孢桿菌（Bacillus）居多；油蒿根際土壤中有假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium），以及有其他樣地沒有檢測出的拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia ）；中間錦雞兒根際土壤中以假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）為主。固氮菌屬OTU數(shù)目總體表現(xiàn)為中間錦雞兒根際高于油蒿根際土壤；在研究區(qū)發(fā)現(xiàn)一些參與硝化作用的氨氧化細(xì)菌，僅在中間錦雞兒根際土壤中發(fā)現(xiàn)了亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）；亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）在油蒿根際最高，中間錦雞兒次之，流沙對照最低；硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）以及具有反硝化作用的生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、土微菌屬（Pedomicrobium）在中間錦雞兒根際土壤中相對含量最高，油蒿根際次之，流沙對照土壤中很少。

還有一些菌屬僅在一個樣地中發(fā)現(xiàn)，如在油蒿根際土壤中發(fā)現(xiàn)四球菌屬（Tetrasphaera）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、Pannonibacter、Patulibacter、Ferrimicrobium等菌屬；在中間錦雞兒根際土壤中發(fā)現(xiàn)硫單胞菌屬（Thiomonas）、纖發(fā)菌屬（Leptothrix）等菌屬；在流動沙地中發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）。此外，兩種植被根際、非根際土壤中還有約17.3%、15%無法劃分到目前分類學(xué)研究的菌屬中，流沙對照土壤中有7.84%無法分類的菌屬。在兩種植被恢復(fù)類型土壤中未分類的細(xì)菌幾乎成了除Pseudomonas以外的第二大類群，說明兩種植被恢復(fù)類型根際和非根際土壤中含有一定數(shù)量潛在的新種和細(xì)菌分類。

2.4 兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌群落特征與土壤理化因子的相關(guān)性

土壤理化性質(zhì)與地表植物的種類密切相關(guān)，同時對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響［18］。對研究區(qū)各樣地土壤理化因子與土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行相關(guān)分析，從表4可以看出，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量與土壤細(xì)菌群落多樣性間均有極顯著正相關(guān)關(guān)系。土壤理化因子與土壤細(xì)菌群落豐度之間的相關(guān)分析表明，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量與土壤細(xì)菌群落豐富度間均有極顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），與土壤全磷含量具有顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。通過數(shù)據(jù)推斷，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量是影響土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度的主要土壤因子，土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度隨著土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量的增加而增加。

對研究區(qū)各樣地土壤理化因子與土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群相對多度進(jìn)行相關(guān)分析（表4），得出土壤有機(jī)質(zhì)、全氮含量與變形菌門有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），速效氮、有效磷、速效鉀含量與變形菌門有顯著相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮含量與酸桿菌門呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），速效鉀含量與酸桿菌門呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。放線菌門與土壤理化因子間沒有顯著的相關(guān)性。綜合分析，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀是影響細(xì)菌優(yōu)勢類群相對多度的主要土壤因子。

表4 土壤因子相關(guān)矩陣Table 4 Correlation matrix between soil quality factors

為分析細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的關(guān)系，以細(xì)菌群落在門和綱水平上的相對豐度數(shù)據(jù)作為物種數(shù)據(jù)，土壤理化數(shù)據(jù)作為土壤環(huán)境變量，進(jìn)一步分析各樣地土壤細(xì)菌類群相對多度與土壤理化因子間的相關(guān)關(guān)系，用Canoco軟件作典型對應(yīng)分析（CCA）圖（圖5）。第一排序軸、第二排序軸解釋了細(xì)菌群落變化的78.7%和10.4%，其中第一排序軸對土壤細(xì)菌群落變化解釋最多。第一排序軸主要與土壤有機(jī)質(zhì)（r=-0.874 6）、全氮（r=-0.829 6）、全鉀（r=-0.905 7）、速效鉀（r=-0.695 7）高度相關(guān)；第二排序軸主要與土壤速效氮（r=-0.878 1）高度相關(guān)。結(jié)果表明，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀、速效鉀、速效氮含量對于研究區(qū)土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性的變化起著重要作用。

圖5 細(xì)菌群落與土壤理化因子的典型對應(yīng)分析Fig. 5 Cononical correspondence analysis（CCA）of sampling sites，soil factors and bacterial community

3 討 論

目前，庫布齊沙地植被群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)、微生物數(shù)量及生物量等方面已有比較深入的研究，但土壤微生物多樣性等方面研究較少。本研究采用高通量測序技術(shù)對兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性進(jìn)行了分析研究。從土壤樣品分布的OTU數(shù)目來看，兩種植被恢復(fù)類型與流沙對照土壤相同細(xì)菌種類不超過25%，兩種植被類型土壤相同的細(xì)菌種類不超過40%，表明植被恢復(fù)后土壤細(xì)菌菌群發(fā)生較大改變，兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌群落盡管有一定的相似性，但總體上存在較大差異。這可能是由于土壤微生物以植物根系分泌物及凋落物為養(yǎng)分，植物群落結(jié)構(gòu)的改變引起土壤有機(jī)質(zhì)變化，進(jìn)而引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變［19］。

在本研究中，用土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度指數(shù)分析土壤細(xì)菌多樣性，結(jié)果顯示，兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度較流沙對照土壤顯著增加，其中，油蒿根際土壤細(xì)菌群落豐度和均勻度顯著高于中間錦雞兒根際，但細(xì)菌多樣性在兩種植被恢復(fù)類型根際、非根際間沒有顯著差異。一般而言，在穩(wěn)定良好的生態(tài)環(huán)境中，微生物數(shù)量增加，種群豐富［20］。兩種植被恢復(fù)類型土壤細(xì)菌豐度和多樣性增加，說明植被恢復(fù)后，植物生長旺盛，地上部凋落物、根系代謝產(chǎn)物和分泌物等不斷積累，改善土壤環(huán)境，適合微生物繁殖生長。而微生物能夠釋放土壤酶，催化氧化還原、有機(jī)質(zhì)礦化、污染物降解、腐殖物質(zhì)在土壤中的合成、以及生長活性物的釋放等多種生物化學(xué)反應(yīng)［21］，因此種類繁多的微生物有益于土壤養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化，是土壤健康的標(biāo)志之一。油蒿根際土壤有著較高的土壤細(xì)菌豐度，表明不同植被恢復(fù)類型對于微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響［22］，這與油蒿根際提供了良好的微環(huán)境有關(guān)，油蒿根際具有較高的土壤有機(jī)質(zhì)、土壤含水量、氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，說明土壤細(xì)菌群落的豐度與土壤限制性資源的有效性和細(xì)菌對資源利用能力密切相關(guān)［23］。土壤細(xì)菌群落多樣性在兩種植被類型根際、非根際間沒有顯著差異，分析其原因，可能由于土壤中細(xì)菌多樣性極為豐富［24］，不僅受到土壤理化性質(zhì)影響，根際分泌物、枯落物中可能含有特殊的次級代謝產(chǎn)物等也會對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生重要影響［25］，導(dǎo)致兩種植被類型間差異不顯著。

土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性與土壤理化因子的相關(guān)分析結(jié)果指出，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量和土壤含水量是影響土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性的主要土壤因子，從CCA分析可知土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀、速效鉀、速效氮含量對于研究區(qū)土壤細(xì)菌群落遺傳多樣性的變化起著重要作用。這與Liu等［26］、尹娜［27］的研究結(jié)果相似，土壤碳、氮等營養(yǎng)元素對細(xì)菌多樣性有顯著影響。本研究中土壤細(xì)菌豐度和多樣性與土壤含水量呈極顯著正相關(guān)，有研究指出，土壤含水量是干旱、半干旱生態(tài)系統(tǒng)限制植物生長的重要因素，對土壤細(xì)菌多樣性有著重要影響［28］。對研究區(qū)各樣地土壤理化因子與土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群相對多度研究得出，變形菌門、酸桿菌門的相對多度與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量有顯著相關(guān)性，這說明土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀不僅是影響細(xì)菌多樣性的主要土壤因子，也是影響細(xì)菌優(yōu)勢類群相對多度的主要土壤因子。

按照細(xì)菌各類群所占比例，將土壤細(xì)菌菌群分為優(yōu)勢類群、常見類群和稀有類群。本研究中，在門分類水平上，各樣地土壤細(xì)菌以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌群，其中變形菌門豐度最高。這與韓亞飛等［29］、Zhang等［30］的研究相一致。與流沙對照比較，油蒿、中間錦雞兒群落土壤中變形菌相對豐度在逐漸降低，同時伴隨著其他微生物類群的出現(xiàn)及相對豐度增加。值得關(guān)注的是，在植被恢復(fù)過程中，變形菌的亞群分布發(fā)生了變化，γ-變形菌從LS樣地相對含量的46.53%下降至11.08%～27.41%，α-變形菌相對含量在油蒿和中間錦雞兒群落根際土壤中明顯增加，自然恢復(fù)的油蒿群落根際土壤對α-變形菌恢復(fù)效果最為明顯。這與陳香碧等［31］發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)大大增加了α-變形菌比例的研究結(jié)果相一致。Janssen［32］研究指出，豐富的α-變形菌可能與高營養(yǎng)狀態(tài)的土壤有關(guān)，柳春林等［33］也認(rèn)為土壤有機(jī)質(zhì)及全氮含量高與土壤中含有較多的α-變形菌有關(guān)。尹娜［27］研究得出土壤有機(jī)碳含量對α-變形菌相對多度有正向促進(jìn)作用。

在屬分類水平上，假單胞菌屬是研究區(qū)域的優(yōu)勢分類單元，從流沙對照（42.07%）到植被恢復(fù)（8.28%～23.94%），有較好的響應(yīng)。假單胞菌廣泛存在于土壤、水、植物及動物活動環(huán)境中，營養(yǎng)要求低，絕大多數(shù)不需要生長因子，且代謝類型多，代謝能力強(qiáng)，能利用多種碳源和氮源底物，因此，能適應(yīng)不同的環(huán)境。在生物防治和生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用方面有巨大的潛力［34］。該屬異質(zhì)性很強(qiáng)，也有很多致病種。具有固氮功能的菌群在各樣地中表現(xiàn)為中間錦雞兒根際高于油蒿根際土壤，流沙對照最低。結(jié)果表明植被恢復(fù)過程中，固氮菌種類發(fā)生了變化，中間錦雞兒根際固氮菌具有較為豐富的遺傳多樣性，這可能與能與豆科植物建立固氮共生體系的根瘤菌有關(guān)。在土壤中重要的固氮菌類群如固氮螺菌屬（Azospirillum）在樣地中均未發(fā)現(xiàn)。

目前報道的具有解磷作用的微生物有：芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞桿菌（Pseudomonas）、黃桿菌（Flavobacterium）、固氮菌（Azotobacter）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、節(jié)細(xì)菌（Arthrobacter）、硫桿菌（Thiobacillus）、埃希氏菌（Escherichia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）［35］。研究區(qū)流動沙地中解磷菌較為豐富，假單胞桿菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、節(jié)細(xì)菌（Arthrobacter）、硫桿菌（Thiobacillus）為主，而YH_R中以黃桿菌（Flavobacterium）、中慢生根瘤菌（Mesorhizobium）為主，NT_R中以慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌（Mesorhizobium）為主。從目前報道的具有解磷作用的微生物類群來看，兩種植被恢復(fù)類型解磷菌趨于單一化，且相對含量較少。解磷細(xì)菌受土壤類型、植物類型、植物生育期及長勢、環(huán)境因素和微生物的相互作用等影響［36-37］，土壤中磷源不同，其微生物種類也不盡相同，也可能受限于目前已知的具有解磷作用的微生物類群，有待進(jìn)一步研究。

綜合分析，與流沙對照相比，庫布齊沙地兩種植被恢復(fù)類型對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性均產(chǎn)生了影響，發(fā)生了較大變化。兩種植被恢復(fù)類型對細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了正效應(yīng)，細(xì)菌群落總數(shù)和多樣性明顯增加。其中，自然恢復(fù)的油蒿群落土壤細(xì)菌豐度高于人工種植的中間錦雞兒群落。兩種植被恢復(fù)類型根際土壤α-變形菌明顯增加，油蒿根際對α-變形菌的恢復(fù)效果尤為明顯。從細(xì)菌類群來看，植被恢復(fù)明顯改變了流動沙地的菌群結(jié)構(gòu)，細(xì)菌菌群從流動沙地較為單一的結(jié)構(gòu)，隨著植被恢復(fù)，優(yōu)勢菌屬豐度在逐漸降低，同時伴隨著其他微生物類群出現(xiàn)，很多與碳循環(huán)、光合作用、降解作用、硝化和反硝化作用、固氮、分解復(fù)雜有機(jī)物和纖維素等菌群呈顯著增加趨勢，其中一些參與碳循環(huán)、光合作用、分解復(fù)雜有機(jī)質(zhì)、降解等過程的菌群豐度總體表現(xiàn)為油蒿根際高于中間錦雞兒根際，而中間錦雞兒群落根際土壤固氮、硝化作用菌群較為豐富。此外，在流動沙地中發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌、腸球菌等動植物致病菌，相對含量隨著植被恢復(fù)顯著減少，在油蒿根際土壤中未出現(xiàn)，說明植被恢復(fù)尤其是自然恢復(fù)的植被類型抑制了致病菌的生長?？傮w而言，植被恢復(fù)改變了流動沙地土壤較為單一的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，尤其是自然恢復(fù)的油蒿群落在增加土壤細(xì)菌群落豐度，促進(jìn)有益菌群生長，抑制致病菌群等方面表現(xiàn)更優(yōu)?？梢?，沙地土壤中蘊(yùn)含著不同微生物種群，可為功能微生物的發(fā)掘與篩選提供微生物來源。

4 結(jié) 論

與流沙對照相比，兩種植被恢復(fù)類型對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生了正效應(yīng)，細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度明顯增加。其中，自然恢復(fù)的油蒿群落土壤細(xì)菌豐度高于人工種植的中間錦雞兒群落。變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌類群，其中變形菌門在各樣地豐度比例最高，隨著植被恢復(fù)，兩種植被恢復(fù)類型土壤中變形菌相對含量明顯減少，同時伴隨著其他微生物類群相對豐度呈不同程度增加趨勢。α-變形菌相對含量在油蒿和中間錦雞兒群落根際土壤中明顯增加，尤其是自然恢復(fù)的油蒿群落根際土壤中α-變形菌得到了很好的恢復(fù)。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效鉀含量對于研究區(qū)土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性、優(yōu)勢類群相對多度、遺傳多樣性的變化起著重要作用。

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Soil Bacteria Diversity in Rhizosphere under Two Types of Vegetation Restoration Based on High Throughput Sequencing

DAI Yating1，2YAN Zhijian1XIE Jihong1WU Hongxin1XU Linbo1HOU Xiangyang1，2?GAO Li1，2CUI Yanwei1
（1 Grassland Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010010，China）
（2 Key Laboratory of Grassland Ecology and Restovation，Ministry of Agriculture，Huhhot 010010，China）

【Objective】Artemisia ordosica and Caragana intermedia are the two widely-distributed and efficient sand-fixing shrubs in the Hobq Desert that have

considerable attention because of the roles they may play in the vegetation restoration. Soil bacteria diversity is an important indicator of the state of soil microbial communities and one indicating progress of ecological restoration. This project is oriented to study changes in community structure and diversity of soil bacteria in the process of vegetation and ecological restoration in the Hobq Desert relative to type of vegetation.【Method】In this study，two types of vegetations，naturally restored Artemisia ordosica and artificially planted Caragana intermedia，were chosen for comparison to see effects of the vegetations on community structure and diversity of soil bacteria with a tract of moving sand land as control. The sample plots were set up in 1995 and soil samples were collected from the rhizospheres of A. ordosica and C. intermedia and bulk soil in the 0～20 cm soil layer and CK in August 2014 for analysis of soil bacteria diversity using the high throughput sequencing method. And relationship between soil bacterial diversity and soil physic-chemical properties，and the effect of soil physical and chemical properties on distribution of bacterial community were also studied through canonical correlation analysis and cononical correspondence analysis.【Result】（1）Chao1 index，Shannon index and ACE index are important indicators of soil bacterial diversity and richness. In terms of Chao1 index and Shannon index，the sample plots displayed an order of rhizosphere soil of A. ordosica ＞ rhizosphere soil of C. intermedia ＞ non-rhizosphere soil of A. ordosica ＞ non-rhizosphere soil of C. intermedia ＞ soil of CK，while in terms of ACE index，they followed another order：rhizosphere soil of A. ordosica ＞ rhizosphere soil of C. intermedia ＞ non-rhizosphere soil of C. intermedia ＞ non-rhizosphere soil of A. ordosica ＞ soil of CK．（2）Classification at the phylum level shows the bacterial communities in the samples were mainly composed of Proteobacteria，Acidobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes，Gemmatimonadetes，Planctomycetes，Verrucomicrobia，F(xiàn)irmicutes and Chloroflexi，accounting for 88.67%～94.19%. Proteobacteria，Acidobacteria and Actinobacteria were the dominant bacterial groups in the samples，and Proteobacteria was the highest in abundance. The four subgroups under Proteobacteria followed a similar trend in variation. Relative abundance of α-proteobacteria in the rhizosphere and bulk soils under either vegetation exhibited a sharply rising trend，increasing in the rhizosphere of A. ordosica and C. intermedia increased by 106.46% and 70.60% respectively.（3）Soil organic matter，total N，total K，readily available N，readily available K，and soil water are the main soil factors affecting abundance and diversity of soil bacteria communities. Correlation analysis of soil physic-chemical properties with relative abundance of dominant soil bacteria groups shows that the abundance of Proteobacteria was significantly related to soil organic matter，total N，readily available N，readily available P，and readily available K，while the abundance of Acidobacteria was to soil organic matter，total N，readily available N，readily available P andreadily available K. Intrestingly，the abundance of Actinobacteria was not so much related to soil factors. Cononical correspondence analysis indicates that soil organic matter，total N，total K，readily available K and readily available N play an important role in triggering variation of genetic diversity of the bacterial communities in the soils.【Conclusion】Results show that compared to moving sand land，the two tracts of lands with vegetation restored have demonstrated positive effects on community structure and diversity of soil bacteria，whose abundance，diversity and evenness have been significantlt improved. Between the two types of vegetation restoration，the naturally restored A. ordosica vegetation was higher than the artificially plated C. intermedia vegetation in effect increasing abundance of soil bacterial community. Bacterial community in the untreated soil is quite simple in structure. The restoration of vegetation enriches soil microbial groups，making the community of soil bacteria diversified in the rhizosphere and non-rhizosphere soils. Relative abundance of a-proteobacteria under the vegetation of A. ordosica and C. intermedia significantly increased，especially under the vegetation of A. ordosica.

Rhizosphere soil；Bacterial community diversity；High throughput sequencing

S15

A

（責(zé)任編輯：陳德明）

* 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2014CB138806）和中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目（1610332014026 ）資助 Supported by the National Basic Research Program of China（973 Program）（No. 2014CB138806）and the Fundamental Research Funds for the Central Public Research Institutes（No. 1610332014026）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：houxy16@126.com

戴雅婷（1983—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士，助理研究員，主要從事土壤生態(tài)、微生物生態(tài)研究。E-mail：daiyating1983@163.com

2016-03-15；

2017-02-23；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2017-03-01

10.11766/trxb201603150062