余甘根苷B對(duì)柯薩奇病毒B3感染的心肌細(xì)胞及Balb/c小鼠的保護(hù)作用*

王鵬舉，彭有梅，張 艷，江金花，范程程，婁曉月，陳文娟，王亞峰#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中英分子腫瘤學(xué)研究中心 鄭州 450052 2)河南省(鄭州大學(xué))醫(yī)藥科學(xué)研究院河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理學(xué)系 鄭州 450001

余甘根苷B對(duì)柯薩奇病毒B3感染的心肌細(xì)胞及Balb/c小鼠的保護(hù)作用*

王鵬舉1)，彭有梅2)，張 艷2)，江金花2)，范程程3)，婁曉月3)，陳文娟3)，王亞峰3)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中英分子腫瘤學(xué)研究中心 鄭州 450052 2)河南省(鄭州大學(xué))醫(yī)藥科學(xué)研究院河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理學(xué)系 鄭州 450001

#通信作者，女，1980年5月生，博士，講師，研究方向：抗病毒藥理，E-mail:yfwang@zzu.edu.cn

余甘根苷B；柯薩奇病毒B3；心肌細(xì)胞

目的：探討余甘根苷B對(duì)柯薩奇病毒B3(CVB3)感染的心肌細(xì)胞及Balb/c小鼠的保護(hù)作用。方法：首先構(gòu)建CVB3感染的心肌細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，觀察心肌細(xì)胞的病變效應(yīng)，檢測(cè)心肌細(xì)胞上清液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的變化，并通過電子顯微鏡觀察小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)余甘根苷B對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果：在CVB3感染的心肌細(xì)胞模型中，CVB3感染可引起細(xì)胞發(fā)生碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象，余甘根苷B作用后，可以顯著減輕細(xì)胞病變，同時(shí)能明顯抑制細(xì)胞釋放的心肌酶AST和LDH的活性(P<0.05)；在CVB3感染的小鼠模型中，小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，CVB3感染能引起心肌纖維斷裂溶解、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破壞等病理損傷，余甘根苷B 則能減輕CVB3感染造成的心肌組織的損傷。結(jié)論：余甘根苷B對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞和Balb/c小鼠具有明顯的保護(hù)作用。

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染所引起的一類非缺血性心臟病，引起VMC的病毒種類很多，但大部分VMC是由柯薩奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)感染引起[1]，嚴(yán)重者可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭，甚至猝死，目前臨床上尚缺乏安全有效的抗CVB3藥物。余甘根苷B是從余甘子根中提取分離出的一個(gè)全新的倍半萜類化合物[2]，在前期研究[3]中已初步證明余甘根苷B具有很好的抗CVB3活性。該研究通過觀察余甘根苷B對(duì)心肌的保護(hù)作用，確定余甘根苷B的抗病毒活性，為進(jìn)一步的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 余甘根苷B(中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所提供)，純度在98.5%以上，實(shí)驗(yàn)時(shí)溶于一定量DMSO配制成母液，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，病毒唑購(gòu)自河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)試盒和乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、病毒和動(dòng)物 HeLa細(xì)胞株和CVB3(Nancy株)病毒由暨南大學(xué)王一飛教授惠贈(zèng)；原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞[來自新生1～3 d的SD大鼠乳鼠心臟，通過胰蛋白酶消化分離法分離得到。SPF級(jí)新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：SCXK(豫)2015-0004]；SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.3 余甘根苷B對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

1.3.1 乳鼠原代心肌細(xì)胞的制備[4]將新生1～3 d SD大鼠乳鼠的心臟取出，心尖部剪成約1 mm3大小的組織碎塊。加入1 g/L的胰蛋白酶溶液消化(共消化7次)，收集后5次消化液中的細(xì)胞放置到培養(yǎng)瓶中。由于成纖維細(xì)胞貼壁速度比心肌細(xì)胞快，貼壁培養(yǎng)1 h后大部分成纖維細(xì)胞已經(jīng)貼壁，而心肌細(xì)胞仍分布在上清懸液中，隨后將上清懸液吸出并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105mL-1，將得到的心肌細(xì)胞加到培養(yǎng)板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，長(zhǎng)成單層并且細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 余甘根苷B對(duì)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞毒性的檢測(cè) 將系列稀釋的余甘根苷B分組加入到已長(zhǎng)成單層的原代心肌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)病毒唑陽性藥對(duì)照(病毒唑?qū)φ战M)和未加藥的正常對(duì)照組，將培養(yǎng)板于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，確定實(shí)驗(yàn)樣品無毒濃度范圍(使細(xì)胞不發(fā)生明顯毒性反應(yīng)的濃度范圍)，即最大無毒濃度TC0。

1.3.3 余甘根苷B體外抗CVB3活性實(shí)驗(yàn) 分離出的心肌細(xì)胞重懸后接種于96孔板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后將余甘根苷B和CVB3稀釋液各50 μL分組加入板中，同時(shí)另設(shè)正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組和病毒唑?qū)φ战M(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。每日觀察細(xì)胞病變情況，待病毒對(duì)照組75%以上的細(xì)胞發(fā)生病變，而正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完全正常時(shí)作為檢測(cè)點(diǎn)結(jié)束培養(yǎng)，將各組的細(xì)胞上清液收集，檢測(cè)上清液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。

1.4 余甘根苷B對(duì)CVB3感染的小鼠心肌的保護(hù)作用

1.4.1 動(dòng)物模型的建立及治療 采用隨機(jī)數(shù)字表法將雄性Balb/c小鼠分為6組(每組各10只)：正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、余甘根苷B高劑量組[12 mg/(kg·d)]、余甘根苷B中劑量組[8 mg/(kg·d)]、余甘根苷B低劑量組[4 mg/(kg·d)]和病毒唑?qū)φ战M[125 mg/(kg·d)]。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均腹腔注射100 TCID50CVB3病毒液，建立VMC小鼠模型。在小鼠接種病毒24 h后開始給藥，采取小鼠尾靜脈注射給藥的方式，給藥量為每只小鼠0.2 mL/10 g，而正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組小鼠每日給予等體積生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥1次/d，連續(xù)處理7 d，于感染后第8天斷頸處死動(dòng)物。

1.4.2 余甘根苷B作用后VMC小鼠心肌電鏡病理組織學(xué)檢測(cè) 在連續(xù)用藥7 d后，即感染后第8天，斷頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從心臟取1 mm3的組織塊， 體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛和10 g/L鋨酸雙重固定，經(jīng)過一系列處理后，將處理好的切片置透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組心肌酶釋放量的不同，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 余甘根苷B對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

2.1.1 余甘根苷B的對(duì)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞毒性測(cè)定 系列稀釋的余甘根苷B作用心肌細(xì)胞48 h后，正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)正常，比較透明；高濃度余甘根苷B對(duì)細(xì)胞的毒性較大，表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變(固縮或破碎)，細(xì)胞吸光度下降，出現(xiàn)脫落、死亡；隨著余甘根苷B濃度的降低，對(duì)細(xì)胞的毒性反應(yīng)逐漸減輕，在余甘根苷B無毒濃度時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞在形態(tài)和數(shù)量上沒有差別。經(jīng)檢測(cè)得到余甘根苷B及病毒唑?qū)υ囵B(yǎng)的SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的TC0分別為25 mg/L和250 mg/L。

2.1.2 余甘根苷B 對(duì)CVB3感染原代心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 CVB3感染SD大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞后，可使細(xì)胞搏動(dòng)逐漸減慢甚至停止搏動(dòng)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞變圓、團(tuán)縮、碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象。余甘根苷B作用后，CVB3感染導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的病變程度明顯減輕，結(jié)果見圖1。

A：正常對(duì)照組；B：病毒對(duì)照組；C：余甘根苷B組；D：病毒唑?qū)φ战M。圖1 余甘根苷B對(duì)CVB3感染心肌細(xì)胞的保護(hù)作用(×100)

2.1.3 余甘根苷B對(duì)CVB3感染心肌細(xì)胞心肌酶釋放量的影響 余甘根苷B作用后，與病毒對(duì)照組相比，余甘根苷B組的上清液中AST和LDH的表達(dá)量明顯降低，結(jié)果見表1。說明余甘根苷B作用后，可以抑制CVB3感染引起的心肌細(xì)胞酶的釋放，使CVB3感染造成的心肌細(xì)胞損傷程度降低，對(duì)VMC起到很好的治療作用。

表1 各實(shí)驗(yàn)組心肌酶釋放量的檢測(cè)(n=3) IU/L

*：與病毒對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 余甘根苷B對(duì)CVB3感染的小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變 通過對(duì)小鼠心肌組織透射電鏡結(jié)果(圖2、3)觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無明顯改變，肌纖維完整，彼此平行排列，明暗帶周圍結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布。病毒對(duì)照組在CVB3作用下，小鼠心肌細(xì)胞肌絲溶解斷裂，肌纖維破壞，排列紊亂，明暗帶模糊甚至消失，線粒體結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)破壞，核染色質(zhì)濃縮，集中分布在核膜周邊。與病毒對(duì)照組相比，余甘根苷B高、中劑量組中由CVB3感染造成的心肌損傷明顯減輕，肌纖維連貫，明暗帶清晰，線粒體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)分布均勻。

A：正常對(duì)照組；B：病毒對(duì)照組；C：病毒唑?qū)φ战M；D：余甘根苷B高劑量組；E：余甘根苷B中劑量組；F：余甘根苷B低劑量組。圖2 各組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化(×10 000)

A：正常對(duì)照組；B：病毒對(duì)照組；C：病毒唑?qū)φ战M；D：余甘根苷B高劑量組；E：余甘根苷B中劑量組；F：余甘根苷B低劑量組。圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)變化(×20 000)

3 討論

臨床上大多數(shù)VMC是由CVB3感染所致，初期癥狀不明顯，多表現(xiàn)為病毒感染所引起的一般癥狀，不具有特異性，常見的如發(fā)熱、胸痛、全身倦怠、酸痛等，常常不引起患者的注意，從而使一部分患者發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病[5-6]，而擴(kuò)張型心肌病5 a生存率約為50%左右，后期會(huì)發(fā)展為心力衰竭、心源性休克，甚至猝死。對(duì)它的研究及藥物研發(fā)越來越顯示出其重要的地位。

近年來，在治療VMC方面取得了一些進(jìn)展[7-10]。余甘子是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，其根、葉、果都具有重要的藥用價(jià)值，已發(fā)現(xiàn)余甘子具有抗菌[11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13]等活性。

在VMC的發(fā)病早期，臨床上由于缺乏特異性的診斷標(biāo)準(zhǔn)，一般采用檢測(cè)心肌酶的表達(dá)水平來間接檢測(cè)心肌細(xì)胞的損傷程度，LDH和AST是診斷VMC的標(biāo)志性心肌酶[14]。該研究中，作者檢測(cè)了CVB3感染的乳鼠心肌細(xì)胞上清液中的心肌酶水平，發(fā)現(xiàn)CVB3感染后，與正常對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，上清液中LDH和AST表達(dá)水平明顯升高，在余甘根苷B作用后，與病毒對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞的細(xì)胞病變明顯減輕，上清液中心肌酶的活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明余甘根苷B可以減輕CVB3感染所造成的心肌細(xì)胞損傷，維持心肌細(xì)胞的正常功能，對(duì)心肌細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。

在CVB3感染的Balb/c小鼠模型中，對(duì)小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步的觀察，發(fā)現(xiàn)CVB3感染后，和正常對(duì)照組相比，小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的損傷性改變。表現(xiàn)為心肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)被破壞，具體可表現(xiàn)為肌絲溶解、斷裂，肌原纖維明暗帶正常結(jié)構(gòu)消失，線粒體損傷，細(xì)胞核表現(xiàn)為核膜結(jié)構(gòu)破壞，染色質(zhì)凝集。而余甘根苷B 作用后，高、中劑量組中CVB3感染造成的心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，心肌肌纖維結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，排列整齊，明暗帶清晰，細(xì)胞核核膜完整，染色質(zhì)分布均勻；低劑量組余甘根苷B作用后沒有明顯改善CVB3感染造成的心肌損傷。

綜上所述，余甘根苷B在體外和體內(nèi)均可以明顯抑制CVB3的感染，減輕CVB3感染造成的心肌損傷，維持心肌組織的正常功能，從而起到治療VMC的作用，且治療作用與陽性藥物病毒唑相似，為治療VMC提供了一個(gè)很好的候選藥物。

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(2016-12-29收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Protection effect of phyllaemblicin B on coxsackie virus B3 infected myocardiocytes and Balb/c mice

WANGPengju1),PENGYoumei2),ZHANGYan2),JIANGJinhua2),FANChengcheng3),LOUXiaoyue3),CHENWenjuan3),WANGYafeng3)

1)Sino-BritishResearchCentreforMolecularOncology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)HenanKeyLaboratoryforPharmacologyofLiverDiseases,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofClinicalpharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

phyllaemblicin B；coxsackie virus B3；myocardiocyte

Aim: To investigate the protection effect of phyllaemblicin B on myocardiocytes and Balb/c mice infected with coxsackie virus B3(CVB3).Methods: Viral myocarditis(VMC) models infected with CVB3 were established in myocardiocytes and Balb/c mice. Cell survival rate was measured by cytopathic effect(CPE) assay, the contents of aspartate transferase(AST) and lactate dehydrogenase(LDH) were determined in supernatant of myocardiocytes culture medium. Histopathological changes of myocardium of Balb/c mice infected with CVB3 were analyzed to test the antiviral activity of phyllaemblicin B. Results: CVB3 infection induced obvious CPE in myocardiocytesinvitro. After treatment with phyllaemblicin B, CPE on myocardiocytes infected with CVB3 was obviously inhibited, meanwhile the activities of AST and LDH were dramatically reduced compare with the untreatment group(P<0.05). Ultra-structure of mouse myocardium demonstrated that CVB3 infection led to pathological lesions including cardiac muscle fibers breakdown and destruction of nucleus structure. With the treatment of phyllaemblicin B, the histopathology changes in mice myocardium were alleviated.Conclusion: Phyllaemblicin B has obvious protection effect on myocardiocytes and Balb/c mice infected with CVB3.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.006

*國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目 81302813

R285.5