氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定牛乳中多種農(nóng)藥殘留物定量方法的研究

黃 佩，趙建國

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定牛乳中多種農(nóng)藥殘留物定量方法的研究

黃 佩1，趙建國2

(1.四川省地質(zhì)礦產(chǎn)勘察開發(fā)局成都綜合巖礦測試中心，成都610081；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢測中心， 哈爾濱150090)

本文確定了牛乳中檢測的52種農(nóng)藥殘留污染物。利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS），建立了52種農(nóng)藥殘留污染物在牛乳中的分析方法。本文方法改進(jìn)在于：通過農(nóng)藥殘留的傳播途徑和在牛體內(nèi)的代謝方式，確定了牛乳中可能存在的52種農(nóng)藥殘留污染物，大大縮小了牛乳中農(nóng)藥殘留污染物的篩查范圍；簡化了分組測定，實現(xiàn)一次處理樣品，一次進(jìn)樣，可完成52種農(nóng)殘組分的同時測定，簡化了其它方法分組測定方式，極大地提高了檢測效率和檢測通量；對氣相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化（進(jìn)樣口溫度對52種不同組分靈敏度的影響），對質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化（SRM多選擇離子的確定，最佳碰撞能量的確定）。比較了不同樣品凈化方法對回收率的影響（C18固相小柱萃取法和固相分散萃取法），最終確定C18固相小柱萃取法凈化樣品。本方法結(jié)果表明，本方法52種農(nóng)殘在相應(yīng)的添加水平下，平均加標(biāo)回收率（n=6）為60.5%～111.5%，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.94%～9.67%，方法的檢出限（S/N=3）為0.0007～0.013mg/kg。本文為生鮮牛乳的農(nóng)藥殘留指標(biāo)評價提供了一種簡便﹑實用的檢測方法。采用本方法測定500個不同地域的生鮮牛乳樣品，收到了良好的效果。

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；同時測定；52種農(nóng)藥殘留；牛乳

隨著人們生活水平的提高，食品安全日益成為人們關(guān)注的內(nèi)容，而隨著乳和乳制品進(jìn)入人們飲食的同時，對乳品安全就成為關(guān)注的重點(diǎn)。目前農(nóng)藥種類繁多，建立一種有效的多組分農(nóng)藥殘留的分析方法，檢驗評價生鮮牛乳中農(nóng)藥殘留污染物的污染情況，十分必要。通過有效的檢測方法，才能正確判斷我國生鮮牛乳的農(nóng)藥殘留污染現(xiàn)狀，為保證我國乳品安全奠定基礎(chǔ)。

農(nóng)藥對食品安全的影響[1]，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，每年全世界有150多萬人死于食物源性致病因子所致的腹瀉相關(guān)的疾病。食品安全已成為影響廣泛而深遠(yuǎn)的社會問題，農(nóng)藥殘留污染扮演著十分重要的角色。食品中的農(nóng)藥殘留一般來自三個方面：一是施藥后對作物的直接污染，二是作物在污染的環(huán)境中對農(nóng)藥的吸收，三是食物鏈與生物富集效應(yīng)（如牛奶中的農(nóng)藥殘留與牛食用被污染的飼料的相關(guān)性）。

農(nóng)藥對乳品安全的影響，近年來我國人均乳消費(fèi)量達(dá)到13.5kg(2013年統(tǒng)計)以上，發(fā)展安全牛奶和提高乳制品的質(zhì)量安全已經(jīng)變得十分重要。其中隨著農(nóng)藥對環(huán)境和飼料的污染，存在間接影響乳制品的質(zhì)量安全。曾經(jīng)有人做過農(nóng)殘?zhí)砑釉囼?，考查添加的農(nóng)殘在加工后各類乳產(chǎn)品中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乳制品中奶油的農(nóng)藥殘留量較高，干酪次之，巴氏殺菌乳﹑煉乳﹑滅菌乳﹑乳粉這類加熱強(qiáng)度相當(dāng)?shù)娜橹破?，其農(nóng)殘水平為中等，而乳清粉﹑乳糖用乳清部分生產(chǎn)的乳制品農(nóng)殘量最低。

目前，檢測食品中農(nóng)藥殘留的方法主要為氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法。前者使用儀器成本低，但由于所用方法種類繁多，檢測通量和檢測效率比較低，不便于多組分的同時測定，并且定性的可靠性較氣質(zhì)聯(lián)用法差。按照當(dāng)前的發(fā)展趨勢，使用高通量的樣品提取﹑凈化方法，用氣質(zhì)聯(lián)用儀[2-3]檢測乳及乳制品中的農(nóng)藥殘留將成為主要手段。

本文采用乙腈提取，固相萃取柱凈化，一次性不分組測定牛乳中53種農(nóng)藥殘留物，采用基質(zhì)標(biāo)加內(nèi)標(biāo)，定性﹑定量快速準(zhǔn)確，檢出限低，方法可靠，能夠滿足牛乳中多組分農(nóng)藥殘留物的分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛(Thermo)TRACE1310氣相色譜儀,GC-MS/MS TSQ 8000質(zhì)譜儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；超聲波振蕩器，漩渦振蕩器，氮吹儀。

乙腈，甲苯(色譜純，J＆K科技有限公司)，48種農(nóng)殘及內(nèi)標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所)，C18（500mg/6mL）固相萃取柱（上海安普），ODS和PSA固相萃取分散劑（天津科密歐），無水硫酸鎂（AR，天津科密歐）﹑氯化鈉(AR，天津科密歐)。

牛乳空白樣品，從市場購買，經(jīng)檢測不含有所測定的53種農(nóng)殘。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器參考條件

載氣流速：1.2mL/min

柱箱程序升溫：初始溫度40℃→保持1.5min→25℃/ min→90℃，保持1.5min→25℃/min →180℃，保持0min→5℃/ min→280℃，保持0min→10℃/min→300℃，保持5min。

進(jìn)樣方式：脈沖不分流進(jìn)樣。

進(jìn)樣量：0.5μμL。

分流流速：30mL/min。

分流時間：0.8min。

脈沖壓力250kPa。

EI+電離源。

離子源溫度：300℃。

傳輸線溫度：280℃。

碰撞氣：氬氣。

掃描模式：SRM多選擇離子模式。

發(fā)射電流：25μA。

1.2.2 組分進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化方法

使用同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液進(jìn)樣，做進(jìn)樣溫度～響應(yīng)值曲線（從230℃～280℃）。

1.2.3 兩種樣品的前處理方法

樣品處理方法[4-12]，方法1為固相分散萃取法：以15g（±0.2g）牛乳為樣品于50mL離心管中，加入20乙腈，4g硫酸鎂，1g氯化鈉，劇烈振搖10min，再超聲10min，4200轉(zhuǎn)/ min離心5min，吸取上清液于100mL蒸發(fā)瓶中，再用20mL乙腈提取一次，合并提取液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5mL，用5mL正己烷交換兩次。最后加入2mL甲苯，40μL內(nèi)標(biāo)，超聲混合均勻后，250mgPSA和200mgODS吸附劑，超聲混合均勻后，過0.45μm濾膜，上機(jī)。

牛奶﹑原料乳等液態(tài)奶制品：稱取15g樣品(±0.2g)于50mL具塞離心管中，加入20mL乙腈，1g氯化鈉，4g硫酸鎂，劇烈震蕩10min, 4200轉(zhuǎn)/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液到蒸發(fā)瓶中，再次用20mL乙腈提取殘留物，同樣離心后合并離心液。在40℃溫度下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到約0.5ml。用C18固相萃取小凈化濃縮液，乙腈洗脫，正己烷交換兩次，加入內(nèi)標(biāo)后上機(jī)測定。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化（圖1～圖5）

由于進(jìn)樣的組分比較多，這些組分的氣化溫度就存在比較大的差異，在其同時存在下，測定其不同溫度下的響應(yīng)值，最終確定一個通用的進(jìn)樣口溫度，最大限度地保證53種農(nóng)殘組分的測定靈敏度。以下是進(jìn)樣口溫度-響應(yīng)值曲線圖：圖（1）～（5）。從圖（1）中，隨著溫度升高（從230℃～280℃），乙酰甲胺磷和久效磷的響應(yīng)值下降較多，尤其是乙酰甲胺磷靈敏度降低達(dá)到40%，久效磷下降達(dá)到25%。其它組 分靈敏度隨著進(jìn)樣口溫度的升高的下降和上升的幅度均變化不大。最終確定進(jìn)樣口溫度為270℃。

圖1 甲胺磷等12種組分進(jìn)樣口溫度～響應(yīng)值趨勢圖

隨著進(jìn)樣口溫度從230℃升高到280℃，乙酰甲胺磷和久效磷的響應(yīng)值有較大幅度的降低，分別降低了約40%和25%，其它10種組分的響應(yīng)值下降不明顯。

圖2～圖4除咪酰胺外，其它41種組分的進(jìn)樣口溫度對其響應(yīng)值的影響并不明顯，最后確定最佳進(jìn)樣口溫度為270℃。

2.2 定性、定量離子對和碰撞能量的優(yōu)化

通過儀器AUTOSRM的優(yōu)化方式，選擇各個組分的最佳子離子和最佳碰撞能量（干擾少，靈敏度高的子離子）。最終確定的定性定量離子見表1。

圖2 二嗪磷等10種組分進(jìn)樣口溫度～-響應(yīng)值趨勢圖

圖4 硫丹硫酸鹽等10種組分進(jìn)樣口溫度～響應(yīng)值趨勢圖

圖5 溴氰菊酯等10種組分進(jìn)樣口溫度～響應(yīng)值趨勢圖

2.3 兩種樣品前處理方法加標(biāo)回收率的比較

通過測定52種農(nóng)殘組分的用以上兩種方法測定的加標(biāo)回收率，得出方法2的回收率明顯比方法1高，采用固相分散萃取法凈化，甲胺磷﹑乙酰甲胺磷﹑敵敵畏﹑甲萘威﹑久效磷﹑甲霜靈﹑抗蚜威﹑丙環(huán)唑和咪酰胺的回收率偏低。兩種方法的加標(biāo)回收率見下表2。

從以上回收率的分析可以得出，方法2采用的C18固相萃取小柱凈化方法的回收率明顯好于固相分散萃取方法。

2.4 多種農(nóng)藥組分的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

本方法用甲苯-丙酮配成農(nóng)藥組分的混標(biāo)，以環(huán)氧七氯為內(nèi)標(biāo)物，以農(nóng)藥的質(zhì)量濃度對農(nóng)藥峰面積與環(huán)氧七氯峰面積的比值進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，所選定農(nóng)藥在20～2000ng/ mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，方法的檢出限在0.0002mg/ kg～0.022mg/kg之間。方法中所測定組分的保留時間﹑線性回歸方程﹑相關(guān)系數(shù)和檢出限見表3。

表1 目標(biāo)組分的定性、定量離子對及最佳碰撞能量

?

2.5 方法的回收率和精密度

見表2，在給出的添加量下，方法的回收率為60.5～121.0%，方法的重現(xiàn)性為1.49%～7.08%。能很好地滿足牛乳中多種農(nóng)殘組分的分析要求。

表2 兩種樣品前處理方法加標(biāo)回收率的比較

?

2.6 多種農(nóng)藥組分的分離測定情況

在表1所確定的離子對和碰撞能量條件下，該52種農(nóng)藥組分能夠很好的分離，其質(zhì)譜圖如下圖6：

圖6 52種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性定量離子圖

在這52種農(nóng)殘組分中，有9組組分存在保留時間上的重合，由于采用二級質(zhì)譜，對保留時間重合的組分提取不同的二級離子，并進(jìn)行了優(yōu)化，有效地避開了相鄰組分的干擾，這一點(diǎn)從組分的線性﹑重復(fù)性和回收率上可以得到證明。以下是樂果（RT=12.17min），克百威（RT=12.25min）二級選擇離子定性定量質(zhì)譜圖，由于選擇了不同的離子，使相近的組分峰不產(chǎn)生干擾，保證了定性定量的準(zhǔn)確性。

圖7 生鮮牛乳樣品農(nóng)殘譜圖

樂果的定性定量離子質(zhì)譜圖（8）﹑（9）

圖（8）

圖（9） 樂果3個離子疊加圖

克百威的定性定量離子質(zhì)譜圖（10）﹑（11）

圖（10）

圖（11）克百威3個離子疊加圖

對于其他的相鄰組分，如七氯-甲霜靈，殺螟硫磷-甲基嘧啶磷，艾氏劑-倍硫磷-毒死蜱，喹硫磷-稻豐散-硫丹-氯丹，敵瘟磷-丙環(huán)唑，氟氰戊菊酯—氯氰菊酯等，都可以有效地提取，定性定量。

2.7 樣品的測定結(jié)果

按照本方法對從5個省區(qū)共抽檢了500批次生鮮牛乳樣品，只有11個樣品檢出了p,p’-DDE,其含量范圍在0.5μg/ kg～1.2μg/kg之間，其含量值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于國家規(guī)定的限量值0.02mg/kg。其它51種農(nóng)殘組分的含量均未檢出。

3 討論

本文首先確定了牛乳中所測定的農(nóng)殘組分，最大限度地簡化了測定的范圍。在樣品處理方法上比較了分散固相萃取法和C18固相萃取小柱凈化法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者有更高的加標(biāo)回收率，并且樣品前處理方法也同樣便于操作。 上機(jī)測定采用基質(zhì)標(biāo)加內(nèi)標(biāo)的方式，用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，優(yōu)化了進(jìn)樣口的溫度，使52種組分都有比較合適的測定靈敏度；同時也優(yōu)化了碰撞能量和SRM離子對，保證了一次進(jìn)樣可同時分析所列的52種農(nóng)殘組分，排除了相近組分的干擾，提高了測定靈敏度，不需要分組上機(jī)測定，極大地節(jié)省了分析時間。與其他方法相比[13-17]，本方法簡便﹑高效，精密度高，檢出限低，為牛乳農(nóng)殘的檢測提供了一種快速﹑可靠的分析方法。

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Simultaneous Determination of Multiple Pesticide Residues in Milk by Gas Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Huang Pei1, Zhao Jianguo2
( 1.Sichuan Provincial Bureau of Geology and Mineral exploration and development Chengdu Integrated Testing Center Rock and ores, Chengdu 610081,China; Ministry of Agriculture Dairy Quality Supervision and Testing Center, Harbin 150090, China)

In this paper, 52 kinds of pesticide residues in milk were determined.Based on gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS/MS), 52 methods for the analysis of pesticide residues in milk were established.This improved method is: through the transmission of pesticide residues and metabolism in vivo in cattle, the pollutants may exist 52 kinds of pesticide residues in milk, greatly narrowing the scope of screening of pesticide residue in milk contamination；Simplifies the packet determination, a sample, a sample of 52 kinds of pesticide residues, can be completed at the same time the determination of components, greatly improves the detection efficiency and the detection flux；The conditions of gas chromatography were optimized (the effect of inlet temperature on the sensitivity of the 52 different components), and the conditions of mass spectrometry were optimized.The determination of the best collision energy was determined by SRM.comparison of different sample purification methods to influence the recovery rate (C18 solid-phase extraction and， solid-phase extraction method), and ultimately determine the C18 solid-phase extraction and purification of samples .This method is a sample, a sample of 52 kinds of pesticide residues, can be completed at the same time the determination of components, simplifies the other grouping method determination method,

黃佩，女，大學(xué)本科，工程師。從事ICP-AES/MS 化學(xué)分析測試方法研究。手機(jī)號：13558730365，E-mail：huangpei0106@126.com，單位：四川省地質(zhì)礦產(chǎn)勘察開發(fā)局成都綜合巖礦測試中心，地址：四川省成都市人民北路一段二十五號，郵編：610081；

趙建國，Tel：0451-55195545，本科，高級工程師，食品安全和農(nóng)藥殘留分析。手機(jī)號：13903666767，通訊地址：哈爾濱市南崗區(qū)富水路97號，單位：黑龍江省墾區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢測中心，郵編：150090。greatly improves the detection efficiency and the detection flux.The results show that the method of 53 kinds of pesticide residues in the corresponding addition level, the average recoveries (n=6) ranged from 60.5% to 111.5%, the relative standard deviation of the determination results (RSD) ranged from 1.94% to 9.67%, the detection limit (S/N=3) ranged from 0.0007 to 0.013mg/kg.In the detection of multiple pesticide residues in milk can meet the requirements of components.This paper provides a simple and practical method for the evaluation of pesticide residues in fresh milk.The method is used to determine fresh milk samples from 500 different regions, and has received good results.

gas chromatography tandem mass spectrometry; simultaneous determination; 52 kinds of pesticide residues; milk.

TS255.7 [Document Code] A

10.11967/ 2017150210

TS255.7

A DOI：10.11967/ 2017150210