結核分枝桿菌ABC轉運器胞外結構域COG1732的結晶研究

陳江淮，何永興

結核分枝桿菌ABC轉運器胞外結構域COG1732的結晶研究

陳江淮，何永興

（蘭州大學, 蘭州市 中國 730000）

【目的】COG1732蛋白是結核分枝桿菌H37Rv菌株中的一個ATP-結合盒轉運蛋白的底物結合蛋白，但其蛋白質三維結構及其生物學功能尚未明了，生物信息學分析表明COG1732蛋白可能做為參與滲透調節(jié)劑向細胞內轉運過程中的底物識別過程，進一步改變跨膜結構域。本研究通過表達，純化COG1732蛋白用于蛋白質晶體生長分析?！痉椒ā酷槍Y核分枝桿菌的一個ABC轉運蛋白（ABC transporter）的胞外底物結合域COG1732。通過原核表達的方法，將表達COG1732的序列構建到帶有T7啟動子的載體pet28b，通過使用大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21（DE3）大量表達COG1732蛋白。并通過鎳親和色譜和離子交換色譜的方法將COG1732蛋白純化。將純化好的COG1732蛋白濃縮至濃度為70mg/ml。分裝保存到-80冰箱。并進行結晶條件的篩選?！窘Y果】純化的COG1732蛋白用懸滴氣相擴散法得到了棒狀晶體。【結論】成功構建了COG1732蛋白的原核表達載體﹑建立了表達純化策略并獲得了初步結晶的實驗條件，為最終解析其三維結構奠定了基礎。

ABC轉運器；多藥抗性蛋白；蛋白質晶體；結核分枝桿菌

1 前言

ABC轉運蛋白（ABC transporter）最早發(fā)現(xiàn)于細菌[1,2]，是細菌質膜上的一種運輸?shù)鞍祝╰ransporter），屬于一個龐大而多樣的蛋白家族，每個成員都含有兩個高度保守的ATP結合區(qū)（ATP binding cassette），故名ABC轉運蛋白[3,4]，他們通過結合ATP發(fā)生二聚化，ATP水解后解聚，通過構象的改變將與之結合的底物轉移至膜的另一側。在大腸桿菌中78個基因（占全部基因的5%）編碼ABC轉運器蛋白，在動物中可能更多[5,6,7]。雖然每一種ABC轉運器只轉運一種或一類底物，但是其蛋白家族中具有能轉運離子﹑氨基酸﹑核苷酸﹑多糖﹑多肽﹑甚至蛋白質的成員。ABC轉運器還可催化脂雙層的脂類在兩層之間翻轉，這在膜的發(fā)生和功能維護上具有重要的意義。第一個被發(fā)現(xiàn)的真核細胞的ABC轉運器是多藥抗性蛋白[8,9.10]（multidrug resistance protein, MRP），該基因通常在肝癌患者的癌細胞中過表達，降低了化學治療的療效。約40%的患者的癌細胞內該基因過度表達。ABC轉運器還與病原體對藥物的抗性有關，如臨床常用的抗真菌藥物有氟康唑 ﹑酮康唑﹑伊曲康唑等，真菌對這些藥物產生耐藥性的一個重要機制是通過MDR蛋白降低了細胞內的藥物濃度。結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv 是分枝桿菌科中一種致病性極強的病菌[11]，是造成結核病的主要原因[12]。在1882年由Robert Koch 首次發(fā)現(xiàn)，M.tuberculosis具有不同尋常的蠟質外衣（最要由于分枝菌酸的存在），這使得細胞免于革蘭氏染色。M.tuberculosis在臨床治療中表現(xiàn)出革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的特性[13]。我們針對結合分枝桿菌具有的高度耐藥性為出發(fā)點，通過生物信息學方法在結合分枝桿菌的基因簇中找到一個可能與多重耐藥性相關的ABC轉運蛋白，并從其底物結合域著手，探究這個蛋白的功能。本次研究通過構建COG1732的原核表達載體，并獲得轉運蛋白的底物結合域的表達﹑純化和初步結晶的實驗條件，為最終通過x射線晶體衍射技術解析其三維結構奠定基礎。

2 材料和方法

2.1 分子克隆

菌株Mycobacterium tuberculosis H37Rv (re-annotation) ，E.coli BL21(DE3)，E.coli DH5α(DE3)。均來自本實驗室，pet28b(Novagen)質粒也是來自本實驗室。PrimeStar 聚合酶，T4 DNA Ligase，T4 buffer，NdeI，NotI購買自TAKARA 。Yeast Extract，Tryptone 購買自OXOID，引物的設計以COG1732基因的序列為依據(jù),使用DNA序列分析軟件primer premier 5.0，并用NdeI和NotI作為酶切位點，根據(jù)一般引物設計原則設計引物，由GENEWIZ公司合成。

上游引物：NdeI 5'——GGAATTCATATGAAACCAAACC ACGCCGGAAA——3'

下游引物：NotI 5'——ATAAGAATGCGGCCGCCTACTGC CGCACTGGATGATCGA——3'其中劃線部分為酶切位點。

以結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv菌液作為模板， PCR擴增COG1732的編碼DNA序列。反應體系如下：primer star 5×PS buffer 10 μL，2.5 mM/L dNTP 4 μL，引物各（10 nM/L）1 μL，模板 1 μL，酶 1 μL，ddH2O補齊至50 μL。擴增參數(shù)：98 0C預變性5 min。98 0C，30 S。58 0C，15 S。72 0C，1 min。35個循環(huán)，72 0C后延伸10 min。

2.2 PCR 產物回收及質粒構建

用AXYGEN質粒小提試劑盒回收PCR產物。雙酶切PCR產物體系如下： NdeI 2 μL，NotI 2 μL，PCR產物25 μL，H/BSA buffer 5 μL，ddH2O至 50 μL，4小時后用質粒小提試劑盒回收PCR產物，雙酶切pet28b(Novagen)體系如下： NdeI 2 μL，NotI 2 μL，pet28b 30 μL，H/BSA buffer 5 μL，ddH2O至 50 μL。酶切10 小時左右跑瓊脂糖核酸電泳（1%）并用AXYGEN凝膠回收試劑盒回收切開的質粒。構建重組質粒體系如下： pet28b 2 μL，PCR 6 μL，T4 buffer 1 μL，T4 ligase 1 μL。連接過夜，后轉化到 E.coli DH5α。涂布到含有卡那霉素（50 ng/mL）12小時左右挑取單克隆，過夜后用AXYGEN質粒小提試劑盒提質粒，將提出的質粒并跑瓊脂糖核酸電泳（1 %）并與空白質粒對照，挑出含有插入片段大小的質粒，做雙酶切，體系如下： NdeI 2 μL，NotI 2 μL，pet28b 30 μL，H/BSA buffer 5 μL，ddH2O至50 μL。經過大約12小時左右，跑瓊脂糖核酸電泳（1 %）。將雙酶切檢測出來的重組質粒，送到GENEWIZ測序，挑出可以用的重組質粒進行表達。

2.3 蛋白純化與結晶

先將重組質粒轉化到E.coli.BL21 ，并在50 mL的液體LB加入卡那霉素（50 ng/mL），370C，220 rpm/min 的搖床（Thermo scientific MAXQ 4000）中活化。12小時左右之后吸取20 mL活化的菌液以1：50接種到1 L的液體LB培養(yǎng)基中添加卡那霉素濃度（50 ng/mL）在37 0C ，220rpm/min的搖床中培養(yǎng)當菌液的生長曲線達到對數(shù)期OD600=0.6左右的時候，加入誘導劑IPTG(0.2 μM/L)。并在16 0C ，220 rpm/min 的條件下讓蛋白表達。24小時后收菌用的是500 mL的日立（HITACHI himac CR22GII）專用的收菌瓶在8000 rpm，10 min 常溫條件下收集，并倒掉上清。將菌體用結合緩沖液30mL（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 10 mM 咪唑）重懸菌體。將重懸的菌液用超聲波細胞粉碎機（BioSafer650-92）功率400 w ，8 min裂解。后用高速冷凍離心機(SIGMA 3K30)12000 rpm 30 min 4 0C離心后立即將上清吸出放在干凈的50 mL管子中置于冰上，棄沉淀。準備過鎳柱（GE HEALTH）平衡鎳柱用結合緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 10 mM 咪唑）大概5個柱體積。平衡好鎳柱之后就可以將裂解出來的上清加入鎳柱，可以將流傳液再過一遍鎳柱。后用5個柱體積的洗脫緩沖液（20mM Tris=8.0，10 mM NaCl 20 mM 咪唑）洗脫一次。然后依次用2個柱體積的洗脫緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 50 mM 咪唑），2個柱體積的洗脫緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 100 mM 咪唑），2個柱體積的洗脫緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 250 mM 咪唑），2個柱體積的洗脫緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 500 mM 咪唑），2個柱體積的洗脫緩沖液（20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 1 M 咪唑）洗脫將梯度洗脫下來的液體準備跑12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。每個25 μL(5 μL loading bufer+20 μL洗脫液)在1000C 10 min 水浴鍋中煮沸。上樣跑SDS-PAGE 185 V 85 mA 1h 后用考馬斯亮藍R250染色液（0.1% (w/v)考馬斯亮藍R250，25%（v/v）異丙醇，（v/v）冰醋酸）染色。染好色之后就用考馬斯亮藍脫色液（10%（v/v）醋酸。5%(v/v)乙醇）脫色。然后將洗脫體系用Millipore超濾離心管（3000DA）用日立高速冷凍離心機（HITACHI himac CR22GII）在3000 g的條件下離心脫鹽，鹽濃度低于10 mM后。將蛋白液用20 mM Tris（PH=8.0）稀釋10-20倍，用來過離子交換柱。做法如下：先用20 mM Tris (PH=8.0)，1M NaCl沖洗柱子5個柱體積。后用ddH2O沖洗5個柱體積，接下來用20 mM Tris (PH=8.0)平衡柱子5個柱體積，然后將稀釋好的蛋白液上樣，用不同濃度的NaCl梯度洗脫20 mM Tris (PH=8.0) 100 mM NaCl，20 mM Tris (PH=8.0) 200 mM NaCl，20 mM Tris (PH=8.0) 300 mM NaCl，20 mM Tris (PH=8.0) 400 mM NaCl，20 mM Tris (PH=8.0)500 mM NaCl，分別用兩個柱體積。將洗脫下來的蛋白液分別跑SDSPAGE。將條件20 mM Tris (PH=8.0)300 mM NaCl洗脫下來的洗脫液用Millipore超濾離心管（3000DA）在日立高速冷凍離心機（HITACHI himac CR22GII）在3000 g的條件下離心脫鹽，鹽濃度低于100 mM后。用Thermo 2000 微量分光光度計測濃度為90.7 mg/mL 將多余蛋白分裝好放在-800C凍起來。留下部分用來點晶體。使用坐滴法，ABC蛋白的濃度為27mg/mL，條件為1 μL蛋白加1 μL結晶緩沖液。并在24小時之后觀察結晶的結果，持續(xù)一周。并在出現(xiàn)比較好的條件下用懸滴法進行晶體的優(yōu)化。

3 實驗結果

Pet28b構建之后轉化的DH5α挑出的單克隆經過菌落PCR驗證為陽性，并且Pet28b構建的質粒送去測序的結果顯示完全正確。

COG1732蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)小量誘導表達，重組菌在IPTG誘導后，菌體通過超聲裂解后，上清和沉淀通過SDS-PAGE結果顯示在大概23-35 Kda分子量大小出顯示出有特征蛋白質的表達條帶。上清和沉淀中都有，但是明顯上清中多（圖1）。將1L的誘導菌離心收集好，破碎離心后將上清首先進行鎳柱親和層析純化，純化結果顯示，以獲得較高純度的目的蛋白，但仍含有雜蛋白（圖2）可以看出在洗脫體系20 mM Tris=8.0，10 mM NaCl 250 mM咪唑中的蛋白濃度最高。并將含有高純度目的蛋白質的洗脫液，利用陰離子交換層析進行進一步純化（圖3）可以看出在20 mM Tris pH8.0，300 mM氯化鈉的洗脫液中蛋白質純度最好，同時經過陰離子交換之后的目的蛋白質的純度達到了95%以上。完全可以用來進行蛋白質的晶體培養(yǎng)及后續(xù)的優(yōu)化。

圖 1 小量誘導的上清和沉淀，M表示為116 Kda蛋白質分子量標準。

圖 2 鎳柱純化ABC蛋白的結果，其中1表示為116 Kda蛋白質分子量標準，2表示20 mM Tris pH8.0，50 mM咪唑洗脫結果，3表示20 mM Tris pH8.0，100 mM咪唑洗脫結果，4表示20 mM Tris pH8.0，250 mM咪唑洗脫結果，5表示20 mM Tris pH8.0，500 mM咪唑洗脫結果，6表示為沉淀。

圖3 ABC蛋白陰離子交換純化結果， M為116KDa標準分子量，1為20 mM Tris pH8.0，100 mM氯化鈉洗脫結果，2為20 mM Tris pH8.0，200 mM氯化鈉洗脫結果，3為20 mM Tris pH8.0，300 mM氯化鈉洗脫結果，4為20 mM Tris pH8.0，400 mM氯化鈉洗脫結果，5為20 mM Tris pH8.0，500 mM氯化鈉洗脫結果。

結果在160C在晶體培養(yǎng)箱中經過一段時間之后觀察發(fā)現(xiàn)有晶體出現(xiàn)（表一）。其中部分條件下的晶體出現(xiàn)了。

表 1 出現(xiàn)COG1732晶體的條件

其中將條件73#的基礎上進行了優(yōu)化條件，后在ABC濃度27mg/mL，0.2 M 氯化鈉，0.1 M Tris(ph=8.5)，17.5%(w/v) PGE3350的條件下得到晶體如圖4。

4 結論

當COG1732蛋白的鎳柱純化的條件為在250 mM咪唑濃度下就可以基本將目的蛋白洗脫下來，并且用100 mM咪唑可以將雜蛋白洗掉大部分。并且在離子交換的過程中300 mM氯化鈉就可以純化出來。在結晶的過程中經過研究發(fā)現(xiàn)蛋白質的氨基酸殘基可以去掉幾個這樣有利于晶體的生長，并在條件73#的基礎上進行了優(yōu)化條件，后在0.2 M 氯化鈉，0.1 M Tris(ph=8.5)，17.5%(w/v) PGE3350的條件下長出了完整的蛋白質晶體。這以條件的晶體可以用來做x-射線的衍射。為進一步研究結核分枝桿菌的致病機理和高度耐藥性提供的方便。

5 討論

在摸索結晶條件時發(fā)現(xiàn),所得到的COG1732蛋白晶體在不同的條件下在結晶條件非常相近的情況下可以生長出相同晶型的晶體,大多數(shù)晶體屬于四方晶系。這說明影響蛋白晶體生長和晶型的因素是很微妙的,具體原因有待進一步的探討。ATP-結合盒轉運器(ABC轉運蛋白)是轉運系統(tǒng)超級家族成員之一，現(xiàn)有從原核生物到人類所有的綱中最古老的家族之一[14,15]。BC轉運蛋白通常組成為底物結合亞基，一個或兩個的跨膜蛋白一個或兩個的與膜偶聯(lián)的ATP酶。ATP酶亞基利用與ATP結合并水解獲得能量將底物吸收或者運出細胞膜，并不是所有的內排系統(tǒng)都有周質空間的結合蛋白，一些同源的ATP酶的功能是非轉運相關的過程比如轉運RNA和DNA的修復[16,17]。ABC轉運蛋白具有ATP-結合盒轉運器相似的序列，盡管整體的膜蛋白可能在進化上相互獨立，否則形成不同的蛋白家族。整個ABC外排系統(tǒng)有三次獨立的進化[18]。多數(shù)的ABC轉運蛋白具有原核生物和真核生物的共同特點[19]。ABC蛋白在細胞的很多生命活動過程是必須的，在人類基因的突變會造成很多的遺傳疾病[20]ABC轉運蛋白也參與多重耐藥性，這個特性也是第一個鑒別出來的特征[21]。對于一個完整的ABC轉運蛋白的研究通常使用的方法為X-ray和透射電鏡，基本結構域和原理機制如圖四所示[22]，本次研究中由于蛋白的結晶完整度不好，推薦進行蛋白質肽段的截短突變，由于底物結合蛋白位于周質空間，在合成的時候會有一段信號肽幫助其跨膜，因此將信號肽截掉可能有助于形成完整的晶體?？梢詫?8位氨基酸前面的部分截短。將有助于結晶。

6 致謝

感謝導師何永興對本課題提供的研究方案以及在具體的實施過程中給予的周密指導，以及實驗室單位所有成員對本課題提供的支持與幫助。因為有了你們科研的路上充滿歡樂。感謝國家自然科學基金對本課題的資金支持（基金號.30300616和81172437）以及中央高校對蘭州大學的的基礎研究基金（基金號.lzujbky-2014-85和lzujbky-2015-k18）

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Crystallization for The Outer Membrane Subunit COG1732 of Mycobacterium Tuberculosis H37Rv

Chen Jianghuai, He Yongxing
(Lanzhou University, Lanzhou City, China 730000)

[Object] COG1732 protein is one of the ATP-binding cassette substrate binding proteins for Mycobacterium tuberculosis H37Rv.COG1732 protein three-dimension structure and function are not identify, bioinformation analysis have shown that COG1732 protein maybe participate in osmosis uptake into cell and identify substance.And change transmembrane structure domain.In this study, COG1732 protein was purified for crystal and analyze their structural features [method] For the ABC transporter substrate binding domain COG1732 of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, use prokaryotic recombinant expression, the COG1732 gene was inserted into pet28b with T7 promoter, and the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) to overexpress.Target protein was purified by nickel affinity chromatography and ions exchange chromatography.Purified COG1731 protein concentrated to 70mg/ml, aliquot and stored at -80 freezer for crystal screen.[result] Get crystal of target protein COG1732 with haggle vapor diffusion mothed [conclusion] We have successfully constructed COG1732 protein prokaryotic expression vector, established a prefect purification protocol of recombinant protein , determined the crystal condition , and built the foundation to resolved its structure.

ABC transporter; multidrug resistance protein; protein crystal; Mycobacterium tuberculosis

Q518.3 [Document Code] A

10.11967/ 2017150206

Q518.3

A DOI：10.11967/2017150206

國家自然科學基金（基金號：30300616和81172437）以及中央高校對蘭州大學的的基礎研究基金（基金號：lzujbky-2014-85和lzujbky-2015-k18）

陳江淮，男，1991年生，在讀碩士研究生，E-mail: chenjh14@lzu.edu.cn，主要研究領域為蛋白質晶體學。

何永興，性別 男，1983年生，博士研究生，E-mail: heyx@lzu.edu.cn，職稱 副教授，主要研究領域為蛋白質晶體學。