半月板損傷并發(fā)膝關(guān)節(jié)滑膜炎患者局部滑膜組織及滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13的表達觀察

黃媛霞，李愛國，陶金剛，徐海斌，路坦

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100)

半月板損傷并發(fā)膝關(guān)節(jié)滑膜炎患者局部滑膜組織及滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13的表達觀察

黃媛霞，李愛國，陶金剛，徐海斌，路坦

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100)

目的 觀察半月板損傷導(dǎo)致的滑膜炎患者滑膜滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達變化。方法 128例半月板損傷患者，根據(jù)是否有伴有滑膜炎分為半月板損傷誘發(fā)滑膜炎者81例(觀察組)和單純半月板損傷者47例(對照組)。分別采用熒光定量PCR法和免疫組化法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白，采用ELISA法檢測兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。結(jié)果 觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相對表達量分別為3.12±0.41、2.10±0.24、3.01±0.30，對照組分別為1.53±0.35、0.87±0.18、1.12±0.21,P均<0.05；觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 蛋白相對表達量分別為394.1±20.6、170.5±14.8、190.7±13.6，對照組分別為204.5±15.3、90.3±8.4、109.3±10.4,P均<0.05。觀察組滑液組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相對表達量分別為12.5±2.1、15.7±2.4、9.5±1.9，對照組分別為19.4±2.6、17.5±2.3、14.7±2.4,P均<0.05。觀察組Ayral滑膜炎評分≤60分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平明顯低于Ayral滑膜炎評分>60分者(P<0.05)。結(jié)論 半月板損傷導(dǎo)致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表達。MMP-3、MMP-9和MMP-13的異常表達可能與半月板損傷滑膜炎的發(fā)生有關(guān)。

滑膜炎；半月板損傷；基質(zhì)金屬蛋白酶3；基質(zhì)金屬蛋白酶9；基質(zhì)金屬蛋白酶13

膝關(guān)節(jié)是人體重要關(guān)節(jié)，半月板可分散關(guān)節(jié)軟骨載荷、協(xié)助關(guān)節(jié)滑液潤滑關(guān)節(jié)，保護關(guān)節(jié)軟骨，增強關(guān)節(jié)穩(wěn)定性[1,2]。外力可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)在運動的同時發(fā)生破裂和旋轉(zhuǎn)，造成半月板損傷。半月板損傷是常見的膝關(guān)節(jié)病變，可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)屈伸功能異常。長時間半月板損傷可導(dǎo)致半月板周圍的膝關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生病變，最常見的為滑膜炎。半月板損傷所致滑膜炎主要臨床表現(xiàn)為滑膜組織充血水腫，關(guān)節(jié)滑液增多并伴有關(guān)節(jié)周圍疼痛腫脹?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組金屬依賴的可降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶類。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子比例失衡可能導(dǎo)致細胞外基質(zhì)降解異常[3,4]。基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)在關(guān)節(jié)軟骨降解中發(fā)揮重要作用[5,6]，可破壞降解蛋白聚糖而保持關(guān)節(jié)軟骨彈性[7]。正常生理條件下，MMPs與基質(zhì)金屬蛋白抑制物相互制約相互平衡,維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性。但半月板損傷導(dǎo)致的滑膜炎患者病變組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達變化目前尚未見相關(guān)報道。我們觀察了半月板損傷導(dǎo)致的滑膜炎患者滑膜滑液中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院于2013年6月～2016年6月收治的半月板損傷的128例患者，均經(jīng)磁共振成像或者關(guān)節(jié)鏡下檢查確診為半月板損傷。128例患者分為半月板損傷誘發(fā)滑膜炎者81例(觀察組)和單純半月板損傷者47例(對照組)。觀察組中男49例，女32例；年齡46～77(52.5±12.3)歲；其中右膝41例，左膝40例；病程(3.7±1.1)年；關(guān)節(jié)鏡下?lián)p傷部位及類型：前1/3處20例(橫裂9例，縱裂5例，斜裂2例，層裂2例，復(fù)合裂2例)；中1/3處39例(橫裂15例，縱裂12例，斜裂6例，層裂3例，復(fù)合裂3例)；后1/3處22例(橫裂10例，縱裂4例，斜裂3例，層裂3例，復(fù)合裂2例)；采用Ayral的方法進行評定[8]，Ayral滑膜炎評分≤60分者49例、>60分者32例。對照組中男27例，女20例；年齡45～75(54.1±10.2)歲；其中右膝22例，左膝25例；病程(3.2±1.0)年；關(guān)節(jié)鏡下?lián)p傷部位及類型：前1/3出11例(橫裂4例，縱裂3例，斜裂1例，層裂1例，復(fù)合裂1例)；中1/3處20例(橫裂6例，縱裂7例，斜裂3例，層裂2例，復(fù)合裂2例)；后1/3處16例(橫裂5例，縱裂5例，斜裂2例，層裂2例，復(fù)合裂2例)；Ayral滑膜炎評分為≤60者28例、>60者19例。兩組年齡、性別比例、病程、損傷部位及損傷類型等臨床資料具有可比性。

1.2 試劑及儀器 實時熒光定量2×SYBR Green Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京唯贊生物有限公司；引物有上海英俊生物有限公司合成；MMP-3、MMP-9和MMP-13 ELISA檢測試劑盒均購自R&D公司；鼠抗人MMP-3、MMP-9和MMP-13抗體均購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的羊抗鼠二抗均購自杭州華安生物有限公司；DAB顯色液購自上海生工生物有限公司；顯微鏡購自日本奧林巴斯生物有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團。

1.3 兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白檢測 ①熒光定量PCR法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA：取兩組滑膜組織，液氮研磨組織，RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度計測定RNA水平，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參， MMP-3上游引物為5′- ACCCAAATGGAGGAAAAACC-3′, 下游引物5′- CTTCAGCATTGGCTGAGTGA-3′； MMP-9上游引物為5′- TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′,下游引物5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′；MMP-13上游引物為5′- GTCTCTCCTTCCCAGGGC -3′,下游引物5′- TTG ACCATGGGGCTAGAA -3′；GAPDH上游引物為5′- TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。反應(yīng)體系： 2×SbGreen RT-PCR Mix 25 μL，F(xiàn)GF5-F1 1 μL， FGF5-R1 1 μL，cDNA 1 μL，加水補至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)性 5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，40個循環(huán)，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。②免疫組化法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 ：取兩組滑膜組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，脫蠟、水化，滴加0.3%的過氧化氫-甲醇溶液，混合30 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，PBS洗滌3次，每次5 min，再用PBS稀釋的10%的山羊血清封閉 1 h，封閉液分別稀釋MMP-3、MMP-9和MMP-13一抗，滴于玻片上，4 ℃孵育12 h，PBS洗滌3次，每次5 min，再用封閉液稀釋HRP標記的二抗，滴于玻片上室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，脫水、封片并拍照，采用軟件對圖片進行分析。兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13檢測 采用ELISA法檢測兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。設(shè)計校正孔，添加反應(yīng)時只加TMB顯色液和終止液。分別取兩組滑液標本，每孔100 μL加入相應(yīng)孔中，室溫孵育120 min，洗液洗滌3次，每次5 min；最后一次用紙吸干液體，加入稀釋后的一抗，室溫孵育3 h,PBS洗滌3次，每次5 min，加入稀釋好HRP標記的羊抗鼠的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次、每次5 min。加入100 μL DAB顯色液，37 ℃孵育20 min，液體顏色變化后加入1 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)。采用酶標儀測定每孔的在480 nm處的吸光度值。根據(jù)吸光值建立標準曲線，根據(jù)標準曲線建立方程，計算MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量比較見表1。

表1 兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較見表2。

觀察組不同Ayral滑膜炎評分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較見表3。

3 討論

表2 兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

表3 觀察組不同Ayral滑膜炎評分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較

注：與Ayral滑膜炎評分≤60者比較，#P<0.05。

半月板損傷是臨床常見的膝關(guān)節(jié)病變，長時間半月板損傷可導(dǎo)致滑膜炎，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)水腫和疼痛等癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前臨床主要通過關(guān)節(jié)鏡診斷半月板損傷所致滑膜炎，但關(guān)節(jié)鏡是一種創(chuàng)傷性診斷方法。因此，尋找一種快速有效診斷滑膜炎的指標具有重要臨床意義。滑膜是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，其主要包括兩部分，分別為內(nèi)襯層，由1～4層滑膜細胞組成，具有吞噬能力。另一部分為基底層[9]。研究發(fā)現(xiàn)滑膜具有分泌和吞噬功能，其分泌的滑液不僅對關(guān)節(jié)具有潤滑作用，而且具有營養(yǎng)關(guān)節(jié)的功能[10]。但關(guān)節(jié)滑膜一旦發(fā)生感染，滑膜會分泌大量的炎癥介質(zhì)進入滑液，因此滑液診斷滑膜和關(guān)節(jié)病變的敏感性較高。

MMPs是一組金屬依賴的可降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶類,其在關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮重要作用[11]。MMP-3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，由軟骨細胞、滑膜細胞分泌，不僅能降解多種細胞外基質(zhì)中的細胞外蛋白多糖等基質(zhì)蛋白底物，更重要的是MMP-3可激活MMP-9和MMP-13等酶原產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，加重軟骨破壞程度[12]。MMP-9在可破壞軟骨基質(zhì)，暴露軟骨組織膠原，破壞膠原形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[13]。MMP-9破壞膠原后產(chǎn)生的膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為進一步降解提供了基礎(chǔ)。因此MMP-3和MMP-9的相互作用加速了膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致膠原軟骨發(fā)生不可逆的改變。MMP-13的主要生物學(xué)作用是介導(dǎo)Ⅱ型膠原降解[14]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組。說明半月板損傷引起的滑膜炎滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13表達水平升高，而MMP-3、MMP-9和MMP-13表達水平的增加可能導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬抑制物失衡，最終使關(guān)節(jié)軟骨破壞受損。進一步分析顯示觀察組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13的水平高于對照組。進一步證實觀察組關(guān)節(jié)滑膜組織和滑液中存在MMPs表達水平上調(diào)，打破了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物的平衡，使軟骨組織損傷。說明MMP-3、MMP-9和MMP-13水平隨著Ayral滑膜炎評分增加而升高，可能與滑膜炎病變程度成正相關(guān)。

綜上所述，半月板損傷導(dǎo)致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表達。MMP-3、MMP-9和MMP-13的異常表達可能與半月板損傷滑膜炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

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河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目(豫衛(wèi)科201304029)。

徐海斌(E-mail: nhoscn@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.029

R684.7

B

1002-266X(2017)19-0091-03

2016-08-30)