前列腺癌基因外顯子區(qū)突變位點篩查及與前列腺癌易感性的關(guān)系

糜遠源，吳升，祝黎潔

(南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214041)

前列腺癌基因外顯子區(qū)突變位點篩查及與前列腺癌易感性的關(guān)系

糜遠源，吳升，祝黎潔

(南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214041)

目的 篩查前列腺癌(PCA)基因外顯子區(qū)的突變位點，并分析其與PCA易感性的關(guān)系。方法 6例PCA患者，留取PCA組織和癌旁正常組織標本。采用液相雜交捕獲技術(shù)分析PCA、癌旁正常組織全基因外顯子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，采用Illumina HiSeq 2000平臺高通量測序?qū)⒉东@富集并驗證的PCA、癌旁正常組織基因外顯子區(qū)SNPs的DNA文庫進行突變位點比對，篩選PCA基因外顯子區(qū)突變位點。采用bwa軟件與參考基因組hg19作比對，分析PCA外顯子區(qū)功能性突變位點的生物信息學(xué)信息，分析功能性突變位點與PCA易感性的關(guān)系。結(jié)果 共發(fā)現(xiàn)4個未報道的功能性SNPs突變位點，分別為BRCA1 rs16941、MET rs45483396、P53 rs121912655、COPB2 rs7374710。進一步通過臨床樣本檢測結(jié)果顯示，BRCA1 rs16941與COPB2 rs7374710兩個SNP不僅均與PCA易感性相關(guān)(OR 分別為 1.47，1.27；95% CI 分別為 1.14～1.72；1.20～1.41)，而且與PCA患者PSA值 及Gleason評分均呈正相關(guān)(OR分別為1.25，1.37；95%CI= 1.10～1.84，1.20～2.34；P均<0.01)。結(jié)論 PCA外顯子區(qū)存在BRCA1 rs16941、COPB2 rs7374710功能性突變位點，攜帶有BRCA1 rs16941、COPB2 rs7374710突變位點的個體罹患PCA的可能性較高。

前列腺腫瘤；前列腺癌；液相雜交捕獲技術(shù)；基因突變；外顯子；單核苷酸多態(tài)性

2016年最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示前列腺癌(PCA)仍是美國男性最常見的惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌[1]。我國PCA發(fā)病率及病死率正逐年升高[2,3]。早期篩查和治療是一直是PCA研究的熱點。目前外周血前列腺特異抗原(PSA)是臨床最常用的篩查PCA的指標，雖其診斷PCA復(fù)發(fā)的敏感度較高，PSA 4 ng/mL閾值診斷PCA的敏感性、特異度均較低[4]?？赡茉驗榍傲邢傺装Y、良性前列腺增生(BPH)及感染時均可出現(xiàn)外周血PSA水平升高[5～7]。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是指人群中2個相配對基因DNA序列的某一位點出現(xiàn)的差異和多態(tài)性，常常用于疾病相關(guān)遺傳基因的定位、克隆、鑒定、人群易感性和疾病發(fā)生進展的預(yù)測[8，9]。目前為止已發(fā)現(xiàn)50多個SNPs與高加索人群PCA的發(fā)病相關(guān)[10]；中國人群中一發(fā)現(xiàn)的PCA易感性SNPs有二十多種，最為特異的是9q31.2(rs817826)和19q13.4(rs103294)[11]。我們采用液相雜交捕獲技術(shù)篩查PCA基因外顯子區(qū)的突變位點，旨在發(fā)現(xiàn)未報道過的功能性突變位點并分析其與PCA易感性的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年8月～2016年2月間南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的PCA患者156例，年齡51～75(65.2±7.4)歲。所有患者均經(jīng)前列腺穿刺活檢和PCA根治手術(shù)病理檢查證實，并經(jīng)病史、臨床癥狀和體征及其他輔助檢查(如X線、CT、MR等)排除其他類型惡性腫瘤。術(shù)中留取PCA組織及癌旁正常組織標本,-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究通過南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者及其家屬均填寫知情同意書并備案。

1.2 材料 石蠟包埋組織DNA提取試劑盒 (中國Tiangen公司；DP331)，Gnomegen DNA測序文庫制備試劑盒(美國Gnomegen公司；K02422)，Gnome size selector(美國Gnomegen公司；R02424L)，PCR儀(美國ABI公司；2720)，Concentrator plus 真空離心濃縮儀(德國eppendorf公司)，小型高速離心機(德國eppendorf公司，5418)，實時定量PCR儀(德國eppendorf公司，4376600 )，通用電泳儀(杭州匯爾儀器, JY300C)，渦旋儀(北京京輝凱業(yè)科技有限公司；JHX24H)，金屬浴(杭州瑞誠儀器有限公司；DH100-1)，250 bp DNA Marker (中國捷瑞公司，DL250+,100T)，PrimeSTAR HS DNA polymerase(日本TAKARA公司，R010B)引物合成由上海捷瑞公司完成。

1.3 PCA、癌旁正常組織全基因外顯子區(qū)突變位點篩查

1.3.1 PCA組織全基因外顯子區(qū)SNPs檢測 采用液相雜交捕獲技術(shù)篩查PCA基因外顯子區(qū)SNPs 突變位點。 組織提取及基因組DNA純化 收集石蠟包埋的PCA、癌旁正常組織各50 g，按照Tiangen石蠟包埋組織DNA提取試劑盒說明書操作進行DNA的提取及純化。瓊脂糖凝聚電泳檢測基因組DNA的完整性，采用Nanodrop 1000儀對基因組DNA的濃度進行定量，選擇濃度>10 ng/μL的基因組DNA備用。采用Gnomegen DNA文庫測序制備試劑盒進行文庫構(gòu)建。將樣品基因組DNA進行隨機打斷，獲得片段化DNA，斷裂要求：300～500 bp片段，以400 bp為中心峰值；對片段化DNA進行末端修復(fù)和加dA尾，磁珠純化后，在純化DNA樣品中加入連接接頭，再次進行磁珠純化，對接頭純化DNA樣品進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物再次進行磁珠純化，制成300～500 bp片段文庫，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?探針雜交、捕獲與洗脫 人工合成探針(SeqCap EZ Library Probes)由南京科維思生物科技有限公司完成。將擴增DNA文庫樣品與制備好的帶生物素的自主定制探針加入至適當(dāng)?shù)囊合嚯s交體系中，47 ℃、72 h溫浴，完成雜交。然后用鏈霉親和素磁珠對雜交產(chǎn)物進行序列捕獲，將目標DNA(帶生物素)綁定到磁珠上。之后用三種wash buffer對磁珠進行洗脫，洗脫后的目標DNA溶液-20 ℃保存。以洗脫后目標DNA溶液為模板，進行連接介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)擴增，對捕獲的目標基因進行富集。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Gnome size selector磁珠純化后，-20 ℃保存。

1.3.2 外顯子區(qū)SNPs突變位點比對 將捕獲富集并驗證的PCA、癌旁正常組織基因外顯子區(qū)SNPs的DNA文庫進行高通量測序，進行突變位點比對，篩選PCA基因外顯子區(qū)突變位點。采用Illumina HiSeq 2000 平臺測序，通過Illumina HiSeq 2000平臺進行高通量測序。測序條件：讀長為帶標簽的2×100 bp 雙向測序，測序深度為>100×。

1.3.3 外顯子區(qū)功能性突變位點生物信息學(xué)分析 采用fastqc軟件對數(shù)據(jù)質(zhì)量做質(zhì)控，然后采用bwa軟件與參考基因組hg19作比對，將比對結(jié)果手動去除重復(fù)后排序，再次采用GATK Indelrealigner對結(jié)果做重比對，接著采用GATK UnifiedGenotyper做變異檢測，得到可信的SNP和indel?？尚臩NP和indel被用來做后續(xù)的annovar，在線SIFT(http://sift.jcvi.org/)和PolyPhe-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)注釋，SIFT值小于0.05表示影響蛋白質(zhì)功能。PolyPhe-2值越接近1，表示該SNP越能影響基因的表達。最后搜索OMIM數(shù)據(jù)庫，查看樣本疾病攜帶信息，并采用在線版HGMD數(shù)據(jù)庫做了注釋[12,13]。

1.3.4 外顯子區(qū)功能性突變位點與臨床易感性的關(guān)系 取保存在我院病理科的50例PCA患者(PSA值4.3～57.8 ng/mL，平均11.47 ng/mL；病理Gleason評分6～9分，平均7.28分)的PCA、癌旁正常組織，提取DNA，步驟同上。針對rs16941、rs45483396、rs121912655、rs7374710四個SNPs位點利用primer 6.0軟件設(shè)計對應(yīng)上下游引物(見表1)。引物由上海捷瑞公司合成。PCR擴增目的片段。反應(yīng)體系50 μL，包括5×PS Buffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L each)4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5 μL，DNA模板20 ng，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃、5 min，98 ℃、10 s，55 ℃ 、10 s，72 ℃、30 s，共30個循環(huán)，72 ℃、8 min，4 ℃保存。采用Sanger一代測序目的片段堿基并進行blast比對。

表1 擴增各SNPs位點目的片段引物序列及擴增長度

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS9.1.3統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。組間各基因型頻率的差異比較采用χ2檢驗，用比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示各基因型的風(fēng)險度，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用液相雜交捕獲技術(shù)及高通量測序法比對PCA及癌旁正常組織，共檢測到PCA外顯子區(qū)17個SNPs突變位點，見表2。

采用PolyPhe-2及SIFT在線分析軟件分析17個SNPs突變位點的生物學(xué)信息，共篩選到4個存在潛在差異功能SNPs，分別為BRCA1 rs16941、MET rs45483396、P53 rs121912655、COPB2 rs7374710。

表2 PCA外顯子區(qū)17個SNPs突變位點比較

50例PCA患者癌組織及癌旁正常組織分析結(jié)果顯示，BRCA1 rs16941與COPB2 rs7374710兩個SNP與PCA易感性相關(guān)(OR分別為 1.47， 1.27；95%CI分別為 1.14～1.72；1.20～1.41)。BRCA1 rs16941與COPB2 rs7374710 SNPs與PCA患者PSA值 及Gleason評分均呈正相關(guān)(OR分別為1.25，1.37；95%CI=1.10～1.84，1.20～2.34；P均< 0.01)。

3 討論

基因研究在預(yù)測PCA易感性并揭示其發(fā)病機制方面一直扮演著重角色，而基因測序是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。第一代測序技術(shù)以Sanger為代表，但其數(shù)據(jù)通量低、成本高，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展及大數(shù)據(jù)時代的到來，其弊端日益顯著。正是在這種背景下，下一代測序技術(shù)(NGS)應(yīng)運而生，其高通量、低成本、時間短的優(yōu)勢特征已成為目前基因研究的主流[14]。

NGS在PCA研究中主要涉及檢測基因突變、全基因組重測序、外顯子組測序、表觀遺傳變異檢測、RNA水平檢測和染色體結(jié)構(gòu)分析等[15]。液相雜交捕獲技術(shù)可用于外顯子測序，它是將感興趣的基因組區(qū)域定制成特異性探針與基因組DNA進行雜交，將目標基因組外顯子區(qū)域的DNA片段進行富集后再利用NGS技術(shù)進行測序的研究策略[16]。該技術(shù)能夠針對某類疾病的所有基因變異情況進行非常深入的研究。

Spans等[17]運用NGS對激素敏感性PCA外顯子區(qū)1 802個非同義SNPs和218個插入/缺失變異進行測序，證實PCA中雄激素受體(AR)和PTEN(兩個基因存在突變，并建立了PCA細胞基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因變異數(shù)據(jù)庫。Robbins等[18]利用NGS對577個腫瘤相關(guān)基因的3 508個外顯子進行靶向突變檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8p22、10q23.31、13q13.1、13q14.11和13q14.12上存在局部純合子缺失，定位于這些缺失區(qū)域的關(guān)鍵基因包括PTEN、BRCA2，C13ORF15和SIAH3。進一步發(fā)現(xiàn)在5p13.2p12、14q21.1、7q22.1和Xq12上有局部大量擴增，而定位于這些區(qū)域的關(guān)鍵基因包括AR、SKP2和FOXA1。Zuhlke等[19]用NGS對94例PCA樣本進行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)1例高加索種族患者在NBN基因14號外顯子存在2117C>G雜合子突變，該突變導(dǎo)致706密碼子(S707X)翻譯的提前終止，提示罕見的NBN突變與PCA易感性相關(guān)。Iacono等[20]選擇60對局部或局部進展PCA樣本進行NGS測序，結(jié)果鑒定出7種基因的8個遺傳變異，分別是TP53 p.P72R(78%)、兩個CSFR1 SNPs：rs2066934和rs066933(70%)、KDR p.Q472H(67%)、KIT p.M541L(28%)、PIK3CA p.I39M(19%)、MET p.V378I(10%)和FGFR3 p.F384L/p.F386L(8%)。并且證實TP53 p.P72R、CSFR1 SNPs、MET p.V378ISI四個SNPs與高級別PCA顯著相關(guān)；FGFR3 p.F384L/p.F386L SNP與T2b以下PCA相關(guān)；MET p.V378I SNP與早期生化復(fù)發(fā)相關(guān)，提示這些SNPs與PCA發(fā)生、進展及復(fù)發(fā)關(guān)系密切，有望成為預(yù)測PCA病情進展的指標。

本研究對臨床來源的PCA癌組織及癌旁組織進行測序，結(jié)果鑒定出16個基因的17個遺傳變異，最后通過在線PolyPhe-2及SIFT分析篩選到4個潛在功能的SNPs(BRCA1 rs16941、MET rs45483396、P53 rs121912655、COPB2 rs7374710)。臨床50例份PCA癌、癌旁組織標本中進行SNPs分型檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRCA1 rs16941、COPB2 rs7374710與PCA易感性有關(guān)。最后為了說明SNPs作為臨床早期預(yù)測及后期監(jiān)測的有效性，我們研究該SNPs與PCA常用評價指標PSA和Gleason評分之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，BRCA1 rs16941，COPB2 rs7374710均與PSA值及Gleason評分呈正相關(guān)，揭示其可作為臨床PCA早期診斷的分子標志物。本研究仍然存在一定的局限性，如前后納入PCA樣本量均較小、代表性不強，且組間存在異質(zhì)性，可能存在假陽性或假陰性結(jié)果。

綜上所述，PCA外顯子區(qū)存在BRCA1 rs16941、COPB2 rs7374710功能性突變位點，攜帶有BRCA1 rs16941、COPB2 rs7374710突變位點的個體罹患PCA的可能性較高。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016 [J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(4):7-30.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] Chen W, Zheng R, Zeng H, et al. Annual report on status of cancer in China, 2011 [J]. Chin J Cancer Res, 2015,27(1):2-12.

[4] Thompson IM, Pauler DK, Goodman PJ, et al. Prevalence of prostate cancer among men with a prostate-specific antigen level < or =4.0 ng per milliliter [J]. N Engl J Med, 2004,350(22):2239-2246.

[5] Gümü BH, Nee N, Gündüz MI, et al. Does asymptomatic inflammation increase PSA A histopathological study comparing benign andmalignant tissue biopsy specimens [J]. Int Urol Nephrol, 2004,36(4):549-553.

[6] Hochreiter WW. The issue of prostate cancer evaluation in men with elevated prostate-specific antigen and chronicprostatitis [J]. Andrologia, 2008,40(2):130-133.

[7] Thorpe A, Neal D. Benign prostatic hyperplasia [J]. Lancet, 2003,361(9366):1359-1367.

[8] Swanson GP, Thompson IM, Basler J. Current status of lymph node-positive prostate cancer: Incidence and predictors of outcome [J]. Cancer, 2006,107(3):439-450.

[9] 瞿旻,任善成,孫穎浩. PCA腫瘤標志物研究的新進展 [J]. 中華外科雜志,2015,53(4):317-320.

[10] Nordstrum T, Aly M, Eklund M, et al. A genetic score can identify men at high risk for prostate cancer among men with prostate-specific antigen of 1-3 ng/ml [J]. Eur Urol, 2014,65(6):1184-1190.

[11] Xu J, Mo Z, Ye D, et al. Genome-wide association study in Chinese men identifies two new prostate cancer risk loci at 9q31.2 and 19q13.4 [J]. Nat Genet, 2012,44(11):1231-1235.

[12] McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data [J]. Genome Res, 2010, 20(9):1297-1303.

[13] DePristo MA, Banks E, Poplin R, et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data [J]. Nat Genet, 2011, 43(5):491-498.

[14] Fullwood MJ, Wei CL, Liu ET, et al. Next-generation DNA sequencing of paired-end tags (PET) for transcriptome and genome analyses [J]. Genome Res, 2009,19(4):521-532.

[15] 吳大鵬,康健. 下一代測序技術(shù)在PCA的研究進展 [J]. 現(xiàn)代泌尿外科雜志,2014,19(1):62-66.

[16] Holmes BJ, Westra WH. The expanding role of cytopathology in the diagnosis of HPV-related squamous cell carcinoma of the head and neck [J]. Diagn Cytopathol, 2014,42(1):85-93.

[17] Spans L, Atak ZK, Van Nieuwerburgh F, et al. Variations in the exome of the LNCaP prostate cancer cell line [J]. Prostate, 2012,72(12):1317-1327.

[18] Robbins CM, Tembe WA, Baker A, et al. Copy number and targeted mutational analysis reveals novel somatic events in metastatic prostate tumors [J]. Genome Res, 2011,21(1):47-55.

[19] Zuhlke KA, Johnson AM, Okoth LA, et al. Identification of a novel NBN truncating mutation in a family with hereditary prostate cancer [J]. Fam Cancer, 2012 ,11(4):595-600.

[20] Lo Iacono M, Buttigliero C, Monica V, et al. Retrospective study testing next generation sequencing of selected cancer-associated genes in resectedprostate cancer [J]. Oncotarget, 2016,7(12):14394-14404.

無錫市醫(yī)院管理中心醫(yī)學(xué)科研聯(lián)合攻關(guān)項目( YGZXL1203；YGZXL 1318);無錫市科技發(fā)展資金(CSE31N1605)。

祝黎潔(E-mail： miniao1984@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.024

R737.25

B

1002-266X(2017)19-0077-04

2016-11-28)