增殖細胞核抗原67與胸腺激酶1在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中的表達

廖 媛，簡 燚，羅克樞

(1.成都市第六人民醫(yī)院病理科，四川 成都 660003；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科，四川 成都 610083)

增殖細胞核抗原67與胸腺激酶1在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中的表達

廖 媛1，簡 燚2，羅克樞2

(1.成都市第六人民醫(yī)院病理科，四川 成都 660003；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院病理科，四川 成都 610083)

目的 探討增殖細胞核抗原67(proliferating cell nuclear antigen 67，Ki-67)和胸腺激酶1 (thymidine kinase 1，TK1)在宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌中的表達及其相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組化方法檢測Ki-67、TK1在40例宮頸癌、40例宮頸上皮內(nèi)瘤變和20例正常宮頸上皮中的表達。結(jié)果 宮頸癌組織中Ki-67、TK1陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；高級別上皮內(nèi)瘤變(CINⅡ-Ⅲ)Ki-67、TK1高于低級別上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；相關(guān)分析表明，在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中Ki-67和TK1的表達有一定相關(guān)性；TK1和Ki-67在宮頸癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組高于無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組。結(jié)論 Ki-67與TK1對于宮頸上皮內(nèi)瘤變的分級預(yù)后有很好的指導(dǎo)作用。TK1 對判斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的病變程度及宮頸癌是否有復(fù)發(fā)傾向具有參考價值，且優(yōu)于 Ki-67。

宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌；增殖細胞核抗原67；胸腺激酶1

隨著人們生活方式的改變，宮頸癌變的發(fā)病率逐漸升高，宮頸癌已經(jīng)成為當前婦女主要的惡性腫瘤疾病。對宮頸癌進行早期診斷和治療，可以有效提高患者的治療效果，實現(xiàn)對患者病情的控制。Ki-67和TK1作為腫瘤增殖指數(shù)可以指導(dǎo)宮頸癌患者分級和預(yù)后，提高對患者CIN的分級和鑒別診斷效果。本文就Ki-67、TK1在正常宮頸上皮、CIN及宮頸癌中的應(yīng)用進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取成都軍區(qū)總醫(yī)院2012年1月至2015年12月的正常宮頸上皮、CIN及宮頸癌患者標本80例，患者年齡 23～69 歲，平均 39.8歲。對患者進行標本檢測和分析，由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進行診斷分類:慢性宮頸炎20例；低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)20例；高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)20例；其中CINⅡ10例，CINⅢ10例；宮頸癌40例。在收集標本時均對宮頸癌患者進行隨訪，除外2015年宮頸癌患者標本10例，對有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進行分類。

1.2 方法 所有標本均經(jīng)過10%甲醛溶液處理，石蠟包埋，進行連續(xù)切片，厚度保持在4 μm。每個標本分別制作Ki-67、TK1標記和陰性對照，采用SP法，DAB染色。單克隆抗體Ki-67和TK1分別購置于北京中杉和華瑞同康公司。結(jié)果判讀標準:Ki-67陽性表達顯示為棕黃色顆粒，定位于細胞核；TK1陽性表達主要定位于細胞漿。比較每個標本的陽性細胞數(shù):在顯示著色區(qū)域選取5個高倍鏡視野，對每個視野選取100個上皮腫瘤細胞進行計數(shù)，取平均值進行比較。無陽性細胞即陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計學(xué)處理。取各個標本的陽性細胞數(shù)計算平均值；各組間計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，相關(guān)分析采用Speraman檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67在不同組織中的表達 Ki-67在正常宮頸上皮的基底細胞核中也有表達，CIN的異型細胞核和大多數(shù)的宮頸癌細胞核，均呈中-強的棕黃色染色，見圖1。宮頸癌組織中Ki-67陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P< 0.05)，見表1。

圖1 不同組織中Ki-67的表達(PV9000×400)a:正常宮頸上皮組織；b:CINⅠ組織；c:CIN組織；d:宮頸癌組織

組別例數(shù)Ki-67TK1正常宮頸上皮2015.6±6.78.6±3.2CINⅠ(LSIL)2014.0±6.1#12.5±4.6#CINⅡ-Ⅲ(HSIL)2049.4±14.3#*41.4±12.7#*宮頸癌4047.2±26.2#73.9±19.6#

#與正常宮頸上皮相比，P< 0.05；*與CINⅠ相比，P< 0.05

2.2 TK1在不同組織中的表達 TK1主要表達于CIN基底細胞層和近基底細胞的胞漿，呈強或中等程度棕黃色著色，在宮頸癌中大多數(shù)腫瘤細胞呈強或中等強度的表達。在宮頸正常鱗狀上皮，表現(xiàn)為胞漿著色明顯減弱或無胞漿著色，見圖2。宮頸癌組織中TK1陽性細胞數(shù)高于宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P< 0.05)，見表2。

2.3 Ki-67、TK1與宮頸病變相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，Ki-67與TK1在宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌表達情況中呈正相關(guān)(r=0.768，P< 0.05)；Ki-67與宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌表達呈正相關(guān)(r=0.748，P= 0.000)；TK1與宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌表達呈正相關(guān)(r=0.882，P= 0.000)。

2.4 TK1和Ki-67 表達與宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

將出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者12例與無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者18例患者分組比較，結(jié)果顯示:復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組TK1、Ki-67表達的陽性細胞數(shù)均明顯高于無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(卡方值<0.05、P< 0.05)。

圖2 不同組織中TK1的表達(PV9000×400) a:正常宮頸上皮組織；b:CINⅠ組織；c:CINⅢ組織；d:宮頸癌組織

組別nTK1Ki-67復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組1268.5±15.0#55.7±17.8#*無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組1843.6±12.339.6±12.5

#與無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組比較，P< 0.05； *與TK1比較，P< 0.05

3 討論

宮頸癌的形成、浸潤和轉(zhuǎn)移是非常復(fù)雜的病變過程，與多個基因和抑癌基因的表達、調(diào)控以及細胞凋亡有關(guān)。宮頸上皮不典型增生-原位癌，這系列癌前病變的連續(xù)過程統(tǒng)稱為宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN 。根據(jù)不典型增生的程度和范圍，CINⅠ級相當于低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變，CINⅡ和Ⅲ相當于高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變。各級CIN可有發(fā)展成浸潤性癌的趨向，級別越高發(fā)展為浸潤癌的機會越多。除了在光鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化，還需要尋找有助于區(qū)別宮頸鱗狀上皮良性反應(yīng)性增生和CIN病變的檢測，尤其是CIN病變的免疫組化標記物，以減少不必要的誤診和漏診。

Ki-67抗原為細胞核內(nèi)分裂增殖相關(guān)蛋白，主要定位于細胞核，與細胞周期密切相連。與其他反應(yīng)細胞增殖的指標如細胞增殖核抗原(PCNA)[1]、DNA聚合酶相比，Ki-67半衰期短，細胞脫離增殖周期后迅速降解，能較好地反應(yīng)細胞的增殖潛能。有研究結(jié)果提示，通過Ki-67免疫組化染色檢測到的腫瘤增殖指數(shù)與腫瘤惡性程度、組織學(xué)特征和生物學(xué)行為緊密相關(guān)[2]。本研究中，Ki-67在正常宮頸上皮少部分呈陽性表達，局限于基底細胞層。隨著CIN病變的加重，表達范圍由基底層逐漸向表層擴展，與異型細胞的發(fā)展相一致。在宮頸癌中大多數(shù)的癌細胞均呈陽性表達。這一結(jié)果表明在宮頸細胞的癌變過程中，隨著級別的增高，腫瘤細胞的增殖活性逐漸增強，最終得以無限增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，說明Ki-67與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3，4]。Ki-67作為細胞增殖標記物，除在正常宮頸鱗狀上皮基底層表達外，良性反應(yīng)性增生與CINⅠ也可表達，故在鑒別診斷增生性病變時，Ki-67最好與其他抗體聯(lián)合。

TK的2種同工酶 TK1、TK2分別定位于細胞質(zhì)和細胞核。TK1是合成DNA的關(guān)鍵酶之一，增殖周期中的TK1均有不同程度的表達。大量試驗研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血液中TK1均不同程度地超過正常水平[5]。Morimot等對肝臟部分切除后大鼠血清TK1進行檢測，發(fā)現(xiàn)在大鼠手術(shù)恢復(fù)期，其肝臟TK1活性明顯增高，從而證實其在細胞增殖過程中的作用。這使TK1成為腫瘤生長及細胞增殖的標記。而細胞增殖是影響腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，因此可推測TK1可能與腫瘤的預(yù)后有關(guān)[6]。目前文獻中有關(guān)TK1與腫瘤預(yù)后關(guān)系的研究中，多以血清TK1濃度及血清TK1活性作為觀測指標[7]，這2項指標雖然檢測較簡便，但因其可能受到血清蛋白及細胞分解等因素的影響，有一定的局限性，故有學(xué)者提出以免疫組化的方法檢測TK1在腫瘤組織的表達情況。目前這種研究方法已被應(yīng)用于乳腺癌[8]、膀胱癌[9]及肺癌[10]的研究。宮頸癌的發(fā)生就是正常宮頸上皮在各種損傷因子及HPV的作用下，導(dǎo)致黏膜活性大大增強。因此，通過檢測血清及免疫組化方法檢測TK1和正常宮頸上皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi) TK1含量和表達強度，就有可能為判斷宮頸癌上皮細胞從良性到惡性變化，從量變到質(zhì)變的過程和狀態(tài)提供了依據(jù)。

本文結(jié)果顯示，宮頸癌組織中TK1的陽性表達率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變及正常宮頸上皮組織，提示過表達的TK1可能與宮頸上皮過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)；對 TK1的表達情況與宮頸上皮內(nèi)瘤變的各級分期進行分析，發(fā)現(xiàn)TK1表達與宮頸上皮內(nèi)瘤變的低級別和高級別表達正逐漸增生，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，過量表達與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，對于判斷其進展及預(yù)后意義有一定作用[11]。研究表明[12]TK1在中晚期宮頸癌患者放化療前后有降低，說明同步放化療可以降低癌的增殖指數(shù)和增殖活性，TK1能夠正確評估中晚期宮頸癌的治療療效。

有研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾族婦女宮頸鱗癌中TK1基因及其相應(yīng)蛋白的陽性表達明顯高于對照組宮頸組織中的陽性表達，表明此基因與維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。研究證實，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤體積是判定宮頸癌預(yù)后的重要因素。研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌腫瘤體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與TK1表達呈正相關(guān)，表明TK1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移發(fā)生機制密切相關(guān)[13]，對判定宮頸癌預(yù)后有實際意義。與我們的研究相似，TK1與Ki-67在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組表達率明顯高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P< 0.05)，TK1增殖活性高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于Ki-67表達高的宮頸癌患者。本研究還發(fā)現(xiàn)除核周胞漿表達TK1外，部分陽性細胞還可出現(xiàn)核的表達，核陽性的意義及是否與宮頸癌預(yù)后有關(guān)，還有待擴大樣本進一步研究。

TK1作為研究細胞增殖程度的新的標志物，其與Ki-67的細胞增殖周期特征不同，主要在S期表達并定位于細胞質(zhì)，而 Ki-67表達于除G0期外的各期[14]。Ki-67在某些良惡性疾病間的表達有一些交叉，例如淋巴結(jié)中正常濾泡中心細胞Ki-67呈強陽性高表達，在炎細胞中Ki-67也要表達，有些良性病變的Ki-67指數(shù)甚至高于某些惡性病變，葉芳萍等研究發(fā)現(xiàn)，良性前列腺增生及正常前列腺組織中幾乎檢測不到TK1和Ki-67，而前列腺上皮內(nèi)瘤增殖細胞TK1和Ki-67的檢出率為16% ～17%，前列腺癌組織中TK1檢出率高于Ki-67的檢出率。我們的研究也表明TK1[15]比Ki-67更靈敏，能為治療和預(yù)后提供有價值的信息。

因此單獨依靠Ki-67來鑒別這些疾病時要慎重。通過本研究及之前相關(guān)研究顯示，聯(lián)合檢測TK1和Ki-67更有利于觀測腫瘤的增殖程度、生物學(xué)性質(zhì)以及輔助病理學(xué)診斷。另外在方法學(xué)檢測的優(yōu)勢上，TK1表現(xiàn)出細胞質(zhì)定位特征的免疫組化原位檢測要比其他檢測方法更精確[16]。

TK1與Ki-67均與細胞增殖相關(guān)，因此兩者存在相關(guān)性，在本研究中也得到進一步驗證，但是兩者又不完全一致，在本實驗中部分病例表達TK1，而沒有表達Ki-67；而部分病例僅表達Ki-67而沒有表達TK1。這可能由于TK1主要表達于S期細胞漿，而Ki-67表達于G1、S、G2、M期細胞核，Ki-67表達更廣，而TK1靈敏度更高。所以兩者聯(lián)合標記更能真實反映宮頸癌中增生細胞的表達[17]，為腫瘤的分級預(yù)后提供準確的依據(jù)。

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The expressions of Ki-67 and TK1 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma

LIAO Yuan，JIAN Yi，LUO KE-shu

(1.Department of Pathology，Chengdu 6th People’s Hospital，Chengdu 660003，China；2.Department of Pathology，Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083，China)

JIAN Yi

Objective To explore the expressions of proliferating cell nuclear antigen 67(Ki-67) and thymidine kinase 1(TK1) in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma.Methods Immunohistochemical method was used to detect the expressions of Ki-67 and TK1 in 40 cases of cervical carcinoma tissues，40 cases of cervical intraepithelial neoplasia tissues and 20 cases of normal cervical tissues.Results In cervical carcinoma，positive expression rates of Ki-67 and TK1 were significantly higher than those in cervical carcinoma tissues and normal cervical tissues (P< 0.05).In CIN Ⅱ～Ⅲ，numbers of Ki-67 and TK1 positive cells were higher than that in CINⅠ (P< 0.05).Correlation analysis showed that the expressions of Ki-67 and TK1 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer were correlated at certain degree.The expressions of TK1 and Ki-67 in cervical cancer were higher in cases with recurrence or metastasis than those without recurrence or metastasis.Conclusion Ki-67 and TK1 could play an important role in the genesis and development of cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma

Cervical carcinoma； Cervical intraepithelial neoplasia； Proliferating cell nuclear antigen67； Thymidine kinase 1

簡 燚

R737.33

A

1672-6170(2017)01-0055-04

2016-06-18；

2016-11-03)