結(jié)核分枝桿菌higA基因的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析*

董 娜，劉 丹，付玉榮，伊正君△

(濰坊醫(yī)學(xué)院:1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系；2.臨床學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東濰坊 261053)

結(jié)核分枝桿菌higA基因的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析*

董 娜1，劉 丹1，付玉榮2，伊正君1△

(濰坊醫(yī)學(xué)院:1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系；2.臨床學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東濰坊 261053)

目的 對(duì)結(jié)核分枝桿菌的higA基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用生物信息學(xué)方法分析其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。方法 從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA中擴(kuò)增higA基因，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件分析higA蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、空間結(jié)構(gòu)、抗原表位等。結(jié)果 higA基因擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期一致，大小為450 bp。higA蛋白共149個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)7.93，脂溶性系數(shù)94.30，不穩(wěn)定系數(shù)36.57，預(yù)測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。higA蛋白無(wú)信號(hào)肽，含10個(gè)磷酸化位點(diǎn)和多個(gè)潛在的抗原表位。結(jié)論 成功擴(kuò)增出結(jié)核分枝桿菌higA基因。

分枝桿菌，結(jié)核；基因擴(kuò)增；higA；生物信息學(xué)分析

據(jù)WHO 2015年結(jié)核統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示， 2014年結(jié)核病全球新發(fā)病例960萬(wàn)，150萬(wàn)死于肺結(jié)核，我國(guó)新發(fā)結(jié)核病例93萬(wàn)人，居世界第33位[1]。目前，結(jié)核病的藥物治療主要是針對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核，而潛伏性和耐藥性肺結(jié)核為結(jié)核病治療的兩大難題。因此，深入研究結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)的耐藥性和持留性的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病治療的新靶點(diǎn)，研發(fā)新藥，阻止結(jié)核病疫情的發(fā)展至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，大量細(xì)菌的持留性和耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制是由于毒素-抗毒素系統(tǒng)(TAS)的激活[2-3]，抗毒素被細(xì)胞內(nèi)Lon和Clp蛋白酶降解或消耗[4]，毒素蛋白釋放出來(lái)，干擾或改變細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)、細(xì)胞壁合成和DNA復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或耐藥持久性的形成[5]，毒素還可以中和細(xì)菌中質(zhì)粒的抗性[6]。Kim等[7]和Fineran等[8]等研究發(fā)現(xiàn)TAS與細(xì)菌生物膜的形成及噬菌體的防御密切相關(guān)。致病性的MTB中有88對(duì)假定的TAS[9]，而非致病性的恥垢分枝桿菌僅有2對(duì)假定的TAS，進(jìn)一步說(shuō)明TAS的數(shù)量與細(xì)菌的致病性相關(guān)[10]。

higBA TAS由細(xì)菌染色體編碼，屬于Ⅱ型TAS。在對(duì)higBA作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，higA通過(guò)直接抑制 higB P2啟動(dòng)子表達(dá)，進(jìn)一步控制Rv1954A-Rv1957(Rv1955-higB毒素和Rv1956-higA抗毒素)的表達(dá)[11]，刪除higA抗毒素時(shí) higB毒素異常高表達(dá)，導(dǎo)致MTB死亡[12]。因此，若能利用higBA系統(tǒng)調(diào)控MTB的凋亡，將是結(jié)核病治療方面的重大突破。

1 材料與方法

1.1 材料 MTB H37Rv基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑：Prime STAR?HS DNA Polymerase、2×GC Buffer、Taq酶、PCR引物均購(gòu)自山東賽恩斯科技有限公司。DNA Marker購(gòu)自重慶海韻生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 從GenBank中檢索H37Rv higA的基因編碼序列，用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物P1:5′-GAT GGT ACC ATG AGC ATT GAC TTC CCT-3′；下游引物P2:5′-CTA AAG CTT TCA TGC CAC CTC AAC CTG-3′，引物長(zhǎng)度為27 bp。引物由山東賽恩斯科技有限公司合成。

1.2.2 MTB higA基因的PCR擴(kuò)增 以MTB基因組DNA作為反應(yīng)模板，P1，P2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：無(wú)菌水為17.7 μL，2×GC Buffer為25.0 μL，dNTP為 4.0 μL，P1、P2 各1.0 μL，DNA模板為1.0 μL，Taq酶為0.3 μL，總體積為50.0 μL。擴(kuò)增條件：共35個(gè)循環(huán)，其中95.0 ℃預(yù)變性3 min；98.0 ℃ 10 s；59.8 ℃ 10 s；72.0 ℃ 45 s；最后72.0 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 higA基因的PCR產(chǎn)物序列分析 將經(jīng)初步鑒定正確的PCR產(chǎn)物送南京巴傲德生物科技有限公司測(cè)序，并通過(guò)NCBI上的Blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 higA蛋白的生物信息學(xué)分析 利用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)EXPASYP Proteomic中Protparam程序分析higA蛋白的理化性質(zhì)，利用protscale、SignaIP 4.1和MotifScan分析higA蛋白的親(疏)水性、信號(hào)肽以及翻譯后修飾位點(diǎn)。采用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)EXPASY proteomic中的GOR4 和SWISS_MODEL 進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析和空間構(gòu)象的模擬。利用Bepipred 1.0b server 和SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)higA蛋白的抗原表位。

2 結(jié) 果

2.1 higA基因的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在450 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致，見圖1。

M：DNA-相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1：higA基因PCR產(chǎn)物。

圖1 higA基因的PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 higA蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 higA蛋白的理化性質(zhì) 該蛋白由149個(gè)氨基酸組成，其中Ala(A)丙氨酸17個(gè)，占總氨基酸的11.4%，含量最高。分子式為C735H1195N221O219S4，原子總數(shù)2 374，相對(duì)分子質(zhì)量16 760.1，理論等電點(diǎn)7.93，脂溶性系數(shù)94.30，不穩(wěn)定系數(shù)36.57 ，為穩(wěn)定性蛋白。當(dāng)成熟肽末端為甲硫氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。利用SignaIP 4.1，分析蛋白的氨基酸序列顯示無(wú)信號(hào)肽。higA蛋白的平均疏水性系數(shù)為-0.349 (圖2)，為親水性蛋白。

圖2 higA蛋白的親(疏)水性

2.2.2 higA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 應(yīng)用GOR4進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，α-螺旋(Hh)、β-折疊(Ee)、β-轉(zhuǎn)角(Tt)和無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)所占比例分別為43.62%、17.45%、4.70%、34.23%，該蛋白無(wú)規(guī)則卷曲含量高，結(jié)構(gòu)比較松散。

2.2.3 higA蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn) 經(jīng)Motif Scan分析，higA蛋白共有10個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)：5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(28-31、52-55、68-71、101-104、117-120)，5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(24-26、101-103、113-115、117-119、142-144)。

2.2.4 33級(jí)結(jié)構(gòu)利用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)EXPAY proteomic (http://expasy.org/tools/#pattern )43級(jí)結(jié)構(gòu)模型組裝軟件SWISS-MODEL模擬higA的三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 higA蛋白的同源模建空間結(jié)構(gòu)

2.2.5 抗原表位的預(yù)測(cè) 利用Bepipred 1.0b server 軟件預(yù)測(cè)higA蛋白質(zhì)有1個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位,位置在1aa-9aa。應(yīng)用SYFPEITHI在線程序預(yù)測(cè)higA共含有10個(gè)CTL細(xì)胞表位見表1；6個(gè)Th細(xì)胞表位見表2。

表1 SYFPEITHI預(yù)測(cè)higA的限制性CTL表位

表2 SYFPEITHI預(yù)測(cè)higA的輔助性T細(xì)胞表位

3 討 論

TAS最早是在1983年由Ogura和Hiraga作為質(zhì)粒的穩(wěn)定系統(tǒng)而發(fā)現(xiàn)的。TAS共5種類型，其中Ⅱ型TAS由染色體或質(zhì)粒編碼，共9個(gè)家族(ccd AB、maz EF、vap BC、phd/doc、par DE、hig BA、rel BE、 hip B和hic AB)，通過(guò)蛋白復(fù)合物抑制毒素蛋白的活性[8]，與細(xì)菌壓力狀態(tài)下的存活狀態(tài)、耐藥性和持留性密切相關(guān)[13]。因此，可通過(guò)TAS來(lái)解決臨床上耐藥和持留菌的治療問(wèn)題。

近年來(lái)，隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)大，生物信息學(xué)方法在微生物致病性研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在疾病防治中發(fā)揮重大作用[14-15]。本研究從MTB基因組中成功克隆出higA基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)higA蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白共149個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn) 7.93，屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，呈疏水性。β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲位于蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有優(yōu)勢(shì)抗原表位[16]。higA蛋白中β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量高，提示其容易與抗體嵌合，可能含有潛在的抗原表位。higA蛋白的空間構(gòu)象能夠直觀的展示蛋白質(zhì)的立體構(gòu)象，對(duì)進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等具有重大意義。綜上所述，本研究初步認(rèn)識(shí)了higA蛋白的基本結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究higA蛋白在結(jié)核病治療的應(yīng)用價(jià)值方面提供了更多的理論依據(jù)。

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Analysis of amplification and bioinformatics on mycobacterium tuberculosis protein higA*

DongNa1,LiuDan1,FuYurong2,YiZhengjun1△

(1.DepartmentofMedicalLaboratory；2.DepartmentofPathogenBiology,WeifangMedicalUniversity，Weifang，Shandong261053,China)

Objective To amplify the higA gene from the Mycobacterium tuberculosis,and to analyze the structure and function of their encoded proteins by using bioinformatics.Methods Total DNA was extracted from Mycobacterium tuberculosis.PCR of higA was performed and the products were sequenced.The biological features of the higA protein including，its physical and chemical properties,signal peptide,spatial structure and epitopes were analyzed by using software online.Results The PCR products of higA were 450 bp in length，which were consistent with the expected size.The higA protein consisted of 149 amino acids and had the following characteristics:a theoretical isoelectric point of 7.93，a fat-soluble factor of 94.30，and instability coefficient of 36.57.The higA protein had no signal peptide,containing 10 phosphorylation sites and multiple potential epitopes.Conclusion Mycobacterium tuberculosis higA gene can be amplified by PCR and the characteristics of higA protein is identified.

mycobacterium tuberculosis；gene amplification；higA；bioinformatics analysis

物信息學(xué)·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.024

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470001，81170080)。 作者簡(jiǎn)介： 董娜(1990-)，在讀碩士，主要從事分子診斷方面研究。△

，E-mail:fuyizhengjun@163.com。

R378.91

A

1671-8348(2017)14-1944-03

2016-11-20

2017-01-06)