外周血MMP-9及NF-κB在OSAHS合并高血壓中的表達及其相關(guān)性研究*

譚小燕，況九龍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330006)

外周血MMP-9及NF-κB在OSAHS合并高血壓中的表達及其相關(guān)性研究*

譚小燕，況九龍△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330006)

目的 探討血漿基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)合并高血壓發(fā)病中的作用。方法 選取2014年1月至6月在該院呼吸內(nèi)科及神經(jīng)內(nèi)科行多導(dǎo)睡眠監(jiān)測的受試者，根據(jù)睡眠監(jiān)測檢查結(jié)果及是否合并高血壓進行分組，鼾癥組23 例，OSAHS組 32例，OSAHS合并高血壓組31例；并根據(jù)高血壓級別對OSAHS合并高血壓組進行亞組分型,其中OSAHS合并高血壓1級組9例，2級組9例，3級組13例。分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和實時熒光定量PCR的方法檢測血漿MMP-9水平及單個核細胞中 MMP-9 和 NF-κB基因的表達水平。結(jié)果 OSAHS合并高血壓組血漿MMP-9水平、單個核細胞MMP-9 mRNA和NF-κB mRNA的表達水平均明顯高于鼾癥組和OSAHS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OSAHS合并高血壓3級組血漿MMP-9水平、單個核細胞MMP-9 mRNA和NF-κB mRNA的表達水平均明顯高于OSAHS合并高血壓1級組及2級組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血漿MMP-9水平、 MMP-9 mRNA及NF-κB mRNA的表達與呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)、氧減指數(shù)(ODI)呈正相關(guān)(P<0.05)，與最低血氧飽和度(LSaO2)呈負相關(guān)(P<0.05)。血漿MMP-9水平與單個核細胞MMP-9 mRNA的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。單個核細胞MMP-9 mRNA的表達與NF-κB mRNA的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 血漿MMP-9水平、 MMP-9 mRNA及NF-κB mRNA的表達水平在OSAHS合并高血壓患者中明顯增高并與疾病的嚴重程度相關(guān)，MMP-9在OSAHS合并高血壓發(fā)病中起著重要作用，可能受NF-κB通路的調(diào)節(jié)。

睡眠呼吸暫停，阻塞性；睡眠呼吸暫停綜合征；呼吸障礙；高血壓；基質(zhì)金屬蛋白酶9；NF-κB

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是一種主要表現(xiàn)為睡眠時伴有打鼾，甚至呼吸暫停等特點，易導(dǎo)致白天嗜睡，記憶力下降的疾病[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，OSAHS與心血管疾病如高血壓、缺血性心臟病、充血性心力衰竭和中風(fēng)之間有明確的關(guān)聯(lián)[2]。高血壓患者中伴有OSAHS的大約占30%～50%，而在OSAHS的患者中，合并患有高血壓約占50%～60%[3]。然而，目前對于OSAHS引起高血壓的確切病理機制尚不清楚,其中炎癥反應(yīng)可能是其重要機制之一[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是一種蛋白水解酶，研究發(fā)現(xiàn)在OSAHS患者血漿中MMP-9表達增加，并且與患者病情的嚴重程度有關(guān)[5]。而核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)是一種重要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，研究表明在OSAHS患者中，炎性因子白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-8等的表達上調(diào)，均受NF-κB的調(diào)控[6]。但目前對于OSAHS合并高血壓患者中MMP-9和NF-κB的表達及其之間相關(guān)性尚不明確。本研究旨在探討MMP-9和NF-κB在OSAHS合并高血壓發(fā)病中的作用，為進一步研究OSAHS與高血壓之間的相關(guān)機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至6月在本院呼吸內(nèi)科及神經(jīng)內(nèi)科行多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(PSG)的受試者。所有入選患者均簽署知情同意書。OSAHS的診斷標準參照2002年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)組制訂的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》，高血壓的診斷標準參照2005年制訂的《中國高血壓防治指南》。根據(jù)睡眠監(jiān)測檢查結(jié)果及是否合并高血壓進行分組，鼾癥組23例，OSAHS組32例，OSAHS合并高血壓組31例，總共86例患者，其中男65例，女 21 例。并根據(jù)高血壓級別對OSAHS合并高血壓組進行亞組分型,其中OSAHS合并高血壓1級組9例，OSAHS合并高血壓2級組9例，OSAHS合并高血壓3級組13例。排除標準：(1)具有慢性或近期(包括近1個月內(nèi))感染性疾病，如哮喘、風(fēng)濕性疾病、周圍血管性疾病、凝血功能障礙性疾病及肝腎疾??；(2)近期(3個月內(nèi))有創(chuàng)傷及手術(shù)史；(3)在睡眠監(jiān)測過程中,夜間睡眠時間未達到4 h或睡眠監(jiān)測過程中發(fā)生嚴重的低氧血癥而需要中途吸氧者；(4)多導(dǎo)睡眠檢測前因血壓高需臨時加服降壓藥物者。入選患者均需測量身高、體質(zhì)量、頸圍、腰圍、血壓，記錄PSG結(jié)果，次日清晨收集外周靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 引物序列的設(shè)計與合成 使用Premier5.0軟件設(shè)計引物，設(shè)計的引物經(jīng)局部序列比對基本檢索工具(BLAST)驗證合適后采納，引物由上海生物工程合成，序列如下。MMP-9基因上游引物為：5′-ACC CTT GTG CTC TTC CCT-3′(18 bp)，下游引物為：5′-GGT TCG CAT GGC CTT CAG-3′(18 bp)；NF-κB基因上游引物為：5′-TCT CGC CTG CCT CCA CAA G-3′(19 bp)，下游引物為：5′-TGT CTC CAC GCC GCT GTC-3′(18 bp)；內(nèi)參GAPDH基因上游引物為：5′-GGT TCG CAT GGC CTT CAG-3′(18 bp)，下游引物為：5′-AGG AGT GGG TGT CGC TGT-3′(18 bp)。

1.2.2 血漿和單個核細胞提取 清晨空腹用含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集受試者外周血標本8 mL，取4 mL血置于離心機上3 500 r/min離心10 min，吸取上層血漿于干凈EP管中，立即放入-80 ℃冰箱保存。另取4 mL靜脈血按照人淋巴細胞分離液(北京索萊寶公司)操作步驟分離單個核細胞，并加入1 mL Trizol試劑(北京索萊寶公司)后放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 RNA抽提 根據(jù)Trizol總RNA提取試劑的操作步驟進行操作，用紫外分光光度計測量260和280 nm下的光密度(OD)值并進行定量，計算OD260/OD280，所有標本的比值要求在1.8～2.0。低于此值者表明其含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，用三氯甲烷重新提純?？俁NA樣品于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將配制好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液低速離心混勻，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為：37 ℃ 30 min、85 ℃ 15 s。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物保存于-20 ℃。

1.2.5 實時熒光定量PCR 按Takara熒光定量PCR試劑盒配制實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，選擇還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)為內(nèi)參基因，每份標本內(nèi)參基因和待測基因均做3個復(fù)孔，所有操作均應(yīng)置于冰上實施。體系配制完后先低速離心混勻。使用ABI 7300定量PCR擴增儀采用兩步法擴增。擴增條件如下，預(yù)變性循環(huán)：1 95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)循環(huán)：40 95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s。反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄結(jié)果。以SYBR Green實時定量PCR為基礎(chǔ)，實驗數(shù)據(jù)以GAPDH為內(nèi)參，計算MMP-9 mRNA及NF-κB mRNA的相對表達量，計算公式：目的基因相對表達量=2-△△Ct，其中△△CT=[CT(實驗組目的基因)-CT(實驗組內(nèi)參基因)]-[CT(對照組目的基因)-CT(對照組內(nèi)參基因)]。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)反應(yīng) 按照ELISA試劑盒(購自武漢伊萊瑞特公司)操作步驟進行加樣，最后用酶標儀在450 nm波長下測定OD，根據(jù)測定的OD值，在標準曲線繪制軟件繪制標準曲線，并計算出樣品中MMP-9的最終濃度。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測 應(yīng)用熒光定量PCR檢測MMP-9 mRNA及NF-κB mRNA，結(jié)果見圖1，可見熔解曲線為特異性單峰，擴增曲線平滑，說明引物合格，結(jié)果可以使用。

圖1 實時熒光定量PCR檢測各基因的溶解曲線和擴增曲線圖

2.2 各組患者一般資料和睡眠監(jiān)測指標比較 鼾癥組、OSAHS組、OSAHS合并高血壓組3組之間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與鼾癥組相比，OSAHS組及OSAHS合并高血壓組在BMI、頸圍、腰圍中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但OSAHS組與OSAHS合并高血壓組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在PSG指標方面，與鼾癥組相比，OSAHS組及OSAHS合并高血壓組在嗜睡評分(ESS)、氧減指數(shù)(ODI)、最低血氧飽和度(LSaO2)中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但OSAHS組與OSAHS合并高血壓組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組一般資料和PSG指標比較

a：P<0.05，與鼾癥組比較。

表2 各組MMP-9、NF-κB表達水平比較

a：P<0.05，與鼾癥組比較;ab：P<0.05，與OSAHS組比較。

表3 OSAHS合并高血壓組亞組分析

a：P<0.05，與OSAHS合并高血壓1級組比較;b：P<0.05，與OSAHS合并高血壓2級組比較。

2.3 各組MMP-9、NF-κB表達水平比較 OSAHS組血漿中MMP-9水平，單個核細胞中MMP-9 mRNA、NF-κB mRNA明顯高于鼾癥組，且OSAHS合并高血壓組較OSAHS組更高，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4 OSAHS合并高血壓組亞組分析 本研究對OSAHS合并高血壓組中高血壓的級別進行亞組分析后發(fā)現(xiàn)，隨著OSAHS合并高血壓級別的升高，血漿中MMP-9水平，單個核細胞MMP-9 mRNA的表達水平及NF-κB mRNA表達水平也隨之增高，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.5 相關(guān)性分析 血漿MMP-9的表達與呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)呈正相關(guān)(r=0.439，P<0.05)，與LSaO2呈負相關(guān)(r=-0.315，P<0.05)，與ODI呈正相關(guān)(r=0.352，P<0.05)，而與BMI、頸圍、腹圍、ESS無明顯相關(guān)性；外周血單個核細胞MMP-9的表達與AHI呈正相關(guān)(r=0.239,P<0.05)，與LSaO2呈負相關(guān)(r=-0.268，P<0.05)，與ODI呈正相關(guān)(r=0.216，P<0.05)，而與BMI、頸圍、腹圍、ESS無明顯相關(guān)性。外周血單個核細胞NF-κB的表達與AHI呈正相關(guān)(r=0.369,P<0.05)，與LSaO2呈負相關(guān)(r=-0.489，P<0.05)，與ODI呈正相關(guān)(r=0.354，P<0.05)，而與BMI，頸圍，腹圍，ESS無明顯相關(guān)性。血漿MMP-9的表達與外周血單個核細胞MMP-9 mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05)。外周血單個核細胞MMP-9 mRNA的表達與NF-κB mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.479，P<0.05)。

3 討 論

OSAHS不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且與多種疾病密切相關(guān)，如心血管疾病、糖尿病、記憶力減退等，甚至可能誘發(fā)夜間心源性猝死[7]。OSAHS主要以反復(fù)慢性夜間缺氧為特征，通過激活炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多種機制，參與心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，是高血壓的獨立危險因素。

MMP-9，也被稱為92×103Ⅳ型膠原酶或明膠酶B，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一[8]。循環(huán)中的MMP-9表達在急性心肌梗死及不穩(wěn)定型心絞痛中升高[9]。而循環(huán)MMP-9還被認為是急性冠狀動脈綜合征病死率的預(yù)測指標，在心臟血管的重塑中發(fā)揮著重要作用，是急性冠狀動脈綜合征猝死的重要危險因子之一[10]。MMP-9的異常表達及其對細胞外基質(zhì)的降解與心血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切。Chuang等[5]和Feng等[11]研究均發(fā)現(xiàn)，在OSAHS患者中，血漿MMP-9的表達水平明顯高于對照組，并且與AHI和LSaO2顯著相關(guān)。這點與本研究是一致的。同時本研究還發(fā)現(xiàn)在OSAHS合并高血壓的患者中血漿MMP-9表達更高，且隨著高血壓的級別越高，MMP-9的表達也越高。這表明MMP-9可能與OSAHS合并高血壓的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

外周血單個核細胞被認為參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程。Minoguchi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在中、重度OSAHS患者外周血單個核細胞TNF-α的表達明顯高于對照組，且經(jīng)過呼吸機有效治療后，血漿中TNF-a及單個核細胞TNF-a的表達可降低。這表明OSAHS患者單個核細胞可被激活。由于外周血單個核細胞的激活，進而可刺激多種炎性因子的釋放，從而導(dǎo)致一系列的炎性反應(yīng)。MMP-9也是炎性因子之一，Chuang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在OSAHS循環(huán)中MMP-9及單個核細胞MMP-9 mRNA的表達水平明顯高于對照組，且兩者呈相關(guān)性，但其研究的標本量較少。故本研究在其研究的基礎(chǔ)上擴大研究的樣本量，與其結(jié)果是一致的，表明血漿中MMP-9的異常增加可能與OSAHS患者循環(huán)中單個核細胞激活相關(guān)。但本研究還發(fā)現(xiàn)，在OSAHS合并高血壓的患者中，外周血單個核細胞MMP-9的表達水平明顯增高，表明OSAHS合并高血壓患者罹患動脈粥樣硬化的風(fēng)險可能更大。

NF-κB是一種可通過與多種基因的啟動子上κB序列特異性結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白，在機體防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、組織損傷、細胞分化、細胞黏附和凋亡等各個方面起著重要作用[13]。Ryan等[6]將內(nèi)皮細胞分別給予間斷性缺氧及持續(xù)缺氧，發(fā)現(xiàn)慢性間斷缺氧主要以激活NF-κB為主。另外多個臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在OSAHS患者中血漿及外周血單個核細胞中NF-κB的表達明顯高于對照組，并且隨著疾病越嚴重，NF-κB的表達越高[14-15]，這點與本研究一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，在OSAHS合并高血壓的患者外周血NF-κB mRNA較單純OSAHS表達更高。并且把其與單個核細胞MMP-9 mRNA的表達進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者具有相關(guān)性，這表明在OSAHS患者中MMP-9的表達可能與NF-κB相關(guān)，MMP-9可能受促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)，從而在OSAHS合并高血壓的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，血漿MMP-9水平、 MMP-9 mRNA及NF-κB mRNA的表達水平在OSAHS合并高血壓患者中明顯增高，并與疾病的嚴重程度相關(guān)。MMP-9在OSAHS合并高血壓發(fā)病中起著重要作用，可能受NF-κB通路的調(diào)節(jié)。OSAHS合并高血壓患者是ACS心血管死亡的一個重要危險因素，在未來可能將干預(yù)NF-κB及其MMP-9的表達作為診治OSAHS及其并發(fā)癥的一個重要突破點。

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The expression and correlation of MMP-9 and NF-κB in obstructive sleep apnea syndrome patients with hypertension*

TanXiaoyan，KuangJiulong△

(DepartmentofRespiratory，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang,Jiangxi330006，China)

Objective To investigate the role of plasma matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and nuclear factor kappa B (NF-κB) in the pathogenesis of obstructive sleep apnea hypopnea syndrome (OSAHS) complicated with hypertension.Methods The patients were selected in the respiratory medicine and neurology of our hospital from January 2014 to June 2014.Polysomnography(PSG) monitoring was employed to assess the patient.All patients were divided into 3 groups,including snoring group(23 cases),OSAHS group(32 cases),OSAHS with hypertension group(31 cases).And then according to the hypertension stage,OSAHS with hypertension group was divided into 3 groups,including OSAHS with stage 1 hypertension group(9 cases),OSAHS with stage 2 hypertension group(9 cases),OSAHS with stage 3 hypertension group(13 cases).The plasma MMP-9 was measured by ELISA.The mRNA expression levels of MMP-9 and NF-κB were detected by real-time quantitative PCR.Results The levels of MMP-9 and MMP-9 mRNA and NF-κB mRNA in OSAHS with hypertension group were significantly higher than those of snoring group and OSAHS group and the differences were statistically significant(P<0.05).The expression of MMP-9，the MMP-9 and NF-κB mRNA expression of monocytes in OSAHS with stage 3 hypertension group was significantly higher than those of OSAHS with stage 1 hypertension group and OSAHS with stage 2 hypertension group and the differences were statistically significant(P<0.05).The plasma MMP-9 was positively correlated with AHI and oxygen desaturation index and negatively correlated with LSaO2(P<0.05).The plasma MMP-9 was positively correlated with the MMP-9 mRNA expression(P<0.05).The MMP-9 mRNA expression was positively correlated with the NF-κB mRNA expression(P<0.05).Conclusion The plasma concentrations of MMP-9，the MMP-9 and NF-κB mRNA expression of monocytes in OSAHS with hypertension patients was significantly high,which is associated with disease severity and degree of hypoxia.The MMP-9 might play an important role in the pathogenesis of OSAHS with hypertension and be regulated by NF-κB pathway.

sleep apnea,obstructive;sleep apnea syndromes;respiration disorders；matrix metalloproteinase 9；NF-κB

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.009

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(14071)。 作者簡介：譚小燕(1990-),住院醫(yī)師，碩士，主要從事睡眠呼吸暫停低通氣綜合征方面研究?！?/p>

，E-mail:kuangjl2004@aliyun.com。

R563.9

A

1671-8348(2017)14-1900-04

2016-11-21

2017-01-09)