維生素E聯(lián)合紅景天對低氧復(fù)合運(yùn)動小鼠骨骼肌保護(hù)作用的研究

龐巨濤，張新虎△，孫建華，周連軍，劉 斌，李鳳國，梁園園

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院骨科，河北衡水 053000；2.武警遼寧省總隊醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110034)

維生素E聯(lián)合紅景天對低氧復(fù)合運(yùn)動小鼠骨骼肌保護(hù)作用的研究

龐巨濤1，張新虎1△，孫建華1，周連軍1，劉 斌1，李鳳國1，梁園園2

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院骨科，河北衡水 053000；2.武警遼寧省總隊醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110034)

目的 探討維生素E聯(lián)合紅景天對低氧復(fù)合運(yùn)動小鼠骨骼肌細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用及其機(jī)制。方法 將40只ICR小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組均為20只。對照組小鼠給予灌胃維生素E(40 mg·kg-1·d-1)，觀察組小鼠給予灌胃維生素E(40 mg·kg-1·d-1)+紅景天提取液(20 g·kg-1·d-1)，兩組小鼠連續(xù)給藥15 d后進(jìn)行為期4周的低氧(氧濃度11.3%)復(fù)合運(yùn)動(5 ℃，15 m/min，60 min/d)。最后一次運(yùn)動后處死小鼠檢測骨骼肌血清甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧類物質(zhì)(ROS)、丙二醛(MDA)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測骨骼肌B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)行氧復(fù)合運(yùn)動過程中(運(yùn)動前、1、2、4周)監(jiān)測外周血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。結(jié)果 運(yùn)動后各時間點(diǎn)觀察組CK與LDH活性均低于對照組(P<0.05)。觀察組小鼠骨骼肌組織的GSH-PX、SOD活性明顯高于對照組(P<0.05)，而ROS、MDA低于對照組(P<0.05)；觀察組小鼠骨骼肌組織Bax基因mRNA水平的表達(dá)與Bax/Bcl-2比值均明顯低于對照組(P<0.05)，而Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 紅景天聯(lián)合維生素E能通過糾正低氧運(yùn)動下的氧化與抗氧化失衡而抑制凋亡基因的表達(dá)。

紅景天；維生素E；肌，骨骼；低氧；運(yùn)動；氧化；凋亡

劇烈運(yùn)動過程中骨骼肌往往處于缺氧狀態(tài)，近些年來骨骼肌功能在運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也越來越受到重視[1]。劇烈運(yùn)動過程中，如果存在乏氧，就會影響骨骼肌細(xì)胞的功能，進(jìn)而降低骨骼肌的功能，甚至出現(xiàn)細(xì)胞功能受損[1]。楊海平[2]證實長時間劇烈運(yùn)動(乏氧狀態(tài))能導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

骨骼肌細(xì)胞乏氧狀態(tài)易產(chǎn)生大量的活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，致使氧化與抗氧化失衡而導(dǎo)致線粒體及細(xì)胞損傷，進(jìn)而使血清骨骼肌損傷標(biāo)記酶[肌酸激酶(creating kinase，CK)與乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)]升高[3]。以往研究表明維生素E能很好地保護(hù)劇烈運(yùn)動中骨骼肌的損傷[4]，而紅景天有很強(qiáng)的抗缺氧、抗氧化、提高免疫力等功效[5]。但目前將兩者聯(lián)合應(yīng)用來保護(hù)骨骼肌的研究國內(nèi)外少見報道，因此，本文對其進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40只清潔級的性成熟ICR小鼠(雌、雄各20只)由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK-(京)2009-0004；周齡6～8周；體質(zhì)量26～30 g(雌)，28～32 g(雄)。小鼠飼養(yǎng)條件為：每籠4只，雌雄分開飼養(yǎng)，普通顆粒喂養(yǎng)，自由飲水取食，人工控溫20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗。實驗最后，對照組有17只小鼠完成實驗，觀察組有18只小鼠完成實驗。完成研究的兩組小鼠的造模前基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2 主要試劑 圣地紅景天(保留根與莖)購自西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司；維生素E購自美國Sigma公司；RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；骼肌血清甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧類物質(zhì)(ROS)、丙二醛(MDA)、外周血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.1.3 主要儀器 ASD-310S型低溫離心機(jī)購自美國Sigma公司；PCR儀購自德國Biometra公司。

1.2 方法

1.2.1 紅景天水提取液配制及維生素E混懸液配制步驟[6](1)將干燥的圣地紅景天根莖研磨成粉末狀；(2)將粉末(100 g)放于蒸餾水中浸泡1 h；(3)大火加熱至煮沸，維持沸騰狀態(tài)30 min；(4)小火維持沸騰狀態(tài)30 min；將上述步驟重復(fù)進(jìn)行3次，收集3次所得的藥紗布過濾后濃縮成0.5 g/mL的紅景天提取液，在冷藏(4 ℃)狀態(tài)下保存(1周內(nèi)用完)。維生素E混懸液用橄欖油配置成：稱取100 mg維生素E放入棕色瓶中，倒入10 mL的橄欖油并混合均勻，配成10 mg/mL的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光、冷藏(4 ℃)狀態(tài)下保存(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

1.2.2 小鼠用藥方案 將40只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組均為20只，雌雄各占一半。對照組小鼠小鼠給予灌胃維生素E(40 mg·kg-1·d-1)+相同體積的蒸餾水；觀察組給予灌胃維生素E(40 mg·kg-1·d-1)+紅景天提取液(20 g·kg-1·d-1)；以上灌胃操作均于每天上午9∶00進(jìn)行，連續(xù)進(jìn)行15 d。給藥前先將40只小鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，使其更好地適應(yīng)實驗室的環(huán)境。

1.2.3 低氧復(fù)合運(yùn)動小鼠造模方案及其動物處理[1]將兩組小鼠置于常壓低氧帳篷內(nèi)飼養(yǎng)，創(chuàng)造出11.3%(5 000 m海拔狀態(tài)的濃度)氧濃度的環(huán)境，持續(xù)低氧狀態(tài)下飼養(yǎng)4周，兩組小鼠均在低氧帳篷內(nèi)進(jìn)行跑臺運(yùn)動訓(xùn)練(5 ℃，15 m/min，60 min/d，每周5 d)，連續(xù)進(jìn)行4周后采取頸椎脫臼法處死小鼠并在冰臺上分離小鼠右下肢股四頭肌進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，肌肉組織保存于-70 ℃，并在1周內(nèi)檢測。低氧復(fù)合運(yùn)動期間(運(yùn)動前，運(yùn)動1、2、4周)抽取尾尖(每次剪去尾尖1～2 mm)靜脈血檢測CK與LDH。期間觀察動物的一般狀態(tài)，并及時移出一般狀態(tài)差及死亡的小鼠。

1.2.4 血清酶學(xué)指標(biāo)測定 將小鼠尾巴置于50 ℃熱水中浸泡數(shù)分鐘使血管充盈，擦拭干凈后剪去尾約1～2 mm，尾尖采靜脈血0.1 mL，注入玻璃試管中，靜置10 min，離心(3 000 r/min)10 min，提取血清在-70 ℃保存，按照試劑盒說明進(jìn)行CK、LDH檢測，抽血采取尾緣靜脈采血。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法測定肌肉組織B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)基因mRNA水平表達(dá)的檢測 稱取10 mg右下肢股四頭肌組織，經(jīng)研磨后按Trizol試劑盒說明書提取出總RNA后并分析其純度與完整性，合格后進(jìn)行下一步檢測。經(jīng)鑒定合格的RNA按試劑盒說明以(oligo) dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后以2 μL的cDNA為模板，按試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：(1)94 ℃下反應(yīng)1 min；(2)Tm(每個基因均有自己的退火溫度)50 s；(3)72 ℃下反應(yīng)90 s，上述過程進(jìn)行40個循環(huán)；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行跑帶(40 min)；(5)結(jié)束后取出瓊脂糖凝膠塊并置于260 nm的紫外燈下進(jìn)行觀察并照相；(6)分析各目的基因的條帶寬度與密度(Quantity-One軟件)，并將其與內(nèi)參基因(GAPDH)進(jìn)行對比后計算出相對表達(dá)值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。引物由日本TaKaRa公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PCGE)級純化，引物基因序列見表1。

表1 引物基因數(shù)據(jù)

1.2.6 肌肉組織氧化相關(guān)物質(zhì)的檢測 將肌肉組織剪碎，制成勻漿(10 000～15 000 r/min研磨，勻漿時間每次10 s，間隙30 s，連續(xù)3～4次，4 ℃)后按先用雙縮脲法進(jìn)行蛋白水平的測定，然后按照試劑盒說明進(jìn)行氧化相關(guān)物質(zhì)(GSH-Px、SOD、ROS、MDA)的檢測。

2 結(jié) 果

2.1 低氧復(fù)合運(yùn)動期間一般情況觀察及研究完成情況分析 運(yùn)動過程中大鼠均出現(xiàn)不同程度的食欲減退、毛色暗淡、反應(yīng)力減慢。觀察組小鼠狀態(tài)均優(yōu)于對照組小鼠狀態(tài)，以開始的第1周最為明顯，此后上述癥狀逐漸緩解，但第3周又逐漸加重，甚至出現(xiàn)死亡(4只)。40只小鼠順利完成研究的有35只，5只被淘汰，其中4只死亡(2只發(fā)生于第1周，2只發(fā)生于第4周)，還有1只因狀態(tài)太差(已不能飲食及活動)而被淘汰。觀察組低氧復(fù)合運(yùn)動期間研究完成率(90.00%)高于對照組(85.00%)，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.229，P>0.05)。

2.2 骨骼肌損傷標(biāo)志酶活性比較 運(yùn)動前兩組CK與LDH比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，運(yùn)動后各時間點(diǎn)觀察組CK與LDH活性均低于對照組(P<0.05)，且運(yùn)動開始后第1周最高，2周后降低，4周后開始升高，見表2。

2.3 骨骼肌組織氧化相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果比較 運(yùn)動結(jié)束后觀察組小鼠骨骼肌組織GSH-PX、SOD活性明顯高于對照組(P<0.05)，而ROS、MDA低于對照組(P<0.05)，見表3。

表2 兩組外周血清骨骼肌損傷標(biāo)志酶檢測結(jié)果比較

續(xù)表2 兩組外周血清骨骼肌損傷標(biāo)志酶檢測結(jié)果比較

a：P<0.05，與運(yùn)動前比較；b：P<0.05，與運(yùn)動后1周比較；c：P<0.05，與運(yùn)動后2周比較；d：P<0.05，與對照組比較。

表3 兩組骨骼肌氧化相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果比較

a：P<0.05，與對照組比較。

2.4 骨骼肌組織凋亡相關(guān)基因mRNA水平比較 運(yùn)動結(jié)束后觀察組小鼠骨骼肌組織Bax mRNA水平的表達(dá)與Bax/Bcl-2比值均明顯低于對照組(P<0.05)，而Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，見圖1、表4。

表4 兩組骨骼肌Bax、Bcl-2 mRNA水平比較

a：P<0.05，與對照組比較。

圖1 兩組骨骼肌Bax、Bcl-2 mRNA水平表達(dá)

3 討 論

氧氣是人體維持正常生理活動所必需的物質(zhì)，缺氧情況下人體的功能活動降低甚至損傷組織與細(xì)胞結(jié)構(gòu)，易發(fā)生細(xì)胞凋亡[1]。在體育運(yùn)動中，骨骼肌損傷度發(fā)生于周期性的耐力性競技項目，反復(fù)的運(yùn)動易導(dǎo)致肌纖維損傷，如果此時運(yùn)動過程環(huán)境中處于乏氧狀態(tài)，肌纖維的損傷將進(jìn)一步加重[7]。本研究顯示，為期4周的低氧復(fù)合運(yùn)動結(jié)束后小鼠股四頭肌肉組織中的Bax mRNA水平的表達(dá)低于對照組(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA水平的表達(dá)高于對照組(P<0.05)，說明紅景天聯(lián)合維生素E能更好地抑制劇烈運(yùn)動所誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡。

維生素E作為一種常用的抗氧化劑在臨床中廣泛使用，因其具有很強(qiáng)的脂溶性而參與了脂質(zhì)雙分子膜的組成，能更很好地維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與完整性，防治肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子外流而誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞損傷，此外其脂溶性較強(qiáng)，能在皮下脂肪內(nèi)長時間貯存而實現(xiàn)緩慢釋放的目的[8]，此外，在人群研究中顯示，在長時間耐力性運(yùn)動中口服維生素C與維生素E均能通過改善氧化與抗氧化平衡失調(diào)來保護(hù)骨骼肌細(xì)胞[4]。紅景天為一種高原地區(qū)居民的常用藥材，其主要活性成分為紅景天苷，有一定的抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等功效，紅景天最常用的給藥途徑就是水煎劑，且能很好地抑制運(yùn)動性疲勞運(yùn)動員外周血清MDA水平，及外周血清SOD與GSH-Px酶活性[9]。正常運(yùn)動時體內(nèi)產(chǎn)生的氧化與抗氧化物質(zhì)是處于平衡狀態(tài)的，但是劇烈運(yùn)動及其乏氧運(yùn)動時自由基產(chǎn)生會增加，而抗氧化物質(zhì)相對不足，這樣導(dǎo)致抗氧與抗氧化平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，因此可以適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充外源性的抗氧化物質(zhì)而保護(hù)骨骼肌細(xì)胞。李偉[10]通過大鼠實驗研究表明：在長時間疲勞性運(yùn)動中，紅景天能通過增加肌肉負(fù)荷時間而增加肌肉耐力，并能及時清除運(yùn)動過程中產(chǎn)生的自由基與ROS，增加肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。既往還未有將紅景天與維生素E聯(lián)合起來保護(hù)劇烈運(yùn)動過程中的骨骼肌細(xì)胞。本實驗研究顯示：運(yùn)動結(jié)束后觀察組小鼠股四頭肌組織抗氧化相關(guān)酶(GSH-PX、SOD)活性高于對照組(P<0.05)，而氧化物(ROS、MDA)低于對照組(P<0.05)，說明聯(lián)合治療抗氧化作用力更強(qiáng)。

運(yùn)動強(qiáng)度的加大與時間的延長，血清中LD活性逐漸升高，激烈運(yùn)動導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞乏氧且糖水化合物相對不足，為了補(bǔ)充能量不足與適應(yīng)相對的乏氧狀態(tài)，骨骼肌開啟了無氧酵解，但是同時產(chǎn)生立大量的自由基而降低了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使LD外漏出細(xì)胞，因此LDH也可以用來評價無氧酵解的強(qiáng)度[11-12]。CK是磷酸原(ATP-CP)系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵酶，在能量物質(zhì)的形成、轉(zhuǎn)換及其線粒體的內(nèi)呼吸過程中起到了催化作用，外周血清中該酶也隨著運(yùn)動強(qiáng)于與時間的增加而活性增強(qiáng)，也是臨床中用來判定肌肉損傷的標(biāo)記酶[13]。本研究顯示：運(yùn)動前兩組外周血清CK與LDH比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而運(yùn)動后兩酶活性開始升高(第1周最高，2周后達(dá)到最低，4周后再次開始升高)，且各個時間點(diǎn)觀察組CK與LDH活性均低于對照組(P<0.05)，說明聯(lián)合作用能更好地保護(hù)骨骼肌細(xì)胞，而由于運(yùn)動開始時小鼠還未適應(yīng)缺氧狀態(tài)而使骨骼肌損傷較嚴(yán)重，而隨著時間的進(jìn)展，逐漸適應(yīng)了乏氧狀態(tài)，使兩酶的活性逐漸降低，而第3周后酶活性又開始升高可能與運(yùn)動期間停止給藥有關(guān)，體內(nèi)藥物逐漸代謝而保護(hù)作用降低所致，與之對應(yīng)的是運(yùn)動期間兩組小鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、毛色暗淡、反應(yīng)力減慢，且第1周最為明顯，此后逐漸緩解，但第3周又逐漸加重，且發(fā)生死亡的4只小鼠中，2只發(fā)生于第1周，2只發(fā)生于第4周，這些狀態(tài)均與外周血清的CK與LDH活性值情況相對應(yīng)，說明紅景天與維生素E聯(lián)合應(yīng)用能很好地提高小鼠在乏氧狀態(tài)下劇烈運(yùn)動的適應(yīng)性。

紅景天與維生素E目前均已廣泛應(yīng)用于抗疲勞的治療與預(yù)防中，而本研究將兩種藥物聯(lián)合起來通過實驗小鼠進(jìn)行研究分析，充分發(fā)揮兩種藥物的自身優(yōu)勢，證實了兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用在小鼠動物模型中的安全性與有效性，但由于本次動物試驗僅僅針對用藥(連續(xù)用藥2周)后的4周進(jìn)行研究，研究時間段較短，且并未在運(yùn)動期間給藥，因此在今后研究中將在運(yùn)動前及運(yùn)動期間均給予藥物治療，有望取得更好的效果；與此同時小鼠的膳食營養(yǎng)對骨骼肌損傷的保護(hù)作用未進(jìn)行研究，也將在今后進(jìn)一步探討。此外，既往研究表明紅景天具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)免疫功效[9]，本課題組將對免疫功能與肌肉損傷方面進(jìn)一步研究，為日后的臨床實踐提供完善的理論基礎(chǔ)。

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The protective effects of Rhodiola rosea combined with vitamin E on the skeletal muscle through hypoxia combined with exercise training in mice

PangJutao1,ZhangXinhu1△,SunJianhua1,ZhouLianjun1,LiuBin1,LiFengguo1,LiangYuanyuan2

(1.DepartmentofOrthopaedics,HengshuiHalisonInternationalPeaceHospital,Hengshui,Hebei053000,China;2.DepartmentofOrthopaedics,LiaoningProvincialCorpsHospitalofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Shenyang,Liaoning110034,China)

Objective To study the protective effects of vitamin E combined with Rhodiola rosea on the injury in mice skeletal muscle through hypoxia with exercise training and research the mechanism of action.Methods Forty ICR mice were randomly divided into control group and observation group,20 mice in each group.The control group was given Vitamin E (40 mg·kg-1·d-1),and the observation group was given Vitamin E (40 mg·kg-1·d-1)combined with Rhodiola rosea (20 g·kg-1·d-1);the rats in the two groups were treated with hypoxia (11.3%) for 4 weeks (5 ℃,15 m/min,60 min/d) after 15-day drug using.After the last training,all the mice were euthanized and then detected the gene of Bax and Bcl-2 mRNA through the RT-PCR in the skeletal muscle and the activity of GSH-PX,SOD,ROS,the concentration of MDA in the skeletal muscle.During the period (pretrain and 1,2,4 weeks) of hypoxia combined with exercise training,the CK,LDH in the serum were detected.Results The expression of CK and LDH in the observation group were lower than those of the control group (P<0.05).The activity of GSH-PX and SOD in the skeletal muscle of the observation group was significantly higher than that of the control group (P<0.05),while the ROS and MDA were lower than those of the control group(P<0.05);the expression of Bax mRNA and Bax/Bcl-2 of the observation group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).While the expression of Bcl-2 mRNA was significantly higher than that of the control group(P<0.05).Conclusion Rhodiola rosea combined with Vitamin E can inhibit the expression of apoptotic genes by correcting the oxidation and hypoxia imbalance under hypoxia.

Rhodiola sacra;vitamin E;muscle,skeletal;hypoxia;exercise training;oxidize;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.006

龐巨濤(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事運(yùn)動后骨骼肌損傷方面研究。△

，E-mail:pangjutao@163.com。

R685.4

A

1671-8348(2017)14-1889-03

2016-11-25

2017-01-13)