TNF-α對鼠根尖乳頭干細胞增殖及多向分化能力的影響*

曹蓉蓉，馬俊玥，李淑慧，馬 玉，吳佩玲

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830063)

TNF-α對鼠根尖乳頭干細胞增殖及多向分化能力的影響*

曹蓉蓉，馬俊玥，李淑慧，馬 玉，吳佩玲△

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830063)

目的 研究腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對鼠根尖乳頭干細胞(SCAP)增殖及多向分化能力的影響。方法 采用酶消化法結合組織塊法獲得SCAP，將細胞分為實驗組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，使用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測SCAP的增殖能力；采用茜素紅染色及實時定量PCR(qRT-PCR)檢測TNF-α對SCAP成骨/成牙本質能力的影響；油紅O染色檢測TNF-α對SCAP成脂能力的影響；qRT-PCR檢測TNF-α對SCAP血管相關基因表達的影響。結果 體外培養(yǎng)SCAP符合間充質干細胞來源的特征且具有多向分化能力。MTT結果顯示：與對照組相比，各濃度組均能促進SCAP增殖(P<0.05)，其中10 ng/mL TNF-α的促進作用最為明顯。茜素紅染色結果顯示：實驗組隨著TNF-α濃度的增加，礦化結節(jié)逐漸變小，形成數量也逐漸變少。qRT-PCR結果顯示：3、7 d時，與對照組相比，實驗組骨鈣蛋白(OC)、牙本質涎磷蛋白(DSPP)、牙本質基質蛋白-1(DMP-1)表達量降低，3 d時兩組OC、DMP-1比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；7 d時DMP-1比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；14 d時，實驗組OC、DMP-1表達量明顯降低(P<0.05)。油紅O染色結果顯示：與對照組相比，實驗組隨著TNF-α濃度的增加，脂滴形成數量逐漸減少。qRT-PCR結果顯示：3、7天時，與對照組相比，血管生成素1、血管內皮生長因子A、血小板內皮細胞黏附分子-1表達量明顯降低(P<0.05)。結論 炎性因子TNF-α對SCAP的增殖有明顯促進作用但同時不同程度抑制SCAP多向分化能力。

干細胞；分生組織；腫瘤壞死因子α；根尖乳頭干細胞；多向分化；大鼠，Wistar

2006年，Sonoyama等[1]從人未發(fā)育完全的第三磨牙根尖乳頭組織中分離出新的間充質干細胞，命名為根尖乳頭干細胞(stem cells from apical papilla，SCAP)，并證實其具有高度的增殖、自我更新和多向分化潛能，并在一定的誘導條件下可向成骨/成牙本質、脂肪、軟骨、肌肉、神經元等細胞分化。近年來，隨著人們對SCAP的深入研究，證實SCAP在介導牙本質再生及牙根發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。牙髓炎、根尖周炎是一種復雜的炎癥反應，其中包含以腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)為主的多種炎性因子，且炎癥的病變程度與炎性因子的水平存在著一定的相關性[3]。有研究結果顯示，炎癥微環(huán)境會影響干細胞的增殖和分化，甚至引起細胞凋亡[4]；但對于炎性因子對SCAP分化能力的影響研究甚少。本實驗擬通過不同濃度TNF-α對SCAP進行干預，從而研究炎性因子TNF-α對SCAP增殖及多向分化潛能的影響，為研究炎性環(huán)境下SCAP生物學特性的改變提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、谷氨酰胺(Hyclone公司，美國)，Ⅰ型膠原酶(Wor-thington公司，美國)，TNF-α(Peprotech公司，美國)，維生素C、B-甘油磷酸鈉、地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBXM)、茜素紅粉劑(Sigma公司，美國)，基質細胞抗原-1(STRO-1，Santa Cruz公司，美國)，兔抗大鼠一抗CD90、CD146(北京博奧森生物技術有限公司，中國)，油紅O染液(南京建成生物工程研究所)，熒光定量PCR試劑盒(Thermo公司，美國)，光學顯微鏡、倒置顯微鏡(萊卡公司，德國)，37 ℃細胞培養(yǎng)孵箱(力康生物醫(yī)療有限公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，酶標儀(Thermo公司，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，Wistar大鼠(新疆醫(yī)科大學動物實驗中心)。本研究通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學倫理委員會批準(批準號：IACUC20150423-01)。

1.2 方法

1.2.1 鼠SCAP的培養(yǎng) 健康雄性Wistar大鼠2只，分離根尖乳頭組織，剪碎、消化至絮狀，離心后接種，每2～3天換液，觀察細胞至80%～90%融合時，消化，按1∶3常規(guī)傳代培養(yǎng)，取3～5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞鑒定 免疫熒光法鑒定表面標志物STRO-1、CD90、CD146的表達。多向分化能力的鑒定：茜素紅染色檢測成骨能力；油紅O檢測成脂能力。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測TNF-α對SCAP增殖能力的影響 取第3代SCAP，以2×103/孔密度接種于96孔板，設實驗組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，每組3個復孔，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，每孔加入5 mg/mL MTT溶液50 μL，37 ℃ 孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，測定各孔490 nm吸光度(A)值并記錄。

1.2.4 檢測成骨/成牙本質能力

1.2.4.1 茜素紅染色 取第3代SCAP，以2×104/孔的密度接種于24孔板，設實驗組和對照組，24 h后更換含相應濃度TNF-α的成骨誘導液，3周后茜素紅染色，觀察礦化結節(jié)的形成情況。

1.2.4.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測成骨相關基因的表達 取第3代SCAP，以2×105/孔的密度接種于12孔板，設實驗組(TNF-α濃度為10 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h后，更換含相應濃度TNF-α的成骨誘導液，分別培養(yǎng)3、7、14 d，按步驟提取RNA，根據逆轉錄試劑盒說明配成20 μL體系合成cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。目的基因骨鈣蛋白(osteocalcin，OC)、牙本質基質蛋白-1(dentin matrix protein-1，DMP-1)、牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)由華大基因設計并合成(表1)。按試劑盒說明書配成25 μL體系進行實驗，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個目的基因重復3管，同時設置1管陰性對照，結果根據使用倍比關系2-△△Ct表示，其中ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。

1.2.5 油紅O檢測SCAP成脂能力 取第3代SCAP，分為實驗組(TNF-α濃度為5、10、20、50 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h更換為含相應濃度TNF-α的成脂誘導液A，3 d后更換含相應濃度TNF-α的成脂液B 24 h，3個循環(huán)后，油紅O染色，觀察脂滴形成情況并記錄。

1.2.6 qRT-PCR檢測血管相關基因的表達 取第3代SCAP，以2×105/孔的密度接種于12孔板，設實驗組(TNF-α濃度為10 ng/mL)和對照組(TNF-α濃度為0 ng/mL)，培養(yǎng)24 h后，更換含相應濃度TNF-α的成骨誘導液，分別培養(yǎng)3、7、14 d，按步驟提取RNA，根據逆轉錄試劑盒說明配成20 μL 體系合成cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。目的基因血管生成素1(angiogenin 1)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor a，VEGFA)、血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)及內參GADPH由華大基因設計并合成(表1)。按試劑盒說明書配成25 μL體系進行實驗，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個目的基因重復3管，同時設置1管陰性對照，結果根據使用倍比關系2-△△Ct表示，其中ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。

表1 qRT-PCR目的基因的引物序列

2 結 果

2.1 SCAP形態(tài) 原代培養(yǎng)3～5 d后，可見細胞從組織塊邊緣呈放射狀生長，細胞形態(tài)多為短梭形，輪廓清楚，大小基本一致，生長狀況良好，可穩(wěn)定傳代，約3～5 d可達到80%～90%匯合，見圖1。

2.2 細胞鑒定 SCAP抗STRO-1呈弱陽性表達，抗CD90、CD146呈陽性表達。結果提示符合間充質干細胞來源的特征。茜素紅染色陽性，證實SCAP具有成骨/成牙本質向分化的潛能；油紅O染色陽性，倒置顯微鏡下可見胞質內有脂滴形成，證實SCAP具有成脂向分化的潛能。

2.3 MTT檢測SCAP增殖能力 與對照組相比，各濃度組均能明顯促進SCAP增殖，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中10 ng/mL TNF-α的促進作用最為明顯，見圖2。

A:CAP原代第3天(×100)；B:第3代SCAP(×100)。

圖1 SCAP生長情況

圖2 不同濃度TNF-α刺激下SCAP的增殖能力

2.4 SCAP成骨/成牙本質能力的檢測

2.4.1 茜素紅染色結果 對照組染色后形成礦化結節(jié)較大、染色較深；與對照組相比，隨著TNF-α濃度的增加，形成的礦化結節(jié)逐漸變小，數量也逐漸減少，見圖3。

2.4.2 qRT-PCR結果 3、7 d時，與對照組相比，實驗組OC、DSPP、DMP-1表達量降低。其中，3 d時兩組OC、DMP-1比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；7 d時DMP-1比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；14 d時，實驗組OC、DMP-1表達量明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.5 油紅O染色結果 對照組染色后可見胞質內大量紅色大小不等的脂滴形成；與對照組相比，實驗組隨著TNF-α濃度的增加，脂滴形成數量逐漸減少，見圖4。

A：對照組；B：實驗組(TNF-α 5 ng/mL)；C：實驗組(TNF-α 10 ng/mL)；D：實驗組(TNF-α 20 ng/mL)；E：實驗組(TNF-α 50 ng/mL)。

圖3 SCAP經含不同濃度TNF-α的成骨誘導液誘導3周染色結果(×100)

A：對照組；B：實驗組(TNF-α 5 ng/mL)；C：實驗組(TNF-α 10 ng/mL)；D：實驗組(TNF-α 20 ng/mL)；E：實驗組(TNF-α 50 ng/mL)。

圖4 SCAP經含不同濃度TNF-α的成脂誘導液誘導后的油紅O染色結果(×100)

2.6 SCAP成血管相關基因的表達情況 3、7 d時，與對照組相比，實驗組ANGPT1、VEGFA、PECAM-1表達量明顯降低，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 TNF-α刺激下SCAP成骨/成牙本質相關基因表達

表3 TNF-α刺激下SCAP血管相關基因表達

3 討 論

臨床研究表明，發(fā)生牙髓炎及根尖周炎的年輕恒牙經過徹底地清理和消毒后根尖仍能繼續(xù)發(fā)育成形[5]，并認為在此過程中SCAP可能發(fā)揮了關鍵的作用。隨著研究的深入，學者們發(fā)現SCAP在介導牙本質再生及牙根發(fā)育過程中均發(fā)揮著極其重要的作用[6-7]。但牙髓炎及根尖周炎是一種復雜的炎癥反應，當年輕恒牙發(fā)生牙髓炎及根尖周炎時，SCAP會暴露于炎性環(huán)境中，其中包含以TNF-α 為主的多種炎性因子，且研究表明炎性因子的刺激會改變干細胞的生物學特性，影響其增殖及分化能力[8-9]，故明確炎性因子對SCAP增殖及多向分化能力的影響對牙髓牙本質復合體再生及根尖的持續(xù)發(fā)育成形有著不可忽視的作用。

Yang等[10]的研究也發(fā)現TNF-α可促進根尖乳頭細胞增殖能力。劉彩奇等[11]研究發(fā)現10 ng/mL TNF-α可促進SCAP的增殖，提高克隆形成率。于莉等[12]研究也表明10 ng/mL TNF-α促進SCAP增殖作用最明顯。本研究結果與以上研究基本一致,但同時發(fā)現隨著TNF-α濃度的增加，促進SCAP增殖的作用并不會加強。這可能表明炎性因子TNF-α對SCAP的增殖作用具有濃度的依賴性，高濃度并不能增加促進增殖的作用。

TNF-α是1975年由Cors Wells發(fā)現的一種內毒素誘導的糖蛋白，到目前為止，研究者們發(fā)現TNF-α通常在健康的牙髓和根尖周組織中檢測不到，而發(fā)生齲病、牙髓炎及根尖周炎時，牙髓組織和根尖周組織中炎性因子表達增加，其中TNF-α水平最高[13-15]，這表明TNF-α在牙髓炎癥及根尖周炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。也有學者研究表明TNF-α會抑制SCAP的成骨/成牙本質的能力[7-8]。本研究結果也顯示TNF-α可抑制SCAP礦化結節(jié)的形成；抑制成骨、血管相關基因的表達；同時抑制SCAP成脂能力。本研究為牙髓牙本質復合體的再生及牙根繼續(xù)發(fā)育提供一定的實驗基礎。

本研究采用酶消化法分離培養(yǎng)鼠SCAP，通過不同濃度的TNF-α對SCAP進行干預，結果表明TNF-α可促進SCAP的增殖能力，但同時會抑制其多向分化能力，為進一步研究在炎癥微環(huán)境中SCAP生物學特性的改變及牙髓牙本質復合體再生提供了實驗基礎，也為臨床治療根尖周組織病變的提供了一定的理論依據。

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Effect of tumor necrosis factor-α on the proliferation and multi-directional differentiation of stem cells from rat apical papilla*

CaoRongrong，MaJunyue，LiShuhui，MaYu，WuPeiling△

(DepartmentofStomatology,theSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830063,China)

Objective To evaluate the biological effect of tumor necrosis factor-α(TNF-α) on the proliferation and multi-directional differentiation of stem cells from rat apical papilla(SCAP).Methods SCAP was extracted by combining enzyme digestion method with tissue block method.The cells were divided into control group(TNF-α 0 ng/mL) and experimental group(TNF-α 5,10,20,50 ng/mL).The ability of proliferation of SCAP was measured by MTT method.The ability of osteogenic/dentinogenic differentiation of SCAP was measured by alizarin red staining and quantitative real-time PCR.The ability of adipogenic of SCAP was measured by oil red O staining.The expression of vascular related genes of SCAP was measured by quantitative real-time PCR.Results SCAP was consistent with the characteristics of mesenchymal stem cells and possessed the ability of multi-directional differentiation.The MTT results showed that experimental group promoted the proliferation of SCAP in comparison with the control group.The difference was statistically significant(P<0.05),and 10 ng/mL was the optimum concentration.The results of alizarin red staining showed that with the increase of the concentration of TNF-α,the mineralized nodules in the experimental group gradually became smaller,and the number of the formation decreased gradually.The results of quantitative real-time PCR showed that the expression of OC,DMP-1 and DSPP in the experimental group was significantly lower than that of the control group at 3 and 7 days,in which the expression of OC was statistically significant different(P<0.05);at 14 days,the expression of OC,DMP-1 in the experimental group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).The result of Oil red O staining showed that with the increase of the concentration of TNF-α,the lipid droplets formation in the experimental group gradually decreased.The result of quantitative real-time PCR showed that the expression of ANGPT1,VEGFA,PECAM-1 in the experimental group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).Conclusion TNF-α might promote the proliferation and inhibit the multi-directional differentiation of SCAP.

stem cells;meristem;tumor necrosis factor-α;stem cells from rat apical papilla;multi-directional differentiation;rats,Wistar

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.002

國家自然科學基金資助項目(81460103)。 作者簡介：曹蓉蓉(1992-)，在讀碩士，主要從事牙體牙髓學方面研究?！?/p>

，E-mail:wplkq@sina.com。

R781.3

A

1671-8348(2017)14-1874-04

2016-11-20

2017-01-08)