以馬唐為主要原料的絲狀真菌培養(yǎng)基研究

李健+李美+高興祥+房鋒+董連紅

摘要：

我國(guó)雜草資源豐富，研究以雜草為基礎(chǔ)的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)有效利用雜草資源、降低微生物發(fā)酵成本具有重要意義。本研究篩選了一種以雜草馬唐（Digitaria sanguinalis）為主要原料適宜絲狀真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)良培養(yǎng)基——馬唐葡萄糖培養(yǎng)基（DDM），并研究了其適宜培養(yǎng)溫度、pH，產(chǎn)孢量和產(chǎn)孢速率。結(jié)果顯示，供試3種絲狀真菌均可在DDM培養(yǎng)基上迅速產(chǎn)生大量孢子，在該培養(yǎng)基內(nèi)供試鐮刀菌菌株培養(yǎng)3 d后產(chǎn)孢量約為傳統(tǒng)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的1.6倍，培養(yǎng)5 d即可達(dá)到產(chǎn)孢高峰；在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度和適宜pH范圍內(nèi)供試絲狀真菌均可在DDM培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。該培養(yǎng)基相較于目前在絲狀真菌培養(yǎng)中應(yīng)用比較廣泛的培養(yǎng)基，在產(chǎn)孢速率和產(chǎn)孢量方面有較為顯著的優(yōu)勢(shì)，有利于降低絲狀真菌培養(yǎng)成本和縮短培養(yǎng)時(shí)間。

關(guān)鍵詞：絲狀真菌；培養(yǎng)基；馬唐；菌絲重量；產(chǎn)孢量；成本

中圖分類(lèi)號(hào)：S451文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）05-0097-05

An Efficient Medium Containing Digitaria sanguinalis

for Filamentous Fungi Culture

Li Jian， Li Mei， Gao Xingxiang， Fang Feng， Dong Lianhong

（Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

AbstractChina is rich in grass resources. The research on microbial fermentation medium using weeds as raw material can not only reduce the cost of microbial fermentation， but also improve the weed resource utilization. In this paper， we provided an efficient Digitaria sanguinalis dextrose medium （DDM） containing Digitaria sanguinalis for filamentous fungi culture， and studied the optimal culture temperature， pH value， sporulation quantity and sporulation rate. The results showed that the DDM medium was significantly better than other weed culture medium in the sporulation quantity. The sporulation quantity of Fusarium strain in DDM medium was about 1.6 times of that in PD medium after cultured for 3 days， and reached the peak after cultured for 5 days. The tested strains were able to grow normally and produce spores in the DDM under the conventional culture temperature and pH range. Compared with the media widely used in filamentous fungi culture， the DDM had more obvious advantages in sporulation rate and quantity， and was benefit to reducing cost and culture time.

KeywordsFilamentous fungi； Culture medium； Digitaria sanguinalis； Mycelial weight； Sporulation quantity； Cost

絲狀真菌（filamentous fungi）是一類(lèi)在自然界中廣泛分布的真菌微生物，可以通過(guò)無(wú)性孢子如分生孢子和厚垣孢子進(jìn)行無(wú)性繁殖[1]。絲狀真菌與農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生物醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域存在著廣泛聯(lián)系[2，3]。例如，一些優(yōu)良菌株被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)生物酶、生物激素和有機(jī)酸等物質(zhì)[3，4]；農(nóng)業(yè)中許多作物的病害都由絲狀真菌侵染造成，如小麥赤霉?。‵usarium headblight）[5，6]、水稻稻瘟病（rice blast）等；多種絲狀真菌被篩選出來(lái)用于生物防治領(lǐng)域，例如利用畫(huà)眉草彎孢霉（Curvularia eragrostidis J.A.Meyer）進(jìn)行雜草馬唐的防治[7]。同時(shí)由于絲狀真菌的廣泛代表性，往往會(huì)被篩選出來(lái)作為“模式生物”進(jìn)行廣泛研究[8]，例如對(duì)稻瘟菌（Magnaporthe grisea）[9]和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）[10]的研究。

獲得無(wú)性孢子或次級(jí)代謝產(chǎn)物是大多數(shù)絲狀真菌發(fā)酵的最終目的[11]，而這一過(guò)程伴隨著大量液體培養(yǎng)基的使用。因此，絲狀真菌高效培養(yǎng)基的篩選對(duì)于該類(lèi)真菌的研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義。低廉的原料成本是發(fā)酵培養(yǎng)基能夠應(yīng)用的重要基礎(chǔ)[12]。目前，絲狀真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要以糧食作物，例如小麥、玉米、大豆和馬鈴薯等為應(yīng)用原料，或以化學(xué)試劑為主要原料，例如葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉等[13]。截至目前，對(duì)以田間雜草為原料的微生物培養(yǎng)基研究較少。而草本植物內(nèi)生微生物資源豐富，例如甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的內(nèi)生真菌就多達(dá)11個(gè)屬[14]。雜草體內(nèi)的真菌，能夠以雜草為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源完成生長(zhǎng)過(guò)程，表明多種雜草可被開(kāi)發(fā)為廣適性真菌培養(yǎng)基材料。

我國(guó)田間雜草資源豐富，目前對(duì)于農(nóng)田雜草大都采用化學(xué)防除的方法[15-17]，而對(duì)于防除后殘留在農(nóng)田里、田間地頭和非耕地的雜草則缺乏回收利用方法，雜草利用率極低，造成了大量生物質(zhì)資源的浪費(fèi)。因此，研究以雜草為基礎(chǔ)的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，最大化地開(kāi)發(fā)雜草資源，減少浪費(fèi)，對(duì)于優(yōu)化微生物培養(yǎng)基組成、降低配制成本都有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

供試絲狀真菌菌株：F1：稻瘟菌（Magnaporthe grisea）；F2：膠孢炭疽菌（Colletotrichum spp.）；F3：厚垣孢鐮刀菌（Fusarium spp.）。

供試馬唐：其種子為本實(shí)驗(yàn)室采集并保存，并通過(guò)溫室種植獲得馬唐植株。

1.2培養(yǎng)基配置

供試培養(yǎng)基：主要成分為馬唐和葡萄糖，將其命名為馬唐葡萄糖培養(yǎng)基（Digitaria sanguinalis dextrose medium，DDM）。取試驗(yàn)需要用量馬唐，對(duì)材料進(jìn)行人工切碎，至莖葉片段小于5 cm，沸水煮30 min，紗布過(guò)濾得到汁液。液體中加入試驗(yàn)需要用量葡萄糖和磷酸二氫鉀0.5 g，溶解后定容至1 L，根據(jù)所培養(yǎng)菌株的特性調(diào)節(jié)pH。將定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下滅菌鍋滅菌20 min，備用。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g，人工切成約2 cm×2 cm的塊，沸水煮30 min，紗布過(guò)濾，留取汁液。在過(guò)濾獲得汁液中加入葡萄糖20 g，并定容至1 000 mL。將定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下滅菌鍋滅菌20 min，備用。

胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）：胡蘿卜200 g，人工切成約2 cm×2 cm的塊，沸水煮30 min，紗布過(guò)濾，留取汁液。加水并定容至1 000 mL。將定容后的溶液于121℃、1.05×105Pa下滅菌鍋滅菌20 min，備用。

葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（DP）：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，加水定容至1 000 mL。將定容后的溶液于121℃、1.05×105 Pa下滅菌鍋滅菌20 min，備用。

1.3絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基上的培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1不同配比DDM培養(yǎng)基篩選以馬唐和葡萄糖為培養(yǎng)基的主要原料，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)添加的馬唐和葡萄糖進(jìn)行梯度篩選。分別設(shè)置馬唐含量為50、100、150、200 g/L共4個(gè)梯度和葡萄糖含量為2.5、5.0、10.0 g/L共3個(gè)梯度進(jìn)行DDM培養(yǎng)基的配制，測(cè)定12個(gè)不同配比下絲狀真菌的生長(zhǎng)情況。具體配比見(jiàn)表1。

將供試絲狀真菌菌株F3用PDA培養(yǎng)基活化，5 d后在生長(zhǎng)一致的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到100 mL各供試培養(yǎng)基中（500 mL培養(yǎng)瓶），放置于搖床內(nèi)，180 r/min、25℃、黑暗培養(yǎng)。自第3 d始，每天取出3瓶，搖勻后吸取一定量液體，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子數(shù)量；雙層紗布過(guò)濾收集菌絲，80℃烘箱烘烤2 h后稱(chēng)量菌絲干重，統(tǒng)計(jì)菌絲量。重復(fù)3次。

1.3.2DDM培養(yǎng)基與常用真菌培養(yǎng)基的比較配制1.3.1篩選出的適宜配比的DDM培養(yǎng)基，與目前常用的絲狀真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基（PD、CA、DP）進(jìn)行菌株培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)。培養(yǎng)基pH值統(tǒng)一調(diào)為7.0，供試菌株為鐮刀菌F3。按1.3.1中絲狀真菌的活化、接種、培養(yǎng)方式對(duì)F3菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)菌絲和產(chǎn)孢量。重復(fù)3次。

1.3.3多種絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)狀況比較配制1.3.1篩選出的適宜配比的DDM培養(yǎng)基， pH值調(diào)為7.0，選取3種絲狀真菌（F1：稻瘟菌；F2：膠孢炭疽菌；F3：厚垣孢鐮刀菌）為供試菌株，按1.3.1中絲狀真菌的活化、接種、培養(yǎng)方式對(duì)供試菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)菌絲和產(chǎn)孢量。重復(fù)3次。

1.3.4絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基和常用真菌培養(yǎng)基內(nèi)的適宜培養(yǎng)溫度比較將供試F3菌株接種到1.3.1篩選的適宜配比的DDM培養(yǎng)基及目前常用的絲狀真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基（PD、CA、DP）內(nèi)，培養(yǎng)基pH值統(tǒng)一調(diào)為7.0，將溫度條件設(shè)置為16、19、22、25、28、31℃，測(cè)定待測(cè)真菌在該培養(yǎng)基中的最適培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)方法同1.3.1。重復(fù)3次。

1.3.5絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基和常用真菌培養(yǎng)基中的適宜培養(yǎng)pH值比較將供試F3菌株接種到1.3.1篩選的適宜配比的DDM培養(yǎng)基及目前常用的絲狀真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基（PD、CA、DP）內(nèi)，將各培養(yǎng)基pH值調(diào)制成5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)方法同1.3.1。重復(fù)3次。

1.3.6絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基和常用真菌培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢速率比較以供試菌株F3為測(cè)試菌株，以1.3.1篩選的適宜配比的DDM培養(yǎng)基為測(cè)試培養(yǎng)基，以PD培養(yǎng)基為對(duì)照，在振蕩培養(yǎng)過(guò)程中分別于第2、3、4、5、6、7 d取3個(gè)培養(yǎng)瓶，記錄菌絲重量和產(chǎn)孢量。

1.4數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1DDM培養(yǎng)基的適宜配比篩選

表1結(jié)果顯示，當(dāng)馬唐含量在100 g/L及以上、葡萄糖含量在5 g/L及以上時(shí)，菌絲干重和產(chǎn)孢量之間無(wú)顯著差異，真菌培養(yǎng)效果均較佳。從表1還可以看出，馬唐含量對(duì)菌絲和分生孢子產(chǎn)量構(gòu)成主要影響，葡萄糖影響相對(duì)于馬唐較小，但是仍然對(duì)真菌生長(zhǎng)和分生孢子產(chǎn)量構(gòu)成影響。綜合分析，本研究篩選出的DDM培養(yǎng)基適宜馬唐含量為100 g/L，葡萄糖含量為5 g/L。

2.2DDM培養(yǎng)基與多種真菌培養(yǎng)基的比較

表2結(jié)果顯示，DDM培養(yǎng)基內(nèi)F3菌絲干重與PD、DP培養(yǎng)基差異不顯著，均顯著高CA培養(yǎng)基；產(chǎn)孢量最高，顯著高于其它常用培養(yǎng)基，約為PD培養(yǎng)基的1.6倍。可見(jiàn)，DDM培養(yǎng)基相較于其它在鐮刀菌培養(yǎng)中應(yīng)用比較廣泛的培養(yǎng)基，在分生孢子產(chǎn)量方面有較為顯著的優(yōu)勢(shì)。

2.4絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基上的適宜培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分不因外界環(huán)境的改變而發(fā)生活性改變是對(duì)其能夠應(yīng)用的基本要求。而環(huán)境溫度和培養(yǎng)pH值是真菌培養(yǎng)過(guò)程中兩個(gè)重要影響因素。不同溫度和pH條件下菌株生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，鐮刀菌在DDM培養(yǎng)基上在16～31℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，且以25～31℃產(chǎn)孢量較大，均顯著高于其它較低溫度；其生長(zhǎng)趨勢(shì)和PD培養(yǎng)基較為一致，且在19～31℃產(chǎn)孢量均優(yōu)于PD培養(yǎng)基。說(shuō)明，在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度下DDM培養(yǎng)基能夠正常使用，且優(yōu)于真菌常規(guī)培養(yǎng)基。

結(jié)果（表5）顯示，在DDM培養(yǎng)基內(nèi)，鐮刀菌在pH 5～10均可生長(zhǎng)，且以pH 6～8之間生長(zhǎng)較好，這與供試菌株在PD培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)習(xí)性基本一致。說(shuō)明，在適宜培養(yǎng)pH范圍內(nèi)絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。

2.5絲狀真菌在DDM培養(yǎng)基內(nèi)的產(chǎn)孢量

由表6可知，供試鐮刀菌菌株在DDM培養(yǎng)基內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)孢量逐漸增加，但培養(yǎng)5～7 d內(nèi)差異不顯著，即在接種培養(yǎng)5 d后達(dá)到產(chǎn)孢高峰。說(shuō)明，相較PD培養(yǎng)基，鐮刀菌菌株在DDM培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)孢量更高，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

值的時(shí)間更短。

3討論與結(jié)論

馬唐是世界上分布最為廣泛的18種惡性雜草之一[18]，其生長(zhǎng)迅速，是我國(guó)黃淮海地區(qū)玉米田的主要優(yōu)勢(shì)雜草。我國(guó)每年由雜草造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[19]，且缺乏對(duì)雜草資源的有效利用方式，造成了大量生物質(zhì)資源的浪費(fèi)[20]。目前微生物培養(yǎng)基主要原料物質(zhì)為作物或合成化學(xué)物質(zhì)，成本相對(duì)較高。開(kāi)展以雜草為主要原料的微生物培養(yǎng)基，不僅有助于解決雜草資源的浪費(fèi)問(wèn)題，同時(shí)有助于降低微生物培養(yǎng)成本。

目前以植物病原真菌和以絲狀真菌的研究為基礎(chǔ)的生物防治工作越來(lái)越普遍，對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)基的需求也越來(lái)越高。復(fù)雜多樣的微生物，對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)基的要求也不同[21]。而一種優(yōu)質(zhì)、低廉和易制備的培養(yǎng)基對(duì)于生防真菌的研究至關(guān)重要。研究顯示，在禾本科雜草內(nèi)存在大量、多種類(lèi)的內(nèi)生真菌，例如醉馬草（Achnatheru minebrians）[22]、狗牙根（Cynodon dactylon）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）[14]等。這類(lèi)真菌能夠通過(guò)從寄主禾本科雜草內(nèi)獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以完成其大部分或全部的生命周期，并對(duì)增強(qiáng)禾本科雜草逆境適應(yīng)性有一定作用[23，24]。禾本科雜草內(nèi)生真菌的多樣性存在，也說(shuō)明禾本科雜草具有作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供廣適性真菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。這也為開(kāi)發(fā)以雜草為基礎(chǔ)的微生物培養(yǎng)基提供了理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本文以雜草馬唐為主要原料，研究了一種適宜于絲狀真菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基，進(jìn)一步研究顯示，該培養(yǎng)基可廣泛應(yīng)用于多種絲狀真菌的培養(yǎng)，且產(chǎn)孢速度快。

微生物培養(yǎng)過(guò)程中伴隨著一定的生物代謝過(guò)程，可能導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)pH值等條件的改變，因此環(huán)境條件適應(yīng)范圍廣等是微生物培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)應(yīng)用的主要條件之一[21]。本培養(yǎng)基內(nèi)的雜草馬唐制備獲取簡(jiǎn)單，且在較寬的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)pH范圍內(nèi)均能進(jìn)行正常的絲狀真菌培養(yǎng)。說(shuō)明禾本科雜草馬唐具有被開(kāi)發(fā)為微生物培養(yǎng)基原料的潛能，這為研究以雜草為基礎(chǔ)的微生物培養(yǎng)基提供了依據(jù)。

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