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    一種新型惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲聯(lián)合快速檢測膠體金試劑盒的性能評價

    2017-06-05 23:17:16何葉莉趙曉茹趙利利申艷李波毛遠
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2016年34期
    關(guān)鍵詞:性能評價瘧原蟲

    何葉莉 趙曉茹 趙利利 申艷 李波 毛遠麗 李伯安 王晗

    [摘要] 目的 評價一種新型惡性瘧和間日瘧聯(lián)合快速檢測膠體金試劑盒的檢測性能。 方法 對2001年1月~2016年4月解放軍第三〇二醫(yī)院及協(xié)助醫(yī)院留取的瘧原蟲感染患者及其他發(fā)熱患者全血樣本345例,分別采用瘧原蟲免疫膠體金法與顯微鏡檢法進行瘧原蟲檢測,以顯微鏡檢法結(jié)果為金標準評價免疫膠體金快速檢測試劑的靈敏度、特異度和一致性。 結(jié)果 發(fā)熱患者中血涂片鏡檢法檢出瘧原蟲感染204例,快速檢測膠體金試劑盒檢出瘧原蟲感染207例。其中惡性瘧原蟲免疫膠體金法檢出111例,顯微鏡檢法檢出112例,靈敏度為99.11%,特異度為100.00%,兩種方法一致性檢驗Kappa值為0.993,兩種檢測結(jié)果具有很好的一致性。間日瘧原蟲免疫膠體金法檢測出96例,顯微鏡檢法檢出92例,靈敏度為100.00%,特異度為98.42%,兩種方法的一致性檢驗Kappa值0.971,兩種檢測結(jié)果具有很好的一致性。 結(jié)論 新型快速檢測試劑盒瘧原蟲抗體免疫膠體金法與顯微鏡檢法結(jié)果具有較好的一致性,且具有操作簡便、快速、無需專業(yè)儀器和專門技術(shù)人員等優(yōu)點,適合于臨床實驗室瘧疾的輔助診斷和篩查。

    [關(guān)鍵詞] 瘧原蟲;免疫膠體金法;顯微鏡檢法;性能評價

    [中圖分類號] R531.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2016)12(a)-0004-04

    Performance evaluation of a plasmodium falciparum and plasmodium vivax malaria joint colloidal-gold rapid detection kit

    HE Yeli ZHAO Xiaoru ZHAO Lili SHEN Yan LI Bo MAO Yuanli LI Bo'an WANG Han

    Center for Clinical Laboratory, 302 Military Hospital of PLA Clinical Laboratory Diagnosis Center for Infectious Diseases of Military, Beijing 100039, China

    [Abstract] Objective To evaluate the performance of a plasmodium falciparum and plasmodium vivax joint colloidal-gold rapid detection kit. Methods 345 blood samples from patients with fever which included malaria parasite infection ones, collected from 302 Military hospital of PLA and its cooperative hospital from January 2001 to April 2016, were included in this study. According to microscopy which was used as the gold standard, the sensitivity, specificity and consistency of colloidal-gold rapid detection kit by immune colloidal gold method were calculated. Results Totally, plasmodium were detected in 204 samples by microscopy, while 207 samples were detected by immune colloidal gold method. Plasmodium falciparum were detected in 112 samples by microscopy, and 111 samples were detected by immune colloidal gold method. Accordingly, the sensitivity and specificity were 99.11% and 100.00% respectively. The consistency check value of Kappa of the two methods was 0.993, indicating the two methods had good consistency. For plasmodium vivax dectection, 96 samples were positive by immune colloidal gold method, while 92 were positive for that by microscopy. And the sensitivity and specificity were 100.00% and 98.42% respectively. The Kappa value was 0.971, indicating the two methods also had good consistency. Conclusion The two methods of immune colloidal gold method and microscopy method have good consistency. And the new rapid detection method by immune colloidal gold has the advantages of simple operation, rapid, no need of professional instrument and special technical personnel. It is suitable for clinical laboratory diagnosis and screening of malaria.

    [Key words] Plasmodium; Immune colloidal gold method; Microscopy; Performance evaluation

    瘧疾是一種嚴重威害人類健康的感染性寄生蟲病。世界衛(wèi)生組織(WHO)報告,截至2015年9月,全球瘧疾患者總數(shù)為21 400萬例,死亡4.38萬例[1]。2015年全國共計報告瘧疾病例3116例。全球約33億人受到瘧疾的威脅,給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝乐氐慕】滴:徒?jīng)濟負擔[2-3]。

    瘧原蟲是引起瘧疾的病原體,主要包括4種:惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。瘧原蟲感染多數(shù)發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國以惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲為主[4],多發(fā)生在華中和華南地區(qū),但在全國31個省份均有病例報告[5]。由于我國經(jīng)濟發(fā)展,尤其與非洲和南美洲等瘧疾的高發(fā)地區(qū)經(jīng)濟往來不斷增長,輸入性病例成為我國瘧疾病例的重要特點。2015年瘧疾病例98%以上為境外輸入性病例,且較2014年有所增加。

    瘧疾尚無有效疫苗[6],我國法定為乙類傳染病。若發(fā)生癥狀24 h內(nèi)不采取對癥治療,瘧疾會嚴重威脅生命造成死亡。目前我國和大多數(shù)發(fā)展中國家仍以顯微鏡鏡檢為主要檢測方法但該檢測方法需要具有經(jīng)驗的檢驗技術(shù)人員,且受主觀因素影響較大易漏診[7-8],因此快速、準確的檢測尤為重要。為此,筆者以惡性瘧原蟲特有的富組氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ)和瘧原蟲乳酸脫氫酶(plasmodium lactatedehy-diogenase,PLDH)作為主要靶抗原,研制了一種新型快速檢測試劑盒,以提高惡性瘧和間日瘧的早診率、治療有效率,降低病死率。本文對該新型免疫膠體金法試劑盒進行性能評價,以探討其臨床應(yīng)用價值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選擇2001年1月~2016年4月解放軍第三〇二醫(yī)院(以下簡稱“我院”)及協(xié)助醫(yī)院(云南省寄生蟲病防治所、云南省昆明市疾病預(yù)防控制中心)留取的瘧原蟲感染患者及其他發(fā)熱患者全血樣本345份,其中,瘧疾患者204例,年齡22~65歲,平均(43.5±17.2)歲,男118例,女86例;不明原因發(fā)熱患者141例,年齡10~69歲,平均(39.5±17.2)歲,男85例,女56例。

    1.1.1 臨床診斷 對發(fā)熱患者345例診斷分析,主要以瘧疾(59.13%)、尿路感染(11.88%)和敗血癥(7.25%)為主,其次為出血熱(4.93%)、肝膽病感染(4.35%)等其他疾病發(fā)熱患者。見表1。

    1.1.2 臨床癥狀 瘧原蟲感染患者均可出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀或伴隨重疊臨床表現(xiàn),熱型呈不規(guī)則型,主要以發(fā)熱(99.02%)、寒戰(zhàn)畏寒(88.73%)和乏力納差(63.24%)為主要臨床癥狀表現(xiàn)。見表2。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫膠體金法 采用我院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心研制的快速檢測膠體金診斷試劑盒,以抗惡性瘧原蟲特有的HRP-Ⅱ抗體和PLDH抗體作為檢測抗體,檢測患者血液中的HRP-Ⅱ和PLDH。將瘧原蟲膠體金檢測試劑取出放室溫平衡,采用吸管吸取5 μL新鮮抗凝管全血樣本或末梢血靜脈樣本,滴入樣本孔,在稀釋液孔滴加3~4滴稀釋液,待稀釋液滲透至膜底部,室溫放置,要求15 min內(nèi)判讀結(jié)果。如標本中含有瘧疾特異性抗原,將與預(yù)標記的抗體反應(yīng)形成復(fù)合物,在層析作用下,被預(yù)先固定在膜上的瘧疾特異性抗體捕獲,C為試驗控制線,T1為惡性瘧原蟲檢測線,T2為間日瘧原蟲檢測線,根據(jù)說明書要求,出現(xiàn)T1檢測線或T1+T2線為惡性瘧原蟲感染或混合感染,單獨出現(xiàn)T2檢測線為間日瘧原蟲感染,C線未出現(xiàn)判為試驗無效。

    1.2.2 顯微鏡檢法 采集患者靜脈血2 mL到抗凝管中或取末梢血1~2滴制作厚薄血涂片,選擇優(yōu)質(zhì)推片進行血涂片準備,推片邊緣整齊、平滑,使用前以弱酸溶液浸泡24 h以上,再用蒸餾水徹底清洗表面游離堿質(zhì),干燥后備用;載玻片參數(shù)推薦厚1.0~1.2 mm,面積25.4 mm×76.2 mm;制備血涂片時以推片醮取血液少許,置于載玻片右端1/3處,接觸載玻片至血液擴散成均勻線型,并保證推片與載玻片角度為30°~45°,均勻前推直至玻片尾部即載玻片左側(cè)1/6處。制片要求厚薄適宜、體尾平均、邊緣整齊,且血細胞分布均勻,占載玻片總面積的2/3;晾干后薄血膜用分析純甲醇固定,待再次晾干后,用吉姆薩染色液染色15~20 min后油鏡檢測瘧原蟲。吉姆薩染色液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號為[415093];顯微鏡選擇日本OLYMPUS公司CX21型生物顯微鏡,低倍鏡下可見核漿分明為宜,厚血膜需要由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)2~4圈,涂成直徑為0.8~1.2 cm的圓形,厚血膜的厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見到5~10個WBC為宜[4-5]。檢測全部厚血膜,未查見瘧原蟲,或者最少檢測100個薄血膜油鏡視野,未查見瘧原蟲為陰性。觀察到瘧原蟲環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體即為陽性,并鑒定蟲種。瘧原蟲形態(tài)學(xué)診斷依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第3版)。

    1.3 觀察指標

    以顯微鏡鏡檢法結(jié)果為準,對免疫膠體金快速檢測結(jié)果進行評價。①靈敏度又稱真陽性率,即實際患病而按該驗證方法的標準被正確判斷為患病的百分比,反映對照方法確定患病能力。②特異度又稱真陰性率,即實際未患病按該方法被正確地判斷為未患病的百分比,反映驗證方法確定非患病能力。③一致率又稱符合率,即驗證方法判定結(jié)果與對照方法診斷結(jié)果相同例數(shù)占總受檢例數(shù)比例。④Kappa系數(shù),反映驗證方法與對照方法結(jié)果的一致性[9]。

    2 結(jié)果

    345份疑似患者標本膠體金快速檢測檢出惡性瘧原蟲111份,顯微鏡檢檢出112份,靈敏度為99.11%,特異度為100.00%,Kappa值為0.993(表3)。膠體金快速檢測檢出間日瘧原蟲96份,顯微鏡檢檢出92份,靈敏度為100.00%,特異度為98.42%,Kappa值為0.971(表4)。免疫膠體金法共計檢出陽性標本207份,顯微鏡檢法共計檢出陽性標本204例,靈敏度為99.51%,特異度為97.16%,總符合率為98.55%,Kappa值為0.970,免疫膠體金法與顯微鏡檢法具有高度的一致性。選取4例不同膠體金快速檢測結(jié)果見圖1,顯微鏡檢法混合感染瘧疾環(huán)狀體和裂殖體見圖2。

    測試卡1為混合瘧原蟲測試卡2為惡性瘧原蟲感染患者測試陽性結(jié)果;測試卡3為間日瘧原蟲感染患者測試陽性結(jié)果;測試卡4為陰性檢測結(jié)果

    3 討論

    瘧疾的早期診斷和治療,可以減少瘧疾的危害[9-10]。瘧原蟲感染準確快速診斷已被列為世界衛(wèi)生組織瘧疾防治重要對策之一[12]。目前針對瘧原蟲的檢測主要有顯微鏡檢法、PCR擴增法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和免疫層析技術(shù)等[13]。顯微鏡檢法是目前瘧原蟲檢測的金標準,具有費用低、儀器簡單且不受環(huán)境限制等優(yōu)點,但容易受蟲密度含量較低和鏡檢人員技術(shù)高要求時產(chǎn)生較大漏診[14],此外鏡檢人員因眼睛疲勞也會導(dǎo)致讀片準確性和工作效率降低。血片質(zhì)量以沉渣、厚薄和酸堿性使鏡檢結(jié)果產(chǎn)生較高誤診率[15]。PCR擴增法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等分子生物學(xué),雖然準確度、靈敏度均很高,但技術(shù)復(fù)雜、成本高,需要具備一定的實驗室條件和一定經(jīng)驗的技術(shù)人員,操作時間長,很難實現(xiàn)現(xiàn)場和快速檢測[16]。免疫層析法則具有操作簡單、快速、無需特殊儀器、不受環(huán)境、條件限制等優(yōu)點。

    目前我國臨床實驗室使用的快速檢測瘧疾主要依賴國外進口,如CareStart瘧疾HRP-Ⅱ/PL.DH復(fù)合快速診斷試劑盒,可同時檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲,檢測靶物為HRPⅡ和PLDH,但其檢測成本昂貴,不利于篩查和基層實驗室使用。膠體金快速檢測試劑的檢測靈敏度和特異性也存在一定差異,在我國已經(jīng)獲得SFDA認證的快速診斷試劑僅有一家,難以滿足國內(nèi)檢測需求[17]。隨著我國經(jīng)濟貿(mào)易和文化交流的不斷推進,赴非洲和東南亞等瘧疾高發(fā)地區(qū)的務(wù)工人員不斷增加,使輸入性瘧疾病例呈現(xiàn)上升趨勢[18],研制低成本、高靈敏度和特異性的國產(chǎn)檢測瘧疾試劑盒,將有利于滇、貴、川及邊遠山區(qū)的基層實驗室、赴不發(fā)達國家任務(wù)執(zhí)行以及各傳染病和疾病預(yù)防控制中心臨床實驗室的常規(guī)使用和篩查。

    我院是全國最大和全軍唯一的傳染病??漆t(yī)院,擔負日常傳染病收治、會診以及反恐和公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置等任務(wù),每年接收大量不明原因發(fā)熱的患者。我院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心結(jié)合各傳染病醫(yī)院和疾病預(yù)防控制中心,通過大樣本對一種瘧原蟲抗體膠體金聯(lián)合快速檢測試劑盒的性能進行評價。本課題前期通過特異性HRP-Ⅱ和PLDH作為主要靶抗原,成功表達惡性瘧原蟲抗原HRP-Ⅱ和間日瘧原蟲抗原PLDH,制備檢測抗體。利用側(cè)向?qū)游龅牟噬槟z微球的致敏技術(shù)以及應(yīng)用于側(cè)向?qū)游龅逆溍褂H和素-生物素信號放大技術(shù),創(chuàng)建了一種新型瘧原蟲抗體膠體金快速檢測試劑盒。免疫膠體金法最低檢測出量為50~200個瘧原蟲/微升血(含550萬~600萬紅細胞),顯微鏡檢法最低檢出限3~4個/萬紅細胞[19-20],敏感性高于顯微鏡檢法,使得快速檢測試劑比傳統(tǒng)快速診斷試劑提高靈敏度5~10倍。根據(jù)臨床診斷結(jié)果和鏡檢法結(jié)果分析,免疫膠體金快速檢測試劑盒診斷瘧原蟲感染結(jié)果顯示靈敏度為99.51%、特異度為97.16%,符合率為98.55%,Kappa值為0.970,與顯微鏡檢法結(jié)果高度一致。與國外CareStart瘧疾HRP-Ⅱ/PL.DH復(fù)合快速診斷試劑盒的靈敏度和特異度為89.68%和98.26%[17]非常接近,同時高于國內(nèi)某品牌P.f/P.v檢測試劑盒的靈敏度和特異度為92.56%和98.57%[17],性能評價較好,符合實驗室診斷要求。

    綜上所述,該新型惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲聯(lián)合快速檢測膠體金試劑盒具有很好的靈敏度和特異性,可以作為顯微鏡檢法替代方法,為基層醫(yī)療機構(gòu)和大規(guī)模普查提供瘧疾的診斷依據(jù),同樣非常適用于維和任務(wù)、野外環(huán)境快速檢測等使用,為早期發(fā)現(xiàn)瘧疾患者,提高臨床治療療效提供重要手段。

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    (收稿日期:2016-09-02 本文編輯:程 銘)

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