纈沙坦及苯那普利對5/6腎切除大鼠血清瘦素水平及腎小球硬化的影響

楊利才，張道友，朱新儉，汪裕偉，徐海紅

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腎內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

纈沙坦及苯那普利對5/6腎切除大鼠血清瘦素水平及腎小球硬化的影響

楊利才，張道友，朱新儉，汪裕偉，徐海紅

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腎內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

目的：觀察纈沙坦及苯那普利對5/6腎切除大鼠血清瘦素(leptin)水平及其腎小球硬化的影響，探討其作用機制。方法：選用SD雄性大鼠30只，其中24只通過5/6腎切除法制造慢性腎功能衰竭(CRF)模型，術(shù)后2周隨機分為模型組、纈沙坦組及苯那普利組，另6只為假手術(shù)組。術(shù)后第6周末各組大鼠進行腎功能(Scr、BUN)及血清瘦素的測定；處死大鼠，取出腎臟進行病理組織形態(tài)學觀察，測定腎小球硬化指數(shù)(GSI)，采用免疫組織化學方法檢測腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)及纖維連接蛋白(FN)表達。結(jié)果：模型組瘦素明顯升高，與GSI、TGF-β1、ColⅣ及FN呈正相關(guān)(r值分別為0.871、0.951、0.919、0.913)。與模型組相比，纈沙坦組及苯那普利組血清瘦素水平明顯降低，腎功能及GSI明顯改善，腎臟轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1、Col Ⅳ及FN表達減少(P<0.01)。結(jié)論：慢性腎衰存在高瘦素血癥，阻斷RAS可通過降低瘦素水平改善腎小球硬化。

慢性腎功能衰竭；瘦素；血管緊張素受體阻斷劑；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；轉(zhuǎn)化生長因子β1

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.03.003

瘦素(leptin)是一種由脂肪組織分泌的蛋白類激素[1]。慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)患者普遍存在高瘦素血癥[2-3]。研究顯示[4-6]，瘦素不但介導心肌細胞的肥大，還能刺激腎小球內(nèi)皮細胞的增殖及促進系膜細胞肥大，并與肝臟纖維化程度顯著相關(guān)。由此提示，瘦素可能作為一種硬化因子參與器官或組織的硬化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能刺激脂肪細胞的瘦素分泌，且和瘦素具有協(xié)同效應[7-8]。為闡明瘦素、AngⅡ與腎小球硬化關(guān)系及機制。本研究建立慢性腎功能衰竭(CRF)大鼠模型，分析瘦素與腎小球硬化的關(guān)系，觀察纈沙坦及苯那普利對慢性腎衰大鼠血清瘦素水平及腎小球硬化的改善作用，闡明其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 SD大鼠購自南京青龍山實驗動物中心。6周齡，平均體質(zhì)量190 g。試驗藥物纈沙坦及苯那普利均購自本院藥房，免疫組化試劑盒、Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。瘦素放射免疫試劑盒購自北京北免東雅生物技術(shù)研究所。

1.2 5/6腎切除模型的建立 參照文獻方法[9]，SD大鼠喂養(yǎng)一周后開始模型建立，通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。行左側(cè)背部切口進腹，將左腎牽拉至體外，分離腎上腺，切除左腎上下極，殘余腎臟回納。一周后行右腎全切。假手術(shù)組只行麻醉進腹，不切除腎組織。

1.3 分組及給藥 模型建立1周后隨機分成4組，即假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組及苯那普利組。采用灌胃法給藥，纈沙坦組給藥劑量16 mg/(kg·d)，苯那普利組給藥劑量4 mg/(kg·d)，假手術(shù)組及模型組只以蒸餾水灌胃。

1.4 血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)及瘦素水平檢測 分別在本院檢驗科及核醫(yī)學科完成，BUN、 Scr、 TP、 Alb由全自動生化分析儀檢測，瘦素通過放免法檢測。

1.5 腎臟病理及免疫組化 腎臟組織經(jīng)固定、包埋后切片，行HE染色。腎組織Col Ⅳ、FN和TGF-β1的檢測具體步驟參照試劑盒說明書。腎小球硬化指數(shù)(GSI)的計算參考Raij等[10]半定量方法。腎小球Col Ⅳ、FN和TGF-β1蛋白表達的測定也采用半定量法，評分如下：0分為無染色或微弱染色；1分為局部弱染，染色面積<25%；2分為局部染色趨強，染色面積25%～50%；3分為染色面積51%～75%；4分為染色面積>75%。

2 結(jié)果

2.1 血清BUN、 Scr、 TP、 Alb及瘦素檢測結(jié)果 如表1所示，模型組血清BUN、Scr及瘦素明顯升高(P<0.01)，經(jīng)纈沙坦及苯那普利治療后，兩治療組上述指標明顯降低(P<0.01)。各組大鼠血清Alb無明顯差異(P>0.05)。

GruopnBUN/(mmol/L)Scr/(μmol/L)TP/(g/L)Alb/(g/L)leptin/(ng/mL)Sham67．72±1．3677．00±18．9578．12±2．4628．30±1．6910．84±2．67Model816．44±2．50144．60±19．2669．00±2．7826．70±1．4014．88±1．46Valsartan813．00±1．66125．67±12．0265．64±3．0126．31±2．9512．06±1．24Benazepril813．48±3．37120．80±12．8167．44±2．8824．16±3．9712．42±1．53F15．0621．4225．3032．6895．975P0．0000．0000．0000．0670．003

2.2 模型組大鼠血清瘦素水平與BUN、 Scr、TP、 Alb、GSI、腎小球TGF-β1、ColⅣ、 FN蛋白表達之間的關(guān)系 模型組腎小球可見肥大、局灶節(jié)段硬化、甚至全球硬化等不同表現(xiàn)，腎小球系膜區(qū)及基底膜區(qū)可見ColⅣ、 FN及 TGF-β1蛋白強表達，免疫組化表現(xiàn)為局部棕褐色的物質(zhì)沉積。如表2所示，模型組血清瘦素水平與GSI、 TGF-β1、ColⅣ 及FN呈顯著正相關(guān)，r值分別為0.871、0.951、0.919、0.913，P值分別為0.024、0.004、0.010、0.011，但與腎功能(Scr、BUN )及營養(yǎng)指標(TP、Alb)無明顯相關(guān)性(r值分別為0.593、0.432、-0.548、-0.783，P值分別為0.214、0.392、0.260、0.066)。

2.3 各組大鼠GSI、腎小球TGF-β1、ColⅣ、 FN蛋白表達結(jié)果 和模型組相比，纈沙坦組及苯那普利組GSI均明顯降低(P<0.01)，腎小球ColⅣ、FN及TGF-β1蛋白表達積分低于模型組(P<0.01),見表2。

3 討論

腎小球硬化是各種腎臟疾病的終末階段，是導致慢性腎衰竭的最根本的原因。研究腎小球硬化的發(fā)生、進展及干預機制有助于延緩及防止慢性腎衰的發(fā)生。5/6腎切除模型是慢性腎衰竭的經(jīng)典動物模型，具有與臨床相似的病理表現(xiàn)，本實驗中，大鼠5/6腎切除6周后，血清 BUN、Scr升高的同時，腎臟病理表現(xiàn)為腎小球局灶階段性硬化，甚至全球硬化，腎小球硬化指數(shù)升高。

瘦素是一種由脂肪組織分泌的蛋白類激素，由肥胖基因調(diào)控。慢性腎衰時存在高瘦素血癥，本實驗中也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清瘦素明顯升高，這和既往的臨床研究相似[2,11]。引起瘦素升高的原因可能因為瘦素生成增多或排泄減少，或者兩者同時存在。既往的研究顯示[12]，當切除動物雙腎后，體內(nèi)瘦素排泄急劇下降，提示腎臟是瘦素的主要排泄器官。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清瘦素水平與血清肌酐及尿素氮水平并不相關(guān)，提示慢性腎衰時血清瘦素水平升高可能是多因素的結(jié)果，具體因素有待進一步研究。

GroupGlomeruliGSITGF?β1ColⅣFNSham3．20±2．5901．03±0．301．13±0．32Model64．00±12．493．47±0．863．53±0．523．20±0．67Valsartan35．00±18．662．26±0．572．37±0．322．47±0．52Benazepril40．00±13．052．48±0．342．53±0．412．50±0．51F20．36739．10338．34015．300P0．0000．0000．0000．000

近年來瘦素作為一種促生長及硬化作用的因子受到眾多學者的注意，越來越多的證據(jù)表明瘦素參與了眾多器官或組織的增生、肥大及硬化。在對血管及心肌的研究中發(fā)現(xiàn)[13-14]，瘦素能誘導血管平滑肌及心肌細胞的肥大。在對慢性丙型肝炎的研究中也發(fā)現(xiàn)[6]，瘦素同樣能誘導肝細胞纖維化。在對腎臟固有細胞的研究中[4，15]，瘦素能誘導內(nèi)皮細胞及系膜細胞的增殖，具體機制可能和TGF-β1及TGF-α、Ⅳ膠原mRNA表達升高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，血清高瘦素水平與腎小球硬化顯著相關(guān)。高瘦素血癥可能通過刺激局部TGF-β1表達，引起細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增加，促進腎小球硬化。本研究中，5/6腎切除大鼠6周后，ColⅣ、FN升高的同時，血清瘦素水平及腎臟局部TGF-β1表達也顯著升高，且血清瘦素水平與TGF-β1、ColⅣ 及FN呈顯著正相關(guān)，證實這種假設(shè)。

研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，脂肪組織局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)激活與循環(huán)中瘦素水平密切相關(guān)，生理劑量的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)即能顯著增加3T3-L1脂肪細胞及人脂肪細胞的瘦素分泌，AngⅡ和瘦素也具有協(xié)同效應，提示RAS與瘦素關(guān)系密切。Santos 等[18]研究證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利能顯著減少年輕大鼠血瘦素水平。新近的研究也表明[7]，在大腦內(nèi)也存在瘦素-RAS的相互作用，瘦素能激活腦內(nèi)RAS，卡托普利能減輕瘦素對腎臟交感神經(jīng)的影響，這也為控制慢性腎衰高瘦素血癥提供了可能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纈沙坦及苯那普利組腎功能及腎小球硬化改善的同時，血清瘦素水平顯著降低，腎臟局部TGF-β1表達及ECM合成減少，提示阻斷RAS可能通過降低瘦素水平改善腎小球硬化。

本研究進一步證實了瘦素參與腎小球硬化可能機制，同時提示高瘦素血癥可能為RAS激活后的一個下游事件，降低瘦素水平可以改善腎小球硬化，這也為延緩腎小球硬化的提供了一種新的治療途徑。

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Effects of valsartan and benazepril on serum leptin levels and glomerulosclerosis in rats with 5/6 nephrectomy

YANG Licai,ZHANG Daoyou,ZHU Xinjian,WANG Yuwei,XU Haihong

Department of Nephrology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To observe the changes of serum leptin levels and the relationship with glomerulosclerosis as well as the effects of valsartan and benazepril on the serum leptin levels in model rats of 5/6 nephrectomy for identifying the mechanisms of serum leptin levels and glomerulosclerosis.Methods:A total of 30 male SD rats were selected,in which 6 were included as sham operation group,and 24 were undergone 5/6 nephrectomy to develop the chronic renal failure(CRF) model and randomized into model group,valsartan group and benazepril group 2 weeks after modeling.By the sixth week after operation,rats in each group were measured for the blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr) and leptin levels.Then the rats were sacrificed to take the kidneys for histological observation on the pathological changes and determination of glomerulosclerosis index(GSI).Immunohistochemistry was used to detect the expression of transforming growth factorβ1(TGF-β1)protein,fibronectin(FN) and collagen Ⅳ(Col Ⅳ) in the glomeruli.Results:Serum leptin level was significantly elevated and positively correlated with GSI,TGF-β1,Col Ⅳ and FN in rats in the model group.Rats treated with valsartan or benazepril had significantly decreased serum leptin levels,ameliorated renal function and GSI,yet evidently down-regulated expression of TGF-β1,FN and ColⅣ in glomeruli compared to the models(P<0.01).Conclusion:Hyperleptinemia is commonly concomitant with chronic renal failure,however,glomerulosclerosis may be improved by reduceing the leptin levels via blocking renin-angiotensin system(RAS).

chronic renal failure;leptin;angiotensin receptor blockers;angiotensin-converting enzyme inhibitor;transforming growth factor-β1

1002-0217(2017)03-0211-04

2016-09-10

楊利才(1973-)，男，副主任醫(yī)師，(電話)13135535819，(電子信箱)yjsyanglicai@sina.cn。

R 692.5

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