LC–IT–TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分＊

顏鴻飛，王美玲，鄒燦，陳練，呂小園，戴潔蕓

(湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家食品安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004)

LC–IT–TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分＊

顏鴻飛，王美玲，鄒燦，陳練，呂小園，戴潔蕓

(湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家食品安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004)

建立了湖南黑茶中水溶性成分的液相色譜–離子阱串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC–IT–TOF MS)快速分離和確證方法。實(shí)驗(yàn)用90℃熱水恒溫提取湖南黑茶樣品中水溶性成分，采用液相色譜–離子阱串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對其中的水溶性提取物進(jìn)行分離測定。利用準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)匹配和自建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合保留時(shí)間、多級質(zhì)譜、特征碎片離子等信息，對湖南黑茶中的43種水溶性化合物的進(jìn)行了初步確證。該法可得到黑茶獨(dú)特滋味品質(zhì)的特征成分，為湖南黑茶品質(zhì)評價(jià)和質(zhì)量控制提供了一種新的技術(shù)手段。

液相色譜–離子阱串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜；湖南黑茶；水溶性成分

以安化黑茶為代表的湖南黑茶不僅獲得了非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的殊榮，還被評為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，成為國內(nèi)外茶葉市場新貴，深受廣大消費(fèi)者青睞［1］。茶葉含有豐富的化學(xué)成分如兒茶素、咖啡堿、黃酮類、酚酸、茶皂素、糖、有機(jī)酸、氨基酸和芳香物質(zhì)等代謝產(chǎn)物，是構(gòu)成其風(fēng)味特征的物質(zhì)基礎(chǔ)。茶葉種植的產(chǎn)地、氣候、環(huán)境等因素的不同，造成它們的化學(xué)成分的種類及含量差異。通過鑒定和分析茶葉中特定化學(xué)成分來對茶葉品質(zhì)、產(chǎn)地溯源和生產(chǎn)工藝等進(jìn)行科學(xué)評價(jià)，已經(jīng)成為茶葉成分代謝組學(xué)研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前茶葉中水溶性成分研究主要采用比色法［2］、高效液相色譜法(HPLC)［3–4］、高效毛細(xì)管電泳色譜法(HPCE)［5］、薄層色譜法(TLC)［6］和液相色譜–質(zhì)譜法［7–8］，其中液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸成為茶葉水溶性成分研究的重要技術(shù)手段。但大部分液相色譜–質(zhì)譜方法采用低分辨的離子阱或四級桿質(zhì)譜，存在著化學(xué)結(jié)構(gòu)信息缺失或不全的可能性，成分結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性有待提高。由于茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，許多化學(xué)成分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，需要用定性能力更強(qiáng)的高分辨率質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜來對茶葉組分進(jìn)行精準(zhǔn)分析。離子阱串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(IT–TOF MS)兼具離子阱和高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜的快速檢測能力，可同時(shí)提供母離子精確質(zhì)量數(shù)及多級碎片離子信息，在化合物快速鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用［9–18］。筆者采用LC–IT–TOF MS對湖南黑茶中水溶性成分進(jìn)行分離和正、負(fù)離子模式同時(shí)掃描測定，利用準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)匹配和自建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合保留時(shí)間、多級質(zhì)譜和特征碎片離子等信息對其中的43種水溶性化合物進(jìn)行鑒定分析，獲得了湖南黑茶滋味品質(zhì)的特征成分，對湖南黑茶的質(zhì)量控制、品質(zhì)評價(jià)、真?zhèn)舞b別和保健功能開發(fā)均有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜／離子阱–飛行時(shí)間／串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本島津公司；

超聲波清洗器：B8510E型，美國Branson公司；

高速離心機(jī)：1–15P型，德國Sigma公司；

研磨儀：GRINDOMIX GM200型，德國Retsch公司；

樣品：湖南黑茶，市售；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；

沒食子酸、沒食子兒茶素、可可堿、茶堿、表沒食子酸兒茶素、兒茶素、咖啡因、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98%，美國Sigma公司；

綠原酸、咖啡酸、茶黃素、楊梅素、榭皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品：純度均不小于98%，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm，

3.5 μm，美國菲羅門公司)；流量：0.3 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度淋洗程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子同時(shí)掃描；掃描范圍：m／z100～1 000；加熱模塊溫度：200℃；CDL溫度：200℃；霧化氣流量：1.5 L／min；干燥氣流量：10 L／min；離子源電壓：正離子模式為4.5 kV，負(fù)離子模式為–3.5 kV；檢測器電壓：1.7 kV；質(zhì)量數(shù)校準(zhǔn)方法：自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)；分子式預(yù)測軟件為Shimadzu Formula Predictor。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Profiling Solution軟件對所有樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。保留時(shí)間范圍：1～20 min；質(zhì)量范圍：m／z100～1 000；質(zhì)量允許偏差：5 mDa；強(qiáng)度閾值：50 000；保留時(shí)間允許誤差：0.5 min；數(shù)據(jù)處理結(jié)果進(jìn)行峰值獲取，并列出每個(gè)峰的m／z值、保留時(shí)間和信號強(qiáng)度，以提取離子峰的m／z值和信號強(qiáng)度值來創(chuàng)建峰列表。

化合物的定性分析方法：①用Met ID solution軟件，通過分析質(zhì)譜找出化合物的分子離子峰，將待鑒定色譜峰的精確分子量及分子式在自建的數(shù)據(jù)庫中搜索精確分子質(zhì)量數(shù)、同位素比相匹配的化合物，進(jìn)行快速篩查，并根據(jù)多級質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行確證；②查閱相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出可能的化合物；③對于文獻(xiàn)中未報(bào)道的未知化合物，根據(jù)獲得的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)信息預(yù)測其分子式，并在化合物信息查詢網(wǎng)址中搜索分子式，同時(shí)根據(jù)多級質(zhì)譜及碎片離子的裂解規(guī)律進(jìn)行確證鑒別。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

取有代表性的茶葉樣品500 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過0.83 mm(20目)篩，混勻，均分成兩份作為試樣，分裝入潔凈的容器內(nèi)，密封并標(biāo)記，常溫下保存。在制樣和儲(chǔ)存過程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

稱取1.0 g上述茶試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞聚四氟乙烯離心試管中，加入90℃熱水25 mL，并在90℃恒溫水浴中浸泡提取20 min，期間每隔10 min振搖1次。提取后，冷卻至室溫，定容至50 mL，取上層清液1 mL，以10 000 r／min離心10 min，過0.22 μm濾膜，作為試樣液供LC–IT–TOF MS測定［20］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了常見的幾種流動(dòng)相：水–甲醇、水–乙腈，5 mmol/L乙酸胺–乙腈、0.1%乙酸–甲醇和0.1%乙酸–乙腈等體系對分離效果、色譜峰形及質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用水–乙腈、水–甲醇和5 mmol/L乙酸胺–乙腈作流動(dòng)相，有部分色譜峰拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，分離效果欠佳。往流動(dòng)相中添加適量乙酸(0.1%)后，色譜峰型有所改善，基線更平穩(wěn)，分離效果得到明顯改善。但隨著乙酸濃度的增大，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度反而有所下降，可能是黑茶中含有較多的酚羥化合物，酸度太強(qiáng)則抑制了某些化合物的離子化。在相同流速和梯度下，0.1%乙酸–乙腈較0.1%乙酸–甲醇的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)信號更好。所以，選擇0.1%乙酸–乙腈為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

黑茶中水溶物成分十分復(fù)雜，含有大量的有機(jī)酸、寡糖、酚酸、氨基酸、黃酮和糖苷等成分。大部分化合物在正負(fù)離子模式下均能電離，但負(fù)離子模式響應(yīng)大于正離子模式，只有小部分化合物如咖啡因、可可堿、茶堿等生物堿類化合物只在正離子模式下有響應(yīng)。為充分利用離子阱串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的快速正負(fù)極轉(zhuǎn)換功能，對樣品進(jìn)行正、負(fù)離子模式應(yīng)同時(shí)掃描，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣可同時(shí)獲得分析成分的正負(fù)離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)，為化合物鑒別增加了新的參考信息。此方法節(jié)省了分析時(shí)間，提高了定性分析的速度和可靠性。此外，對質(zhì)譜的離子源溫度、干燥氣流和檢測器電壓進(jìn)行優(yōu)化，能夠使大部分目標(biāo)化合物有良好的信號響應(yīng)，檢測靈敏度和質(zhì)譜采集質(zhì)量得到進(jìn)一步提高，使得定性鑒別的結(jié)果更加可靠。

2.3 湖南黑茶水溶性成分分析

在1.2儀器條件下，對湖南黑茶樣品溶液進(jìn)行分析，圖1為樣品溶液的LC–IT–TOF MS全掃描總離子流圖。由圖1可知，一些化合物在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，負(fù)離子模式下出現(xiàn)的峰多于正離子模式下出現(xiàn)的峰。所得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可通過Met ID solution定性分析軟件中特征提取技術(shù)將樣品中大于一定豐度的化合物提取出來，在自建的數(shù)據(jù)庫中搜索精確分子質(zhì)量數(shù)匹配的化合物，進(jìn)行快速篩查，并根據(jù)多級質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行確證。代表性物質(zhì)的質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖2、圖3。

圖1 湖南黑茶樣品正負(fù)離子模式下的全掃描總離子流圖

圖2 槲皮素的一級質(zhì)譜圖(a)及其二級質(zhì)譜圖(b)(ESI–)

圖3 表兒茶素的一級質(zhì)譜圖(a)及其二級質(zhì)譜圖(b)(ESI–)

表2為湖南安化黑茶樣品中各峰的測定數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果，可以看出，黑茶中水溶性化合物主要有糖類、有機(jī)酸類、酚酸類、氨基酸類、黃酮及黃酮苷類和多酚類，這些物質(zhì)都是形成黑茶茶湯特殊風(fēng)味的重要物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其它未知峰成分需在以后的研究中采用所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或者利用其它技術(shù)進(jìn)一步確證。

3 結(jié)語

建立了湖南黑茶中水溶性成分的LC–IT–TOF MS非靶標(biāo)分析方法，利用離子阱–飛行時(shí)間串聯(lián)

質(zhì)譜快速正負(fù)極轉(zhuǎn)換檢測能力，對主要成分的精確分子質(zhì)量數(shù)、多級質(zhì)譜碎片離子等信息進(jìn)行有效分析和鑒別。通過該方法初步確證了43個(gè)水溶性化學(xué)成分，其它未知成分需在以后的研究中采用所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或者利用其它確證技術(shù)進(jìn)一步確證。結(jié)果表明，湖南黑茶中水溶性化合物主要有糖類、有機(jī)酸類、酚酸類、氨基酸類、黃酮及黃酮苷類和多酚類等，這些物質(zhì)構(gòu)成了湖南黑茶茶湯獨(dú)特風(fēng)味。

表2 湖南黑茶樣品中化合物的保留時(shí)間及質(zhì)譜特征

［1］孟濤，鄒勛.安化黑茶產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展策略［J］.茶葉通訊，2011，38(1): 17–20.

［2］周國蘭，喻云春，胡華健，等.茶花與茶葉常規(guī)生化成分分析研究［J］.茶葉，2009，35(2): 85–86.

［3］康海寧，陳波，韓超，等. HPLC 法測定茶葉水提取液中五種兒茶素和咖啡堿及其用于茶葉分類的研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2007，26(2): 211–215.

［4］白秀芝，王美玲，顏鴻飛，等.高效液相色譜指紋圖譜和隨機(jī)森林應(yīng)用于湖南安化黑茶水溶性成分的研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2014，23(11): 1 268–1 273.

［5］夏文娟，張麗霞，王日為.毛細(xì)管電泳法同時(shí)分析茶黃素類和兒茶素類化合物［J］.色譜，2006，24(6): 592–596.

［6］王麗麗，王坤波，黃建安，等.茶葉中兒茶素薄層色譜分離所用展開劑的優(yōu)化［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，38(1): 102–105.

［7］梁華正，陳煥文.表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速測定茶葉化學(xué)指紋圖譜［J］.應(yīng)用化學(xué)，2008，25(5): 519–523.

［8］盧嘉麗，王冬梅，苗愛清，等.白葉單樅和黃觀音茶樹芽葉中茶多酚的HPLC–DAD／MS／MS分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42(l9): 1 456–1 458.

［9］王美玲，顏鴻飛，傅善良，等.高效液相色譜–離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜對保健食品中激素類成分的快速篩查和確證［J］.色譜，2012，30(10): 980–985.

［10］張帆，顏鴻飛，戴潔云，等.食品多組分添加劑及非法添加物的HPLC–HRMS廣譜篩查［J］.食品與機(jī)械，2016，32(8): 42–48.

［11］夏云，陳黎，王靜蓉，等.超高效液相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析柏芩清火顆粒中的化學(xué)成分［J］.中南藥學(xué)，2011，9(3): 166–169.

［12］張磊，曾仲大，葉國柱，等.基于氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用與液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)用于3類茶葉中化學(xué)成分分析［J］.色譜，2014，32(8): 804–816.

［13］Zhao Y，Chen P，Lin L，et al. Tentative identification quantitation，and principal component analysis of green pu-erh，green，and white teas using UPLC／DAD／MS［J］. Food Chemistry，2011，126(3): 1 269–1 277.

［14］Del Rio D，Stewart A J，Mullen W，et al. HPLC–MS analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(10): 2 807–2 815.

［15］Junfeng Tan，Weidong Dai，Meiling Lu，et al. Study of the dynamic changes in the non-volatile chemical constituents of black tea during fermentation processing by a non-targeted metabolomics approach［J］. Food Research International，2016，79(1): 106–113.

［16］Qi Lianwen，Li Ping，Ren Meiting et al. Application of highperformance liquid chromatography electrospray ionization time-of flight mass spectrometry for analysis and quality control of Radix Astragali and its preparations ［J］. Journal of Chromatography A，2009，1 216(11): 2 087–2 097.

［17］董靜，王弘，萬樂人，等.高效液相色譜／電噴霧–離子阱–飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒定中藥虎杖中的主要化學(xué)成分［J］. 色譜，2009，27(4): 425–430.

［18］芮雯，馮毅凡，劉守鉀，等.毛茛黃酮類成分的UPLC HILIC／Q–TOF–MS分析［J］. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(8): 18–21.

農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站站長名單公布

2016年末，農(nóng)業(yè)部曾公布“十三五”農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站建設(shè)名單?！锻ㄖ分兄赋?，“十三五”期間將形成由42個(gè)綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、297個(gè)專業(yè)性(區(qū)域性)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和269個(gè)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站組成的37個(gè)學(xué)科群農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室體系。隨著實(shí)驗(yàn)室建設(shè)工作的落地開展，農(nóng)業(yè)部不久前也批準(zhǔn)了重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、學(xué)術(shù)委員會(huì)主任和農(nóng)業(yè)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站站長人選。其中，批準(zhǔn)林敏等專家擔(dān)任農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，批準(zhǔn)趙國屏等專家擔(dān)任農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的學(xué)術(shù)委員會(huì)主任，批準(zhǔn)李錫香等專家擔(dān)任農(nóng)業(yè)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站的站長，任期至2020年12月31日。

據(jù)悉，各實(shí)驗(yàn)室主任和實(shí)驗(yàn)站站長將按照《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于公布“十三五”農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站建設(shè)名單的通知》(農(nóng)辦科〔2016〕29號)要求，認(rèn)真研究編制本實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)站的建設(shè)任務(wù)書，明確建設(shè)內(nèi)容和年度考核指標(biāo)，加強(qiáng)對實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)站的日常管理，扎實(shí)推進(jìn)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站的建設(shè)工作，為提升農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新能力做出積極貢獻(xiàn)。各學(xué)術(shù)委員會(huì)主任則定期組織學(xué)術(shù)活動(dòng)，指導(dǎo)監(jiān)督重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室切實(shí)按照建設(shè)任務(wù)開展科研工作。（儀器信息網(wǎng)）

食藥監(jiān)總局印發(fā)食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范

2015年新食品安全法出臺(tái)，規(guī)定“采用快速檢測方法對食品進(jìn)行抽查檢測，被抽查人對檢測結(jié)果沒有異議的，可以作為行政處罰的依據(jù)”，某種程度上給快檢結(jié)論賦予了法律效力，由此催生食品快檢行業(yè)及快速檢測方法的高速發(fā)展。

2017年3月28日，為保證食品快速檢測方法評價(jià)工作的科學(xué)性和規(guī)范性，食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。這也意味著風(fēng)頭正勁的快檢技術(shù)自此有了評價(jià)規(guī)范，變得有據(jù)可依。 （儀器信息網(wǎng)）

Determination of Water–Soluble Compounds in Black Tea by LC–IT–TOF MS Method

Yan Hongfei，Wang Meiling，Zou Can，Chen Lian，Lyu Xiaoyuan，Dai Jieyun
(Hunan Entry–Exit Inspection and Quarantine Bureau，State Key Laboratory of Food Safety Testing，Changsha 410004, China)

The liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry (LC–IT–TOF MS)method for rapid separation and identification of water–soluble components in Hunan dark tea was established. The samples of Hunan dark tea were extracted by hot water at 90℃. The water–soluble extracts were analyzed by liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry (LC–IT–TOF MS). The 43 compounds were isolated and identified simultaneously by using accurate mass matching and self-established mass spectrometry database combined with retention time，multiple-stage ion mass spectral，characteristic fragment ions. Through identification of the characteristic component of dark tea’s unique taste quality, a new technical means for Hunan dark tea quality evaluation and control was provided.

liquid chromatography–ion trap time of flight mass spectrometry; Hunan dark tea; water–soluble compound

657.7

A

1008–6145(2017)03–0022–05

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015JC3128)

聯(lián)系人：顏鴻飛；E-mail: yanhf@hnciq.gov.cn

2017–02–08

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.03.005