基于差異蛋白質(zhì)組學(xué)解析紫色桿菌素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的作用機(jī)制

劉鷺，蘆晶，王瑩，逄曉陽(yáng)，許嫚，張書(shū)文，呂加平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

基于差異蛋白質(zhì)組學(xué)解析紫色桿菌素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的作用機(jī)制

劉鷺，蘆晶，王瑩，逄曉陽(yáng)，許嫚，張書(shū)文，呂加平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】對(duì)紫色桿菌素作用后的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，探究其影響的代謝通路，揭示其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為新型抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的參考?！痉椒ā恳圆煌瑒┝康淖仙珬U菌素處理HT29 24、48、72 h，通過(guò)MTT試驗(yàn)以及透射電鏡分析其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的有效抑制劑量及抑制情況。在此基礎(chǔ)上，對(duì)提取的3個(gè)處理組的蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記，利用反相液相色譜（RP-LC）聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜（AB SCIEX Triple TOF 5600）獲得樣品中的多肽及其相對(duì)豐度信息，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI. Human. protein database）搜索比對(duì)，鑒定差異表達(dá)蛋白。利用GO分析、KEGG信號(hào)通路分析，解析紫色桿菌素抑癌作用代謝途徑?！窘Y(jié)果】紫色桿菌素對(duì)HT29的抑制作用呈一定的時(shí)間、劑量依賴(lài)性。當(dāng)紫色桿菌素對(duì)HT29的抑制率達(dá)50%時(shí)，僅為陽(yáng)性藥物5-Fu劑量的1/6，具有更明顯的抑制效果。電鏡下觀察顯示，隨著紫色桿菌素劑量增大，細(xì)胞內(nèi)部線粒體出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，質(zhì)膜出泡；當(dāng)濃度達(dá)30 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞膜消失，染色質(zhì)邊集。通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出4 258個(gè)蛋白，表達(dá)差異在2倍以上的蛋白共為757個(gè)。其中高劑量組處理差異蛋白數(shù)為492個(gè)，低劑量組處理的差異蛋白數(shù)為112個(gè)，陽(yáng)性對(duì)照組差異蛋白數(shù)為336個(gè)。KEGG分析顯示這些差異蛋白共參與50條信號(hào)通路。其中有10條信號(hào)通路具有顯著性（P＜0.05），主要參與核糖體循環(huán)途徑、三羧酸循環(huán)途徑和RNA降解途徑等。【結(jié)論】紫色桿菌素主要通過(guò)影響HT29細(xì)胞生命活動(dòng)中的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)而發(fā)揮抑制作用。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)；紫色桿菌素；HT29；iTRAQ同位素相對(duì)標(biāo)記和絕對(duì)定量；透射電鏡

0 引言

【研究意義】天然色素具有安全、營(yíng)養(yǎng)、多功能性的特點(diǎn)。目前所研究的天然色素主要以紅、黃色調(diào)為主，如利用紅曲菌生產(chǎn)紅色素、利用 Phaffia rhodozyma酵母、Micrococcus roseus、Brevibacterium linens等菌生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素[1-4]。天然藍(lán)色素是天然色素中的稀缺色素。紫色桿菌素（violacein，Vio）是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于吲哚類(lèi)衍生物，為天然色素，對(duì)絲綢、棉、毛等天然原料具有良好著色效果；它除了著色功能，同時(shí)兼具抑菌、殺錐蟲(chóng)、抗病毒（皰疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒）以及抑制癌細(xì)胞（大細(xì)胞肺瘤、結(jié)腸癌等）增殖的作用[5-11]。BROMBERG等[12]發(fā)現(xiàn)埃希氏腹水瘤對(duì)紫色桿菌素的敏感性是正常淋巴細(xì)胞對(duì)紫色桿菌素的兩倍。紫色桿菌素可使細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），降低體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，進(jìn)而對(duì)埃希氏腹水瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的抑制作用。KODACH等[13]認(rèn)為紫色桿菌素可增加5-Fu對(duì)細(xì)胞的毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，抑制Akt磷酸化作用，終止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。紫色桿菌素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的治療很有前景?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】產(chǎn)紫色桿菌素（violacein，Vio）的細(xì)菌來(lái)源較為廣泛，包括海洋、淡水、冰川及土壤等。產(chǎn)紫色桿菌素的細(xì)菌種類(lèi)也較多，如 Collimonas、 Duganella、 Janthinobacterium、Microbulbifer sp.、Pseudoalteromonas[10,11,14-20]。筆者實(shí)驗(yàn)室從山羊乳中分離獲得一株高產(chǎn)紫色桿菌素的Janthinobacterium lividum ZSJ。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，Vio產(chǎn)量最高可達(dá)2.87 g·L-1[5]。研究認(rèn)為紫色桿菌素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程的活性氧簇物（reactiveoxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生有很大的影響。CARVALHO等[21]認(rèn)為由紫色桿菌素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的活性氧簇物是導(dǎo)致線粒體膜發(fā)生崩潰的關(guān)鍵因子。活性氧簇物導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞中Caspase3的激活、細(xì)胞色素C和鈣釋放至細(xì)胞質(zhì)中。但紫色桿菌素不能增加 HT29細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇物的含量，紫色桿菌素對(duì)不同的細(xì)胞具有特異性。MENEZES等[14]對(duì)比了紫色桿菌素對(duì)9種人類(lèi)癌細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素對(duì)不同的細(xì)胞抑制程度不同，對(duì)NCI/ADR-RES細(xì)胞具有選擇抑制性。紫色桿菌素可以引起HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對(duì)人的正常淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞沒(méi)有影響[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)紫色桿菌素抑癌的研究主要聚焦于對(duì)具體通路（如調(diào)亡通路）的研究：如何引起細(xì)胞凋亡，對(duì)凋亡因子（caspase-2、caspase-9、caspase-3等）以及凋亡誘導(dǎo)因素（ROS）的分析[10-11,20]。而利用高通量篩選技術(shù)全面解析紫色桿菌素作用機(jī)制的研究較少。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間相互作用等進(jìn)行高通量的篩選和分析。相比于傳統(tǒng)單個(gè)蛋白的研究，蛋白組學(xué)研究更能夠準(zhǔn)確反映機(jī)體的狀態(tài)和揭示新的作用途徑。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從不同劑量處理的癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生物學(xué)差異出發(fā)，利用高通量的iTRAQ技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)策略，分析與鑒定差異表達(dá)蛋白；并通過(guò)GO分析、KEGG代謝通路分析，全面解析紫色桿菌素的作用途徑，為揭示紫色桿菌素的作用機(jī)制提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2014年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所和北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

HT29細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自美國(guó)Gibco-BRL公司；凍存管、培養(yǎng)皿、24孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；青鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、四氮甲基偶氮唑鹽（MTT）、蛋白酶抑制劑、色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)乙醇、丙酮、尿素等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu）購(gòu)自上海晶純生化科技。

將不同劑量的紫色桿菌素與HT29細(xì)胞共同孵育24、48、72 h，采用MTT分析其存活率，同時(shí)設(shè)置不同劑量的5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照；以透射電鏡于8 000×觀察作用后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。在此基礎(chǔ)上，以 1 mg·L-1紫色桿菌素為低劑量處理，30 mg·L-1紫色桿菌素為高劑量處理，分別作用HT29細(xì)胞48 h，同時(shí)設(shè)置5-Fu為陽(yáng)性藥物作用于HT29。作用完畢，收集細(xì)胞，裂解、酶解。采用iTRAQ試劑盒標(biāo)記蛋白，通過(guò)反相液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)提取的蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，這部分試驗(yàn)在北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HT29細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，用含5%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—5 d。每3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的HT29細(xì)胞為上皮樣，單層貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定—MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)至其密度為1×104/mL。將其接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，置于5% CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待80%細(xì)胞融合后，按試驗(yàn)分組進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT（5 mg·mL-1），孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定A值。設(shè)5-Fu為陽(yáng)性藥物對(duì)照。

1.2.3 培養(yǎng)細(xì)胞電鏡樣品的制備 利用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)至細(xì)胞密度為1×104/mL接種于24孔板中，培養(yǎng)條件同1.2.1。待80%細(xì)胞融合后，分別以0.1 mg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1和30 mg·L-1不同劑量的紫色桿菌素作用于HT29細(xì)胞24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，與培養(yǎng)液一起1 500 r/min離心5 min，棄上清，采用2.5%戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)塊2—4 h，0.1 moL·L-1PBS洗滌3次，1%鋨酸固定1 h，0.1 moL·L-1PBS洗滌3次，梯度濃度酒精、丙酮脫水，618環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，于透射電鏡（H7500，日本）下觀察及拍照。

表1 同位素標(biāo)記Table 1 Isotope labeling

1.2.4 蛋白組學(xué)測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞樣品制備、裂解及蛋白提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)至其密度為1×104/mL。將其接種于24孔板中，培養(yǎng)條件同1.2.1。待細(xì)胞單層貼壁后，分別采用高劑量（30 mg·L-1）、低劑量（1 mg·L-1）的紫色桿菌素作用于鋪板的細(xì)胞48 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，采用胰酶消化細(xì)胞，離心，PBS洗滌兩次，收集沉淀。加入尿素和蛋白酶抑制劑溶液，冰水浴超聲波破碎（2 S、2 S，1 min，22%）。離心收集上清，加入4倍體積的預(yù)冷丙酮沉淀，離心收集沉淀。再加入復(fù)溶劑和0.1%SDS，超聲（2 S、2 S，1 min，22%），離心收集上清。采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)還原、封閉及消化 蛋白質(zhì)還原烷基化：每組樣品各取75 μg，用復(fù)溶buffer補(bǔ)足體積至20 μL，加入2 μL還原劑，60℃孵育1 h，冷卻，加入半胱甘酸1 μL，室溫避光孵育10 min。

蛋白質(zhì)的消化：每個(gè)樣品管加入2 μL 0.5 μg·μL-1胰蛋白酶，37℃過(guò)夜；次日補(bǔ)加2 μL 0.5 μg·μL-1胰蛋白酶，37℃孵育2 h。

1.2.4.3 肽段的 iTraq標(biāo)記 采用 iTraq4試劑盒（iTR AQ 4 plex，AB SCIEX）對(duì)不同樣品進(jìn)行不同大小的同位素標(biāo)記（表1）。

1）將標(biāo)記試劑平衡至室溫；

2）每管標(biāo)記試劑中加入70 μL色譜級(jí)乙醇，旋渦振蕩1 min，離心甩至管底；

3）將混好的標(biāo)記試劑加入到肽段中，不同樣品用不同大小的同位素標(biāo)記；

4）混勻后，甩至管底，室溫靜置2 h；

5）真空抽干標(biāo)記；

6）4℃保存。

1.2.4.4 質(zhì)譜測(cè)定 質(zhì)譜鑒定所用儀器為美國(guó) AB SCIEX公司的AB Sciex Triple TOF 5600 -液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀。采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；PMF的質(zhì)譜掃描范圍：一級(jí)采集質(zhì)量范圍為350—1 250 Da，二級(jí)采集質(zhì)量范圍為100—1 500 Da。離子源電壓為2 500 v。富集柱為C18，5 μm，20 mm Length；分離柱為C18，3 μm，150 mm Length。流動(dòng)相：A，1.9% ACN+98% H2O+0.1% FA；B，98% ACN+1.9% H2O+0.1% FA，流速為330 nL·min-1。

搜索參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫(kù)為 NCBI.Human.protein-20130701；酶為胰蛋白酶；搜索引擎：AB官方ProteinPilot?Software Beta(4.5)；一級(jí)誤差：10 ppm，二級(jí)誤差：20 ppm。

1.2.4.5 數(shù)據(jù)分析 原始文件（mgf）用 Proteomics Tools分析軟件抽提肽段報(bào)告離子峰定量信息，分別以S1（115）、S2（116）、S3（117）為內(nèi)參對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化分析處理，采用軟件計(jì)算各肽段比值的加權(quán)平均值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果，將定量及鑒定結(jié)果進(jìn)行合并處理，將差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析（GO分析、KEGG代謝通路分析）。

2 結(jié)果

2.1 紫色桿菌素對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響

以不同濃度的紫色桿菌素作用HT29細(xì)胞一定時(shí)間，同時(shí)設(shè)置5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)比分析24、48、72 h紫色桿菌素對(duì)細(xì)胞活性的影響。圖1顯示紫色桿菌素對(duì)HT29細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。紫色桿菌素濃度為 5mg·L-1時(shí)，抑制率超過(guò) 50%；濃度為 10 mg·L-1及30 mg·L-1時(shí)，抑制效果更加明顯，抑制率達(dá)61.37%、70.23%。陽(yáng)性藥物對(duì)照組，5-Fu濃度為 5 mg·L-1時(shí)，其24、48、72 h的抑制率分別為16.5%、21.8%和34.24%。空白組的抑制率為1.938%。紫色桿菌素對(duì)HT29的抑制效果明顯優(yōu)于5-Fu。

圖1 紫色桿菌素對(duì)HT29細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effects of violacein on the inhibition rate against HT29

2.2 細(xì)胞掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

藥物作用時(shí)間、劑量以及所用細(xì)胞的種類(lèi)都會(huì)影響細(xì)胞的機(jī)構(gòu)變化。有研究報(bào)道，相比于Caco2細(xì)胞，HT29細(xì)胞對(duì)于紫色桿菌素的耐受力更大[18-19]。MTT結(jié)果表明，相比于同劑量的陽(yáng)性藥物5-Fu，紫色桿菌素對(duì)HT29的抑制作用更加明顯。在此基礎(chǔ)上，分別以0.1、1、10和30 mg·L-1不同劑量的紫色桿菌素作用于HT29細(xì)胞24 h，采用透射電鏡觀察紫色桿菌素對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。

對(duì)照組培養(yǎng)的HT29細(xì)胞染色質(zhì)均勻分布，有核仁，細(xì)胞膜完整，線粒體均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中。0.1 mg·L-1、1 mg·L-1劑量組的細(xì)胞出現(xiàn)線粒體空泡化現(xiàn)象及質(zhì)膜出泡現(xiàn)象。隨著劑量的增加，細(xì)胞變圓，胞漿濃縮。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量大小不等的空泡，泡內(nèi)容物的電子密度與基質(zhì)相似。細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊集、濃縮，呈斷裂狀。部分線粒體腫脹，吞噬體顆粒增多。10 mg·L-1劑量組的空泡化現(xiàn)象較多，質(zhì)膜出現(xiàn)破碎。30 mg·L-1劑量組出現(xiàn)細(xì)胞膜消失，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器形成碎片（圖2）。

2.3 差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)的角度研究蛋白質(zhì)的各種性質(zhì)，包括序列、表達(dá)水平、修飾狀態(tài)、亞細(xì)胞分布、活性結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而揭示基因的功能，最終解釋遺傳和環(huán)境是如何通過(guò)相互作用控制細(xì)胞的功能?；?MTT及透射電鏡下觀察結(jié)果，本研究采用紫色桿菌素低劑量（1 mg·L-1）、高劑量（30 mg·L-1）分別作用HT29細(xì)胞，并設(shè)定一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照處理（5-Fu），嘗試通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從系統(tǒng)生物學(xué)角度探索紫色桿菌素抑制癌細(xì)胞代謝通路及作用機(jī)制。

2.3.1 差異蛋白整體分析 所有串級(jí)譜圖通過(guò)搜索引擎進(jìn)行 NCBI.Human.protein-20130701人種屬數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。使用獲得置信度在0.95以上的蛋白結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)鑒定4 258個(gè)蛋白。本試驗(yàn)將各標(biāo)記組豐度差異大于 2.0（P＜0.05）作為差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異蛋白為757個(gè)。其中高劑量組處理的差異蛋白數(shù)492個(gè)，低劑量組處理的差異蛋白數(shù)112個(gè)，陽(yáng)性對(duì)照組的差異蛋白數(shù)336個(gè)（表2）。差異蛋白篩選情況及組分間蛋白質(zhì)分布（proteinpilot軟件計(jì)算）情況均顯示：高劑量Vio處理細(xì)胞比5-Fu處理出現(xiàn)的差異蛋白更多，且高劑量組比低劑量組的差異蛋白變化更顯著。

2.3.2 差異蛋白基因本體論（GO）分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的信息和注釋?zhuān)瑢?duì)鑒定得到的差異蛋白譜進(jìn)行GO分析（圖3—5、表3）。從蛋白生物學(xué)途徑（Process）、蛋白成分分布（Component）和蛋白功能（Function）3個(gè)方面進(jìn)行富集分析。對(duì)差異蛋白的生物學(xué)途徑（Process）富集分析（圖 3）表明，差異蛋白主要表現(xiàn)為下調(diào)，低劑量和高劑量紫色桿菌素差異蛋白富集情況僅有部分相同，紫色桿菌素劑量的高低對(duì)蛋白表達(dá)有顯著影響。

圖2 不同劑量紫色桿菌作用HT29超微結(jié)構(gòu)比較（8000×）Fig. 2 Comparison of cell ultrastructure treated by multiple dosage of violacein for 24 h

表2 差異蛋白篩選情況Table 2 Comparison of differential protein among three treatments

對(duì)差異蛋白的組分分布（Component）富集分析（圖 4）表明，紫色桿菌素作用于細(xì)胞的差異蛋白主要表現(xiàn)為下調(diào)，陽(yáng)性藥物組的差異蛋白主要位于胞內(nèi)細(xì)胞器及核酸上；紫色桿菌素組的差異蛋白主要位于在細(xì)胞質(zhì)上，其高劑量組和低劑量組的差異蛋白總體分布大致相同。

對(duì)差異蛋白的功能（Function）富集分析（圖5）表明，差異蛋白主要集中在結(jié)合功能方面，紫色桿菌素對(duì)具有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)表達(dá)有影響，低劑量的紫色桿菌素主要影響具有結(jié)合RNA功能的蛋白。

圖3 差異蛋白生物學(xué)途徑富集分析Fig. 3 Process classification of differential proteins

2.3.3 差異蛋白的信號(hào)通路（pathway）分析 代謝通路分析顯示差異蛋白在KEGG ORTHOLOGY共參與了50個(gè)代謝通路。屬于KEGG ORTHOLOGY的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)別中的 5個(gè)類(lèi)別。具體如下：參與代謝（metabolism）類(lèi)別的有24個(gè)代謝通路，參與人類(lèi)疾病（human diseases）的有7個(gè)代謝通路，參與有機(jī)體系統(tǒng)（organismal systems）類(lèi)別的有1個(gè)代謝通路，參與細(xì)胞過(guò)程（cellular processes）類(lèi)別的有6個(gè)代謝通路，參與遺傳信息處理（genetic information processing）類(lèi)別的有12個(gè)代謝通路，參與環(huán)境信息處理（environmental information processing）類(lèi)別的有0個(gè)代謝通路。

圖4 差異蛋白組分分布富集分析Fig. 4 Component classification of differential proteins

本研究的目的就是探索紫色桿菌素通過(guò)何種代謝途徑對(duì)HT29細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。因此，對(duì)代謝類(lèi)別的信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步分析。在所鑒定的757個(gè)差異蛋白中，共有165個(gè)差異表達(dá)蛋白參與代謝（metabolism）類(lèi)別中的24個(gè)代謝通路。分析顯示，多個(gè)蛋白可同時(shí)參與同一信號(hào)通路，同一蛋白也可對(duì)多條信號(hào)通路起作用。差異蛋白對(duì)其中的10條信號(hào)通路具有顯著影響（P＜0.05），具體為核糖體途徑、剪接體途徑、三羧酸循環(huán)途徑、糖異生途徑、亨廷頓氏病途徑、氨酰tRNA生物合成和RNA降解途徑等（表4）。除了亨廷頓氏病途徑（與疾病類(lèi)別有關(guān)），其余 9條皆屬于代謝類(lèi)（metabolism）途徑。

圖5 差異蛋白的分子功能富集分析Fig. 5 Functional classification of differential proteins

表3 差異蛋白富集分析（GO分析）Table 3 Gene ontology of significantly differential protein

表4 蛋白參與信號(hào)通路KEGG分析Table 4 KEGG analysis of proteins involved in signaling pathways

3 討論

前人研究顯示紫色桿菌素可引起很多腫瘤細(xì)胞系的凋亡[6,20-24]。針對(duì)紫色桿菌素作用于 Caco-2細(xì)胞和HT29細(xì)胞的研究顯示，紫色桿菌素可引起Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧簇，激活 Caspase-3，釋放細(xì)胞色素C、鈣到細(xì)胞質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由紫色桿菌素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧簇是導(dǎo)致線粒體膜崩潰的關(guān)鍵因子。研究還表明，紫色桿菌素不能提高HT29細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇水平。因此，研究者認(rèn)為紫色桿菌素對(duì)不同的細(xì)胞有不同的作用途徑[20-21]。本研究將紫色桿菌素作用于HT29細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照。5-Fu主要通過(guò)影響DNA的合成，干擾蛋白質(zhì)進(jìn)而達(dá)到抑癌的作用。當(dāng)抑制率為 50%時(shí)，紫色桿菌素的作用劑量?jī)H為5-Fu的1/6。但Hoechst33342/PI染色顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡沒(méi)有發(fā)生。透射電鏡下觀察均顯示，紫色桿菌素作用后的細(xì)胞呈現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)時(shí)間劑量效應(yīng)。隨著濃度增大，逐漸出現(xiàn)質(zhì)膜破碎、凹陷。當(dāng)濃度達(dá)到30 mg·L-1，細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)邊集效應(yīng)，細(xì)胞膜消失。這與前人的研究和假設(shè)相一致。本研究也認(rèn)為紫色桿菌素不是通過(guò)凋亡的途徑作用于HT29細(xì)胞，需要采用別的方法對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是一門(mén)以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平對(duì)疾病機(jī)理、細(xì)胞模式、功能聯(lián)系及基因調(diào)控等方面進(jìn)行探索的科學(xué)[25-27]。通過(guò)對(duì)疾病狀態(tài)和正常狀態(tài)的蛋白質(zhì)譜表達(dá)差異進(jìn)行比較和分析，開(kāi)發(fā)新的藥物作用靶點(diǎn)，探索和深入認(rèn)知其內(nèi)在機(jī)制。有研究利用二維電泳或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析外界脅迫條件下（如砷脅迫、金屬鐵離子脅迫、pH脅迫或饑餓脅迫）產(chǎn)紫色桿菌素的Chromobacterium violaceum菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)的變化[28-30]，發(fā)現(xiàn)菌體內(nèi)的差異蛋白參與了響應(yīng)氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)、脂肪代謝等途徑。外界脅迫條件可導(dǎo)致菌體內(nèi)與生物合成途徑、分子回收、能源生產(chǎn)有關(guān)的受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，但利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究紫色桿菌素如何作用于癌細(xì)胞的研究還鮮有報(bào)道。

本研究采用的是反相高效液相色譜（HP-RPLC）分離模式來(lái)分離蛋白質(zhì)。這在很大程度上克服了2DE的局限性，避免低豐度蛋白的丟失，其與質(zhì)譜的聯(lián)用是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究廣為采用的技術(shù)。相比于2DE，可更準(zhǔn)確、靈敏地鑒定出更多蛋白。

4 結(jié)論

紫色桿菌素對(duì) HT29細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。相比于陽(yáng)性藥物5-Fu，紫色桿菌素的抑制效果更明顯。在抑制率為50%時(shí)，紫色桿菌素的劑量?jī)H為5-Fu劑量的1/6。透射電鏡顯示，隨著Vio劑量增大，細(xì)胞內(nèi)部線粒體出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)，質(zhì)膜出泡；當(dāng)濃度為30 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞膜消失，染色質(zhì)邊集。利用 iTRAQ標(biāo)記不同處理組的蛋白，通過(guò)反向色譜進(jìn)行肽段分離，結(jié)合高分辨串聯(lián)質(zhì)譜分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、鑒定出 757個(gè)差異蛋白。KEGG分析顯示，差異蛋白顯著影響 10條信號(hào)通路，主要為核糖體循環(huán)途徑、三羧酸循環(huán)途徑和RNA降解途徑等。據(jù)此推測(cè)，紫色桿菌素通過(guò)影響細(xì)胞生命活動(dòng)中的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)而發(fā)揮抑制作用。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Antitumor Effect of Violacein Against HT29 by Comparative Proteomics

LIU Lu, LU Jing, WANG Ying, PANG XiaoYang, XU Man, ZHANG ShuWen, Lü JiaPing
(Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Food Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】The objective of this experiment is to investigate proteomic profile of HT29 treated with high-dosage-violacein and low-dosage-violacein, and to analyze its involved metabolic pathway and mechanism. 【Method】Cytotoxic activity of violacein was analyzed by MTT assay and observed by using transmission electron microscopy. After that, the total protein was extracted from the cells．To obtain relative abundance of peptides information, total proteins labeled with multiple iTRAQ stable isotopes were segregated and analyzed with RP-LC-MS/MS. The differential expression proteins were identified through NCBI. Human. protein database. The metabolic pathway was analyzed through Go analysis and KEGG analysis. 【Result】Violacein inhibited the growth of HT29 in dose-dependent and time-dependent manner. Compared with 5-Flu, 5 mg·L-1violacein resulted in 50% inhibition of HT29. Its dosage was one sixth of the dosage of 5-Fu. With the increasing violacein, vacuoles in the mitochondrion and membrane blebs were found under transmission electron micrograph. Violet pigment at 30 mg·L-1inducedmargination of nuclear chromatin and disappearance of cell membrane. Through quantitative proteomic analysis of these three cells, 4 258 proteins were identified with MS, 757 of which were differential expression proteins (fold change of protein expression≥2). Among these differential expression proteins, there were 492 proteins in cells treated with high dosage of violacein, 112 proteins in cells treated with low dosage of violacein, and 336 proteins in cells treated with 5-Fu. Analysis of enriched KEGG pathway showed that most of these differential expression proteins were involved in 50 signaling pathways, 10 of which were enriched significantly (P＜0.05), such as ribosome, citrate cycle and RNA degradation. 【Conclusion】The antitumor mechanism of violacein against colon cancer cells are mainly involved in transcription and translation in cell life cycle.

comparative proteomics; violacein; iTRAQTM; HT29; transmission electron microscopy

2016-08-24；接受日期：2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371763）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（S2016JC01）、國(guó)家留學(xué)基金委訪問(wèn)學(xué)者項(xiàng)目（留金發(fā)2013[3018]）

聯(lián)系方式：劉鷺，E-mail：13910666179@163.com。通信作者張書(shū)文，E-mail：zswmaster@163.com。通信作者呂加平，E-mail：lvjp586@vip.sina.com