家蠶表皮蛋白BmCPAP3-G的表達(dá)特征及其與幾丁質(zhì)的結(jié)合特性

張薇薇，董照明，張艷，張曉璐，張守亞，趙萍

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400716）

家蠶表皮蛋白BmCPAP3-G的表達(dá)特征及其與幾丁質(zhì)的結(jié)合特性

張薇薇，董照明，張艷，張曉璐，張守亞，趙萍

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400716）

【目的】探討家蠶（Bombyx mori）表皮蛋白BmCPAP3-G的表達(dá)特征及與幾丁質(zhì)的結(jié)合方式，為家蠶表皮蛋白的功能研究提供依據(jù)?！痉椒ā繎?yīng)用生物信息學(xué)方法分析家蠶CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的結(jié)構(gòu)域的序列特征；利用原核表達(dá)的方法表達(dá)BmCPAP3-G的融合蛋白，通過鎳柱親和層析技術(shù)純化可溶性蛋白，利用5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定正確后進(jìn)行多克隆抗體制備，并利用幾丁質(zhì)親和層析技術(shù)驗證BmCPAP3-G與幾丁質(zhì)的結(jié)合；利用半定量RT-PCR和Western blot方法對BmCPAP3-G的組織和時期表達(dá)情況進(jìn)行檢測；利用幾丁質(zhì)親和層析技術(shù)探討體外BmCPAP3-G的結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)結(jié)合能力強(qiáng)弱的關(guān)系?！窘Y(jié)果】BmCPAP3-G蛋白具有18個氨基酸組成的信號肽，分子量為27 kD，等電點為4.82，位于第15號染色體上，由3個相同的ChtBD2結(jié)構(gòu)域組成，并且其結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸和芳香族氨基酸的同源性較高；對BmCPAP3-G進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并利用鎳柱親和層析技術(shù)純化到了較純的可溶性蛋白，經(jīng)5800 MALDI-TOF/TOF鑒定正確后制備了其多克隆抗體，通過幾丁質(zhì)親和層析技術(shù)驗證了BmCPAP3-G能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合；利用半定量RT-PCR和Western blot的方法對BmCPAP3-G的組織和時期表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的結(jié)果一致，BmCPAP3-G在頭和表皮中的表達(dá)量較高，在中腸、生殖腺和絲腺中的表達(dá)量較低，從表皮和絲腺的時期表達(dá)情況分析BmCPAP3-G在4齡眠期的表達(dá)量最高，隨著5齡期的進(jìn)行表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢；為了探討B(tài)mCPAP3-G結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)結(jié)合的關(guān)系，對該蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá)及鎳柱親和層析純化，成功純化了有活性的結(jié)構(gòu)域3、結(jié)構(gòu)域1-2、結(jié)構(gòu)域2-3，將這3個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行幾丁質(zhì)親和層析驗證其與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)它們均能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，但是結(jié)合能力有差異，結(jié)構(gòu)域3相比于結(jié)構(gòu)域1-2和結(jié)構(gòu)域2-3的結(jié)合能力要弱，即兩個結(jié)構(gòu)域比單個結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力強(qiáng)?！窘Y(jié)論】BmCPAP3-G為典型的CPAP家族的表皮蛋白，可能參與幾丁質(zhì)層在眠期的降解再形成過程。BmCPAP3-G單個ChtBD2結(jié)構(gòu)域就能夠與幾丁質(zhì)結(jié)合，但多個結(jié)構(gòu)域的同時存在加強(qiáng)了其與幾丁質(zhì)的結(jié)合能力。

家蠶；表皮蛋白；CPAP；表達(dá)譜；幾丁質(zhì)結(jié)合

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）作為鱗翅目昆蟲的模式生物，因能夠吐絲結(jié)繭而具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價值。家蠶同其他昆蟲一樣，體壁由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，體內(nèi)沒有內(nèi)骨骼的支持。幾丁質(zhì)在自然界中廣泛存在于低等植物、菌類、藻類、昆蟲、甲殼類動物中，是除纖維素以外的又一重要多糖，其分子結(jié)構(gòu)是由D-N-乙酰氨基葡萄糖通過重復(fù)的β (1,4) 糖苷鍵聚合而形成直鏈形的大分子。在昆蟲體內(nèi)，幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合形成一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)用來支撐和保護(hù)蟲體[1-2]。目前報道的能與幾丁質(zhì)結(jié)合的蛋白主要是表皮蛋白。家蠶的表皮蛋白基因約占總基因數(shù)的1.5%[3]，而表皮蛋白中的CPR家族研究報道最多，而CPAP家族的表皮蛋白是除 CPR家族以外的最大的一類表皮蛋白，因此，對CPAP家族表皮蛋白的功能及其幾丁質(zhì)結(jié)合的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在昆蟲體內(nèi)，幾丁質(zhì)能夠與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮不同的功能。目前已經(jīng)報道的能與幾丁質(zhì)結(jié)合的蛋白主要包括表皮蛋白、幾丁質(zhì)酶、30K蛋白、ATP合成酶等[4]，其中，表皮蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合的強(qiáng)度最高，被研究的較為廣泛。關(guān)于家蠶表皮蛋白的研究主要集中于表皮、圍食膜和絲腺。研究者對家蠶前部絲腺進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析，分別鑒定到了33和53個表皮蛋白[5-6]；WANG等[7]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在家蠶吐絲器中鑒定到了106個表皮蛋白；ZHONG等[8]通過Shotgun技術(shù)對家蠶圍食膜蛋白進(jìn)行鑒定，鑒定到有2個表皮蛋白；FU等[9]對家蠶的氣管和鱗毛進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在氣管中鑒定到21個表皮蛋白，鱗毛中有7個表皮蛋白，這些表皮蛋白具有一定的組織特異性；SHI等[10]通過Shotgun技術(shù)對不同時期的翅原基進(jìn)行蛋白鑒定，發(fā)現(xiàn)在不同時期翅原基的表皮蛋白存在差異，有些蛋白在家蠶吐絲后才會轉(zhuǎn)錄，其中 RR-2類蛋白所占的比例最大；DONG等[11]通過幾丁質(zhì)親和層析及LC-MS/MS聯(lián)用，在家蠶表皮中鑒定到了103個表皮蛋白，約占家蠶總表皮蛋白的49%。表皮蛋白的種類很多，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的特點可以將其分為以下幾類：CPR家族、CPT家族、CPF&CPFL家族、CPLCA家族、CPLCG家族、CPLCW家族、CPLCP家族、CPAP（cuticular proteins analogous to peritrophins）家族等[3,12-17]。CPR家族的表皮蛋白分布最廣、數(shù)量最多，也是研究最為廣泛的一類，由Rebers和Riddiford最先發(fā)現(xiàn)其保守序列并命名的，因此其保守序列又被稱為 R&R保守基序，隨后，研究者不斷對其進(jìn)行擴(kuò)展，將R&R保守基序分為3類R&R-1、R&R-2、R&R-3[18-22]。CPAP家族的表皮蛋白是僅次于 CPR家族的第二大類表皮蛋白[11]，CPAP又被稱為Gasp-Obstructor家族，該家族的蛋白具有1個或3個ChtBD2幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域[13]，其保守的結(jié)構(gòu)域為CX11-24CX5CX9-14CX12-16CX6-8C，除了在昆蟲中發(fā)現(xiàn)了這類表皮蛋白外，在低等生物線蟲中也存在這個家族的表皮蛋白[23]，該家族的表皮蛋白根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及組織特異性可以分為 3類：CPAP1（含有1個ChtBD2結(jié)構(gòu)域）、CPAP3（含有3個ChtBD2結(jié)構(gòu)域）、PMP（只在圍食膜特異表達(dá)的CPAP家族表皮蛋白），DONG等[11]鑒定到表皮中有8個CPAP家族的表皮蛋白能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，其中包括 3個 CPAP1類和 5個CPAP3類的蛋白。有研究者通過對CPR家族、CPT家族的部分表皮蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些表皮蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合均離不開表皮蛋白的β折疊結(jié)構(gòu)[24-28]。然而，對不同的表皮蛋白家族是如何與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合的研究很少，只有關(guān)于 CPR家族中的 R&R-2結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白的研究。【本研究切入點】CPAP家族的表皮蛋白作為第二大類表皮蛋白，筆者實驗室已對家蠶CPAP家族的表皮蛋白進(jìn)行了鑒定[11]，關(guān)于該類蛋白家族的功能及結(jié)合幾丁質(zhì)的機(jī)理未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在家蠶絲腺中克隆表達(dá)CPAP家族的CPAP3類表皮蛋白BmCPAP3-G，對其進(jìn)行原核表達(dá)和抗體制備，同時對該蛋白的表達(dá)特征進(jìn)行分析。對該蛋白進(jìn)行生物信息分析，表達(dá)其單個的和成對的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步探索其結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)結(jié)合的關(guān)系。

1 材料與方法

試驗于2014年9月至2016年4月在西南大學(xué)完成。

1.1 材料與試劑

選取家蠶大造作為試驗材料，由重慶市西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室家蠶基因資源庫提供。幼蟲在（25±1）℃、相對濕度60%、自然光照條件下用桑葉進(jìn)行飼喂。試驗材料為4齡第3天至上蔟第3天的表皮和絲腺（小蠶期為眠和起的材料，5齡后為隔天取材），材料于-80℃冰箱保存；取幼蟲5齡第5天的頭部、表皮、中腸、馬氏管、脂肪體、生殖腺、前部絲腺、中部絲腺前區(qū)、中部絲腺中區(qū)、中部絲腺后區(qū)和后部絲腺，并用液氮迅速冷凍置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

宿主菌大腸桿菌Trans1 T1和Transetta (DE3)購自北京全式金公司；pMD19-T-simple vector克隆載體購自TaKaRa公司；pET28a表達(dá)載體為筆者實驗室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG、Ampicilline、Kanamycin購自Promega公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他未標(biāo)明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 BmCPAP3-G的生物信息學(xué)分析

基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫 SilkDB（http://silkworm. swu.edu.cn/silkdb/）下載的BmCPAP3-G（注釋基因編號 BGIBMGA007677）的核苷酸和氨基酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，通過SMART網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽及結(jié)構(gòu)域，BmCPAP3-G具有3個相同的結(jié)構(gòu)域，在ExPASy網(wǎng)址上預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量和等電點。利用同源比對軟件 Clustalx和GeneDoc對這3個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源比對，分別用domain_1、domain_2、domain_3、domain_1-2、domain_2-3表示BmCPAP3-G的第1個結(jié)構(gòu)域、第2個結(jié)構(gòu)域、第 3個結(jié)構(gòu)域、前兩個結(jié)構(gòu)域、后兩個結(jié)構(gòu)域。

本研究中涉及到的引物包括家蠶持家基因Bmactin3、BmCPAP3-G及其各個結(jié)構(gòu)域，引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.3 BmCPAP3-G的克隆及BmCPAP3-G蛋白的原核表達(dá)及抗體制備

1.3.1 BmCPAP3-G的克隆 利用總RNA提取試劑盒（Omega公司產(chǎn)品），提取家蠶大造3齡第5天前部絲腺cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s、58℃退火40 s、72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增完成用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離、按照Axygen公司的膠回收試劑盒方法回收目的片段，將片段連接到pMD19-T-simple載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans T1菌株，挑選單克隆，并進(jìn)行菌液PCR檢測、雙酶切鑒定和測序驗證。

1.3.2 BmCPAP3-G蛋白的原核表達(dá) 將測序正確的質(zhì)粒命名為BmCPAP3-G-pMD19-T-simple，將pET28a質(zhì)粒載體與 BmCPAP3-G-pMD19-T-simple重組質(zhì)粒用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，構(gòu)建BmCPAP3-G-pET28a重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌液 PCR、雙酶切驗證后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Transetta (DE3)菌株，同時轉(zhuǎn)化pET28a質(zhì)粒。用終濃度為0.1 mmol·L-1的IPTG于37℃和16℃分別誘導(dǎo)表達(dá)4 h和20 h，收集誘導(dǎo)后的菌體，用結(jié)合緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，0.2% TritonX-100，pH 8.0）重懸，超聲破碎，離心，分別收集菌體沉淀和上清，再用結(jié)合緩沖液重懸沉淀，用12% SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。以蛋白表達(dá)量比較高且為可溶狀態(tài)的表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。利用鎳柱親和層析的方法對體外表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，分別用20、50、100、200、500、1 000 mmol·L-1咪唑梯度洗脫，SDS-PAGE檢測純化后的效果，取目的蛋白較純的洗脫液進(jìn)行透析，將緩沖液置換為 PBS，分別用SDS-PAGE電泳和Bradford定量法檢測蛋白質(zhì)的純度及濃度。

1.3.3 MALDI-TOF/TOF鑒定及多克隆抗體制備 從檢測膠上挖取目的蛋白點，通過清洗、DTT及IAA處理，胰蛋白酶酶解成肽段后冷凍干燥，用 ZipTipC18脫鹽。上樣檢測前將肽段溶解在50%乙腈、0.1% TFA的溶液中，將樣品與等體積的CHCA基質(zhì)混勻，上機(jī)進(jìn)行鑒定。

鑒定為目的蛋白后將純化好的樣品送至南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體。

1.4 BmCPAP3-G的表達(dá)特征分析

1.4.1 半定量RT-PCR檢測BmCPAP3-G的表達(dá)情況提取家蠶5齡第5天各組織及4齡第3天到上蔟第3天的絲腺、表皮的總 RNA，合成 cDNA。以 1.2設(shè)計的引物及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選擇家蠶持家基因Bmactin3為內(nèi)參基因，反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，53℃退火35 s，72℃延伸40 s，共25個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

1.4.2 Western blot檢測BmCPAP3-G蛋白的表達(dá)情況 提取家蠶5齡第5天各組織及4齡第3天到上蔟第3天的絲腺、表皮的總蛋白，利用Western blot檢測BmCPAP3-G蛋白的表達(dá)情況。Western blot采用半干法轉(zhuǎn)印，在電流1.3 A，電壓25 V條件下轉(zhuǎn)膜15 min；用含有5%脫脂奶粉的TBST（150 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，0.05% Tween 20）將膜封閉1 h；用制備好的BmCPAP3-G多克隆兔抗體按照1﹕20 000比例的稀釋液孵育2 h，內(nèi)參為α-tubulin抗體；TBST清洗膜后以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG按照1﹕40 000稀釋孵育2 h；再用TBST緩沖液清洗膜，最后用ECL顯色液顯色，置于CLINX化學(xué)曝光儀觀察掃描顯色結(jié)果。

1.5 BmCPAP3-G蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合方式

按照 1.2中表達(dá)重組蛋白的方法原核表達(dá)BmCPAP3-G的 domain_1、domain_2、domain_3、domain_1-2、domain_2-3蛋白，并進(jìn)行純化。用結(jié)合緩沖液（20 mmol·L-1HEPES，15 mmol·L-1NaCl，pH 7.4）平衡幾丁質(zhì)層析柱，將純化好的蛋白與等體積的 2×結(jié)合緩沖液（40 mmol·L-1HEPES，30 mmol·L-1NaCl，pH 7.4）混合后與幾丁質(zhì)進(jìn)行室溫中等速度孵育 2 h，用 10倍體積的漂洗緩沖液（40 mmol·L-1HEPES，150 mmol·L-1NaCl，pH 7.4）漂洗未結(jié)合的蛋白，收集漂洗液，加入 2倍體積的 8 mol·L-1尿素室溫中等速度孵育1 h后收集洗脫液，配制12%的SDS-PAGE膠，電泳和Western blot檢測各收集組分。

2 結(jié)果

2.1 BmCPAP3-G的克隆、原核表達(dá)及抗體制備

通過對BmCPAP3-G進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有18個氨基酸組成的信號肽，位于第15號染色體上，含有3個相同的ChtBD2（SMART accession number：SM00494）結(jié)構(gòu)域，對這3個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了同源性比對，發(fā)現(xiàn)其同源性比較高，特別是半胱氨酸和芳香族氨基酸（圖1-A），對家蠶表皮中已經(jīng)報道過的4個CPAP家族的表皮蛋白也進(jìn)行了同源性比對，發(fā)現(xiàn)在不同的表皮蛋白中，半胱氨酸及芳香族氨基酸均比較保守（圖1-B）。

圖1 BmCPAP3-G結(jié)構(gòu)域及CPAP3家族表皮蛋白的序列比對Fig.1 Sequence alignment of three BmCPAP3-G domains and the CPAP family cuticle proteins

利用設(shè)計的原核表達(dá)引物（表1），以家蠶幼蟲5齡第5天的前部絲腺cDNA為模板進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a- BmCPAP3-G進(jìn)行原核表達(dá)。圖2為在0.1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)作用下不同條件的表達(dá)情況，在16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h和37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h下轉(zhuǎn)入pET28a-BmCPAP3-G重組載體的菌株在30 kD附近表達(dá)有特異條帶，與目的蛋白預(yù)測的分子量大小一致，說明BmCPAP3-G重組蛋白獲得了表達(dá)，且為可溶性表達(dá)，在16℃條件下蛋白表達(dá)量較高。

圖2 重組蛋白的電泳檢測Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

隨后，利用該條件大量地誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并進(jìn)行鎳柱親和層析，通過20、50、100、200、500、1 000 mmol·L-1咪唑濃度梯度進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn) BmCPAP3-G重組蛋白在200和500 mmol·L-1咪唑濃度下被大量洗脫下來（圖 3-A）。鎳親和層析柱純化后的重組蛋白經(jīng)過SDS-PAGE膠檢測后條帶比較單一，因此，通過透析將緩沖液置換為PBS緩沖液后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)溶液置換后的目的蛋白條帶仍然是單一的（圖3-B）。

圖3 BmCPAP3-G重組蛋白的純化Fig. 3 Purification of BmCPAP3-G recombinant protein

挖取透析后BmCPAP3-G重組蛋白的電泳檢測條帶，利用5800 MALDI-TOF/TOF進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過搜庫比對后發(fā)現(xiàn)挖取的膠塊在 SilkDB數(shù)據(jù)庫中與BGIBMGA007677相匹配，而BGIBMGA007677即為DONG等[11]報道的BmCPAP3-G在家蠶數(shù)據(jù)庫的基因編號，表明表達(dá)的重組蛋白確實是家蠶表皮蛋白BmCPAP3-G。表2為質(zhì)譜鑒定到的特異肽段。用純化的重組蛋白BmCPAP3-G免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。最終制備了效價較高的多克隆抗體，可用于后續(xù)的試驗。

表2 BmCPAP3-G重組蛋白質(zhì)譜鑒定的特異肽段Table 2 The unique peptides of the BmCPAP3-G recombinant protein

2.2 BmCPAP3-G的表達(dá)特征分析

2.2.1 BmCPAP3-G表達(dá)特征 以家蠶幼蟲5齡第5天的各組織 cDNA為模板，用設(shè)計的表達(dá)譜引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳檢測BmCPAP3-G的表達(dá)情況。結(jié)果顯示BmCPAP3-G在頭、表皮、生殖腺中高量表達(dá)，在中腸、脂肪體和絲腺中有少量表達(dá)（圖 4-A、4-B）。以家蠶4齡眠期到上蔟時期的絲腺和表皮cDNA為模板進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示BmCPAP3-G在絲腺的眠期和起蠶期的表達(dá)量比較高，其余時期均較低（圖4-C），BmCPAP3-G在表皮中隨著時間的增長表達(dá)量越來越低。

2.2.2 BmCPAP3-G蛋白的檢測 為了進(jìn)一步驗證BmCPAP3-G蛋白的表達(dá)情況，同樣選取了頭、表皮、中腸、絲腺等組織及從4齡第3天到上蔟期的表皮和絲腺，用BmCPAP3-G的多克隆抗體進(jìn)行了Western blot檢測，結(jié)果顯示 5齡第 5天時，BmCPAP3-G在頭和表皮中有高量表達(dá)，在絲腺中的表達(dá)量很低；從不同時期的絲腺來看BmCPAP3-G在4齡眠期表達(dá)量最高，其余時期表達(dá)量均比較低，從不同時期的表皮來看，該蛋白隨著表皮的發(fā)育表達(dá)量越來越低，這與之前的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果是一致的（圖5）。

2.3 BmCPAP3-G蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合方式

通過原核表達(dá)獲得了具有活性的BmCPAP3-G蛋白，通過幾丁質(zhì)親和層析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合（圖6）。

為了探索BmCPAP3-G與幾丁質(zhì)的結(jié)合方式，對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，從而探索結(jié)構(gòu)域?qū)τ趲锥≠|(zhì)的結(jié)合的影響。分別設(shè)計了domain_1、domain_2、domain_3、domain_1-2、domain_2-3的原核表達(dá)引物，以家蠶幼蟲5齡第5天的前部絲腺cDNA為模板進(jìn)行BmCPAP3-G各結(jié)構(gòu)域的PCR擴(kuò)增和原核表達(dá)，獲得了在上清中表達(dá)的domain_3、domain_1-2、domain_2-3，并進(jìn)行了純化，domain_1、domain_2沒有表達(dá)成功（圖7）。

圖4 BmCPAP3-G的表達(dá)譜分析Fig. 4 Expression pattern of BmCPAP3-G

圖5 BmCPAP3-G蛋白的檢測Fig. 5 Detection of the BmCPAP3-G protein

圖6 重組蛋白BmCPAP3-G的幾丁質(zhì)結(jié)合驗證Fig. 6 Chitin binding assays of the recombinant protein BmCPAP3-G

圖7 各個結(jié)構(gòu)域重組蛋白原核表達(dá)純化Fig. 7 The expression and purification of recombinant protein domains

圖8 結(jié)構(gòu)域重組蛋白的幾丁質(zhì)結(jié)合Fig.8 Binding assays of the recombinant protein of domains

通過原核表達(dá)的方法表達(dá)出了有活性的domain_3、domain_1-2、domain_2-3，將這些重組蛋白分別與幾丁質(zhì)進(jìn)行孵育，探索其單個的結(jié)構(gòu)域是否能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，從而對CPAP家族的表達(dá)蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合的方式進(jìn)行探索。如圖8所示，單個的結(jié)構(gòu)域3也可以與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，但是結(jié)合能力較弱，用考馬斯亮藍(lán)染色的方法檢測均無法看出，通過Western blot的方法可看到洗脫液中有條帶，而兩個結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的重組蛋白domain_1-2、domain_2 -3均能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，并且其結(jié)合能力較domain_3強(qiáng)。

3 討論

表皮蛋白是昆蟲體內(nèi)龐大的一類蛋白家族，在家蠶中亦是如此，并且其中將近一半的表皮蛋白能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。在這些表皮蛋白中，最大的一類為CPR家族，CPR家族的表皮蛋白分布最廣、數(shù)量也最多，由REBERS等最先發(fā)現(xiàn)其保守序列并命名的[20]；其次是CPAP家族，該類家族是在家蠶表皮中排行第二的表皮蛋白家族，但是關(guān)于 CPAP家族的表皮蛋白的研究很少。BmCPAP3-G是在家蠶表皮中報道的一個能夠與幾丁質(zhì)結(jié)合的表皮蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白不僅在表皮中存在，在絲腺中也存在，從其時期表達(dá)結(jié)果來看，BmCPAP3-G在眠期和起蠶期表達(dá)量最高，在食桑期的表達(dá)量迅速消失。而在前期有研究者對絲腺中特異表達(dá)的R&R-2結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白進(jìn)行了時期表達(dá)譜檢測，發(fā)現(xiàn)在5齡期的各個時間點表達(dá)量均很高，推測該蛋白能夠保護(hù)絲腺細(xì)胞，防止剪切力及外力對絲腺細(xì)胞進(jìn)行破壞[29]，因此，推測CPAP家族的表皮蛋白與CPR家族的表皮蛋白在絲腺中發(fā)揮的功能不一致，CPAP家族的表皮蛋白可能并不像R&R結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白那樣構(gòu)成幾丁質(zhì)層，而只是參與幾丁質(zhì)層在眠期降解再形成的過程。

目前已經(jīng)報道的能夠與幾丁質(zhì)結(jié)合的有CPR家族、CPAP家族、CPT家族及Chitin_bind 3結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白家族[4,11,29-31]。那么，它們是如何與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合的呢？有報道 R&R-2結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合過程中芳香族氨基酸起到了至關(guān)重要的作用[32]。筆者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) CPAP家族的3個ChtBD2結(jié)構(gòu)域中保守的氨基酸也是芳香族氨基酸，暗示了芳香族氨基酸確實在與幾丁質(zhì)結(jié)合過程中起到了關(guān)鍵的作用。下一步可以對其單個結(jié)構(gòu)域中的芳香族氨基酸進(jìn)行突變，看是否還能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而探究其與幾丁質(zhì)是如何結(jié)合的。

為了檢測擁有3個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐mCPAP3-G蛋白的意義，分別對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)出了有活性的 domain_3、domain_1-2和domain_2-3重組蛋白，并將原核表達(dá)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行幾丁質(zhì)親和層析驗證，發(fā)現(xiàn)其均能夠與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，并且結(jié)合幾丁質(zhì)的能力有差異。單個的結(jié)構(gòu)域就可以與幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，兩個結(jié)構(gòu)域比單個結(jié)構(gòu)域結(jié)合幾丁質(zhì)的結(jié)合能力要強(qiáng)。

4 結(jié)論

BmCPAP3-G具有信號肽，分子量為27 kD，等電點為4.82，由3個相同的ChtBD2結(jié)構(gòu)域組成。通過表達(dá)有活性的重組蛋白BmCPAP3-G并制備其多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)該蛋白在眠期和起蠶期表達(dá)量高，推測其在絲腺內(nèi)膜的更新過程中發(fā)揮著重要作用。對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá)，獲得了重組蛋白 domain_3、domain_1-2和domain_2-3，發(fā)現(xiàn)BmCPAP3-G與幾丁質(zhì)的結(jié)合由單個的結(jié)構(gòu)域即可完成，結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)能夠增強(qiáng)其結(jié)合能力。

[1] 李大琪, 杜建中, 張建琴, 郝耀山, 劉曉健, 王亦學(xué), 馬恩波, 張建珍, 孫毅. 東亞飛蝗幾丁質(zhì)酶家族基因的表達(dá)特性與功能研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(3): 485-492.

LI D Q, DU J Z, ZHANG J Q, HAO Y S, LIU X J, WANG Y X, MA E B, ZHANG J Z, SUN Y. Study on expression characteristics and functions of chitinase family genes from Locusta migratoria manilensis (Meyen). Scientia Agricultura Sinica, 2011,44(3): 485-492. (in Chinese)

[2] 張建珍. 昆蟲幾丁質(zhì)代謝與植物保護(hù). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(7): 1301-1302.

ZHANG J Z. Insect chitin metabolism and plant protection. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(7): 1301-1302. (in Chinese)

[3] FUTAHASHI R, OKAMOTO S, KAWASAKI H, ZHONG Y S, IWANAGA M, MITA K, FUJIWARA H. Genome-wide identification of cuticular protein genes in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2008, 38(12): 1138-1146.

[4] TANG L, LIANG J, ZHAN Z, XIANG Z, HE N. Identification of the chitin-binding proteins from the larval proteins of silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40: 228-234.

[5] YI Q, ZHAO P, WANG X, ZOU Y, ZHONG X, WANG C, XIANG Z, XIA Q Y. Shotgun proteomic analysis of the Bombyx mori anterior silkgland: An insight into the biosynthetic fiber spinning process. Proteomics, 2013, 13: 2657-2663.

[6] CHANG H, CHENG T, WU Y, HU W, LONG R, LIU C, ZHAO P, XIA Q. Transcriptomic analysis of the anterior silk gland in the domestic silkworm (Bombyx mori) - insight into the mechanism of silk formation and spinning. PLoS ONE, 2015, 10(9): e139424.

[7] WANG X, LI Y, PENG L, CHEN H, XIA Q, ZHAO P. Comparative transcriptome analysis of Bombyx mori spinnerets and Filippi’s glands suggests their role in silk fiber formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2016, 68: 89-99.

[8] ZHONG X, ZHANG L, ZOU Y, YI Q, ZHAO P, XIA Q, XIANG Z. Shotgun analysis on the peritrophic membrane of the silkworm Bombyx mori. BMB Reports, 2012, 45(11): 665-670.

[9] FU Q, LI P, XU Y, ZHANG S, JIA L, ZHA X, XIANG Z, HE N. Proteomic analysis of larval integument, trachea and adult scale from the silkworm, Bombyx mori. Proteomics, 2011, 11: 3761-3767.

[10] SHI X F, BIN H, LI Y N, YI Y Z, LI X M, SHEN X J, ZHANG Z F. Proteomic analysis of the phenotype of the scaleless wings mutant in the silkworm, Bombyx mori. Journal of Proteomics, 2013, 78: 15-25.

[11] DONG Z, ZHANG W, ZHANG Y, ZHANG X, ZHAO P, XIA Q. Identification and characterization of novel chitin-binding proteins from the larval cuticle of silkworm, Bombyx mori. Journal of Proteome Research, 2016, 15(5): 1435-1445.

[12] LIANG J, ZHANG L, XIANG Z, HE N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics, 2010, 11: 173.

[13] WILLIS J H. Structural cuticular proteins from arthropods: annotation, nomenclature, and sequence characteristics in the genomics era. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40(3): 189-204.

[14] CORNMAN R S, WILLIS J H. Annotation and analysis of lowcomplexity protein families of Anopheles gambiae that are associated with cuticle. Insect Molecular Biology, 2009, 18(5): 607-622.

[15] TOGAWA T, AUGUSTINE D W, EMMONS A C, WILLIS J H. CPF and CPFL, two related gene families encoding cuticular proteins of Anopheles gambiae and other insects. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 37: 675-688.

[16] VANNINI L, BOWEN J H, REED T W, WILLIS J H. The CPCFC cuticular protein family: Anatomical and cuticular locations in Anopheles gambiae and distribution throughout Pancrustacea. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 65: 57-67.

[17] SUZUKI Y, MATSUOKA T, IIMURA Y, FUJIWARA H. Ecdysteroid-dependent expression of a novel cuticle protein gene BMCPG1 in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32: 599-607.

[18] ANDERSEN S O. Studies on proteins in post-ecdysial nymphal cuticle of locust, Locusta migratoria, and cockroach, Blaberus craniifer. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 30: 569-577.

[19] ANDERSEN S O. Amino acid sequence studies on endocuticular proteins from the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1998, 28: 421-434.

[20] REBERS J E, RIDDIFORD L M. Structure and expression of a Manduca sexta larval cuticle gene homologous to Drosophila cuticle genes. Journal of Molecular Biology, 1988, 203: 411-423.

[21] 梁九波, 劉碧朗, 占智高, 何寧佳. 家蠶表皮蛋白基因的生物信息學(xué)分析. 蠶業(yè)科學(xué), 2008, 34(3): 405-416.

LIANG J B, LIU B L, ZHAN Z G, HE N J. Bioinformation analysis of cuticular protein genes in the silkworm, Bombyx mori. Sciences of Sericulture, 2008, 34(3): 405-416. (in Chinese)

[22] 劉清明, 苑園園, 林健榮, 鐘楊生. 昆蟲表皮蛋白及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究進(jìn)展. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報, 2010, 47(2): 247-255.

LIU Q M, YUAN Y Y, LIN J R, ZHONG Y S. Advance of researches on insect cuticular proteins and the regulation mechanism of their gene expression. Chinese Bulletin of Entomology, 2010, 47(2): 247-255. (in Chinese)

[23] JASRAPURIA S, ARAKANE Y, OSMAN G, KRAMER K J, BEEMAN R W, MUTHUKRISHNAN S. Genes encoding proteins with peritrophin A-type chitin-binding domains in Tribolium castaneum are grouped into three distinct families based on phylogeny, expression and function. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40: 214-227.

[24] ANDERSEN S O, HOJRUP P, ROEPSTORFF P. Insect cuticular proteins. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 25(2): 153-176.

[25] FRAENKEL G, RUDALL K M. The structure of insect cuticles. Proceedings of the Royal Society of Medicine, 1947, 134(874): 111-143.

[26] GUAN X, MIDDLEBROOKS B W, ALEXANDER S, WASSERMAN S A. Mutation of TweedleD, a member of an unconventional cuticle protein family, alters body shape in Drosophila. Proceedings of theNational Academic of Science of the United States of America, 2006, 103(45): 16794-16799.

[27] ICONOMIDOU V A, CHRYSSIKOS G D, GIONIS V, WILLIS J H, HAMODRAKAS S J. “Soft”-cuticle protein secondary structure as revealed by FT-Raman, ATR FT-IR and CD spectroscopy. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 31: 877-885.

[28] ICONOMIDOU V A, WILLIS J H, HAMODRAKAS S J. Is beta-pleated sheet the molecular conformation which dictates formation of helicoidal cuticle? Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 29: 285-292.

[29] 謝康, 王鑫, 陳慧芳, 李懿, 宋倩茹, 趙萍. 家蠶前部絲腺特異表皮蛋白Bm11721的鑒定及表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2016, 32(1): 64-73.

XIE K, WANG X, CHEN H F, LI Y, SONG Q R, ZHAO P. Identification and expression patterns of anterior silk gland specific cuticle protein Bm11721 in the silkworm (Bombyx mori). Chinese Journal of Biotechnology, 2016, 32(1): 64-73. (in Chinese)

[30] VAAJE-KOLSTAD G, HOUSTON D R, RIEMEN A H, EIJSINK V G, VAN AALTEN D M. Crystal structure and binding properties of the Serratia marcescens chitin-binding protein CBP21. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(12): 11313-11319.

[31] WIJFFELS G, EISEMANN C, RIDING G, PEARSON R, JONES A, WILLADSEN P, TELLAM R. A novel family of chitin-binding proteins from insect type 2 peritrophic matrix. cDNA sequences, chitin binding activity, and cellular localization. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(18): 15527-15536.

[32] DENG H M, LI Y, ZHANG J L, LIU L, FENG Q L. Analysis of expression and chitin-binding activity of the wing disc cuticle protein BmWCP4 in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science, 2016, 23(6): 782-790.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Expression Pattern and Chitin-Binding Mode Analyses of Cuticle Protein BmCPAP3-G in the Silkworm (Bombyx mori)

ZHANG WeiWei, DONG ZhaoMing, ZHANG Yan, ZHANG XiaoLu, ZHANG ShouYa, ZHAO Ping
(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to explore the expression pattern of BmCPAP3-G and the binding mode of BmCPAP3-G with chitin, which will lay a foundation for the research of the cuticle proteins of silkworm (Bombyx mori).【Method】The sequence features of CPAP motif cuticular proteins and the conserved domains of BmCPAP3-G were analyzed by bioinformatics methods. The recombinant proteins were expressed by prokaryotic expression and purified by Ni affinity chromatography. The protein was identified by 5800 MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, and then was used to prepare the polyclonal antibodies. Thechitin-binding activity of BmCPAP3-G was verified by chitin affinity chromatography. The spatial and temporal expression patterns of BmCPAP3-G were analyzed by semi-quantitative RT-PCR and western blot. The binding mode of the domains of BmCPAP3-G with chitin was detected by using chitin affinity chromatography. 【Result】The BmCPAP3-G protein has a signal peptide consisting of 18 amino acids, the molecular weight of 27 kD and the isoelectric point of 4.82, the encoding gene located on the chromosome No.15. BmCPAP3-G protein has three ChtBD2 domains, in which cysteine and aromatic amino acid showed very high homology. The BmCPAP3-G was cloned, expressed and the active recombinant protein was purified. After being identified by mass spectrometer, the polyclonal antibody against BmCPAP3-G was prepared. The BmCPAP3-G was found to bind chitin by using chitin affinity chromatography. The spatial and temporal expression patterns of BmCPAP3-G were analyzed by semi-quantitative RT-PCR and western blot, revealing similar results at the transcriptional and protein levels. BmCPAP3-G was expressed highly in the head and cuticle, and minimally in the midgut, gonad, and silk gland. In the silk gland, BmCPAP3-G had a high expression level in the fourth molting and its expression decreased in the cuticle and silk gland as the fifth instar goes on. Active recombinant proteins domain_3, domain_1-2, domain_2-3 were successfully expressed and it was found that all the domain_3, domain_1-2, and domain_2-3 could bind to chitin in vitro, but their binding abilities were different. Individual domains could bind with chitin, and two domains showed stronger chitin binding capacity than the single domain. 【Conclusion】BmCPAP3-G is a typical cuticular protein of CPAP family and may be involved in the degradation and formation process of chitin layer in the silk gland during molting stage. BmCPAP3-G could bind with chitin by a single ChtBD2 domain, and multiple domains in which makes it have stronger chitin binding capacity.

silkworm (Bombyx mori); cuticular proteins; CPAP; expression pattern; chitin-binding

2016-11-08；接受日期：2017-01-22

國家自然科學(xué)基金（31530071，31472154）、西南大學(xué)博士基金項目（SWU116076）

聯(lián)系方式：張薇薇，E-mail：18883352070@163.com。通信作者趙萍，Tel：023-68250885；E-mail：zhaop@swu.edu.cn