HCV感染男性吸毒者血漿CCL19及CCL21濃度變化分析

李紅霞 魏泉德 周 毅 李曉鳳

(珠海市疾病預(yù)防控制中心，珠海519000)

HCV感染男性吸毒者血漿CCL19及CCL21濃度變化分析

李紅霞 魏泉德 周 毅 李曉鳳

(珠海市疾病預(yù)防控制中心，珠海519000)

目的：分析丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染男性吸毒者血漿CCL19及CCL21濃度變化。方法：采用定量ELISA法檢測(cè)血漿CCL19和CCL21濃度，ELISA法檢測(cè)血漿抗HCV，Real-time RT-PCR法檢測(cè)HCV RNA，以國(guó)家哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)HCV感染的391名男性吸毒者為研究對(duì)象，60名健康男性為對(duì)照，分析不同抗HCV/HCV RNA狀況男性吸毒者血漿CCL19和CCL21濃度變化。結(jié)果：391名男性吸毒者中，180名感染HCV，感染率為46.04%。未感染HCV男性吸毒組血漿CCL19及CCL21濃度較健康男性組升高(P≤0.001)。吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)組血漿CCL19和CCL21濃度最低，與其他組差異明顯(P≤0.05)；吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)組的最高，與健康男性組差異顯著(P<0.05)。結(jié)論：吸毒可使男性血漿CCL19和CCL21濃度升高。血漿CCL19和CCL21濃度升高可能有助于HCV自發(fā)清除；血漿CCL19和CCL21濃度降低可能預(yù)示著病程持續(xù)轉(zhuǎn)歸較差。

吸毒;抗HCV;HCV RNA;CCL19;CCL21

自1989年發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)以來(lái)，全球已有約3%的人感染了HCV。中國(guó)一般人群HCV感染率約3.2%；靜脈吸毒者中，HCV的感染率達(dá)37.6%～90%[1,2]。HCV感染者約有18%～34%在急性期可自發(fā)清除病毒[3]，大多數(shù)則發(fā)展成為慢性感染，然后肝臟發(fā)生纖維化，約10%～20%患者發(fā)展成為肝硬化，這些肝硬化患者每年將約有1%～5%會(huì)發(fā)生肝細(xì)胞癌變，3%～6%發(fā)生肝功能失代償[3]。病毒、宿主和環(huán)境因子的多樣性影響著HCV感染的自然史，由于病毒基因組高度變異的特性，限制了疫苗的研制，也影響了有效清除HCV或控制感染治療方案的確定。CCL19和CCL21是穩(wěn)態(tài)(或淋巴樣)趨化因子，通過(guò)與其共同受體CCR7結(jié)合在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[4,5]，CCL19和CCL21血漿水平變化在HCV感染者病毒自發(fā)清除機(jī)制中是否有意義，目前尚未見(jiàn)這方面報(bào)道。本文將以健康男性為對(duì)照，對(duì)HCV感染男性吸毒者血漿CCL19和CCL21濃度變化進(jìn)行分析，以期為防治HCV感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 共有血漿樣本451份，其中391份采自珠海市男性吸毒者，為國(guó)家監(jiān)測(cè)吸毒人群抗HCV抗體項(xiàng)目；60份正常對(duì)照血漿樣本采自健康男性體檢者。

1.2 方法

1.2.1 抗HCV抗體和抗HIV抗體的檢測(cè) Anti-HCV ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：2015101312，有效期：20161016)和Anti-HIV ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：2015091512，有效期：20160918)均為麗珠集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。檢測(cè)儀器為多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Spectra Max M2)?？笻CV抗體和抗HIV抗體的檢測(cè)按試劑盒和儀器說(shuō)明書操作。

1.2.2 CCL19和CCL21的檢測(cè) 人CCL19和人CCL21定量ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)均為20150901，有效期均為2016.03)為RB公司產(chǎn)品。檢測(cè)儀器為多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)：Spectra Max M2)。CCL19和CCL21濃度的檢測(cè)按試劑盒和儀器說(shuō)明書操作。

1.2.3 HCV RNA的檢測(cè)

1.2.3.1 HCV RNA抽提 采用QIAamp Viral RNA mini Kit(批號(hào)：151032813，有效期：2017.04.11)提取HCV RNA，HCV RNA抽提過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書操作。提取的RNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 Real-time RT-PCR 檢測(cè)儀器為AB Applied Biosystems 7500 Real-time RT-PCR system。擴(kuò)增試劑為AB Applied Biosystems Ambion Real-time RT-PCR Kit(批號(hào)：1504091，有效期：2016.4.10)。上游引物：5′-CGGGAGAGCCATAGTGGT-3′；下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCA-3′；探針：FAM-CAAGGCCTTTCGCGACCCAA-BHQ1。HCV RNA的檢測(cè)按儀器和試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為IBM SPSS Statistics 22版，健康對(duì)照者和不同抗HCV/HCV RNA狀況吸毒者血漿CCL19及CCL21水平比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 451份樣品均為成人男性(年齡19～59歲)血漿。 其中60份正常對(duì)照血漿抗HIV、抗HCV和HCV RNA檢測(cè)均陰性；391份男性吸毒者血漿抗HIV均陰性，其中211份血漿抗HCV和HCV RNA均陰性，180份血漿抗HCV抗體和/或HCV RNA陽(yáng)性， HCV感染率為46.04%。

2.2 吸毒對(duì)血漿CCL19和CCL21濃度的影響 從圖1、2和表1、2可以發(fā)現(xiàn)，未感染HCV的男性吸毒組血漿CCL19和CCL21濃度均數(shù)均高于健康對(duì)照組，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.001)。

2.3 不同抗HCV/HCV RNA狀況對(duì)血漿CCL19和CCL21濃度的影響 從圖1、圖2可以看出，未感染HCV[抗HCV(-)/HCV RNA(-)組]的男性吸毒組比健康男性組血漿濃度升高；感染HCV而體內(nèi)未產(chǎn)生抗HCV抗體[抗HCV(-)/HCV RNA(+)組]的男性吸毒組血漿CCL19及CCL21濃度均下降，是各種抗HCV/HCV RNA狀況組血漿濃度最低的；感染HCV并且體內(nèi)已產(chǎn)生抗HCV抗體[抗HCV(+)/HCV RNA(+)組]的男性吸毒組，比抗HCV(-)/HCV RNA(+)組男性吸毒組血漿濃度高； 體內(nèi)產(chǎn)生抗HCV抗體并已成功清除HCV[抗HCV(+)/HCV RNA(-)組]的男性組血漿濃度則更進(jìn)一步升高。

圖1 不同抗HCV/HCV RNA狀況男性血漿CCL19變化(pg/ml)Fig.1 Level diversifies of plasma CCL19 in man with different anti-HCV/HCV RNA(pg/ml)Note: 1.Normal control；2.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(-)；3.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(+);4.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-)；5.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-).

圖2 不同抗HCV/HCV RNA狀況男性血漿CCL21變化(ng/ml)Fig.2 Level diversifies of plasma CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA(ng/ml)Note: 1.Normal control；2.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(-)；3.Drug abuse anti-HCV(-)/RNA(+);4.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-)；5.Drug abuse anti-HCV(+)/RNA(-).

表1 不同抗HCV/HCV RNA狀況男性血漿CCL19和CCL21水平差異

Tab.1 Differentiation of plasma CCL19 and CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA

SamplesCCL19(pg/ml)MinimumMaximumMeanStd.DeviationSig.CCL21(ng/ml)MinimumMaximumMeanStd.DeviationSig.CON602.340124.78047.96023.9500.0010.0101.7400.4400.3100.001A2115.930627.68094.680162.4400.0009.3401.3202.610B79.19043.52020.63012.8900.0000.3300.1000.120C1401.310621.97062.490120.6700.0009.7000.9102.060D3312.540602.360161.280202.0300.0009.1802.4303.310

Note：CON.Normal control；A.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(-)；B.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(+)；C.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(+)；D.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-).

表2 不同抗HCV/HCV RNA狀況男性血漿CCL19與CCL21濃度比較(Sig.)

Tab.2 To compare level of plasma CCL19 and CCL21 in man with different anti-HCV/HCV RNA(Sig.)

ItemsCON*ACON*BCON*CCON*DA*BA*CA*DB*CB*DC*DCCL190.0010.0050.8530.0290.0000.2940.5600.0040.0040.099CCL210.0000.0000.0920.0160.0000.6740.5300.0000.0030.148

Note：CON.Normal control；A.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(-)；B.Drug abuse anti-HCV(-)/HCV RNA(+)；C.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(+)；D.Drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-).

通過(guò)對(duì)不同抗HCV/HCV RNA狀況組血漿CCL19及CCL21濃度進(jìn)行比較分析(表1)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和不同抗HCV/HCV RNA狀況男性吸毒組組間差異顯著(P=0.001)。進(jìn)一步多重比較(表2)發(fā)現(xiàn)，除吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)組外，其他組與健康對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(-)組與吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)組、吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)組的比較無(wú)明顯差異；吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)組與其他各組差異明顯(P≤0.005)。

3 討論

趨化因子是一類小分子量的趨化性細(xì)胞因子，在白細(xì)胞游走和活化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。大多數(shù)趨化因子有4個(gè)保守的半胱氨酸，根據(jù)前兩個(gè)半胱氨酸的相對(duì)位置，將趨化因子分為C、CC、CXC和CX3C四個(gè)家族。CCL19和CCL21屬于趨化因子CC家族，均位于人類9號(hào)染色體。CCL19蛋白包含 98 個(gè)氨基酸，主要在胸腺和二級(jí)淋巴器官內(nèi)表達(dá)；CCL21編碼110 個(gè)氨基酸，主要在淋巴結(jié)和脾臟 T 細(xì)胞富集區(qū)表達(dá)。CCR7是CCL19與CCL21的共同受體，其基因位于17號(hào)染色體。CCR7 在淋巴細(xì)胞向淋巴結(jié)歸巢中發(fā)揮重要作用，CCR7缺失或者其配體CCL19和CCL21缺失，將會(huì)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞進(jìn)入輸出淋巴結(jié)受損和外周淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)異常[6]。

吸毒對(duì)身體的損害往往是全身性、連鎖式的反應(yīng)，對(duì)免疫系統(tǒng)的毒性作用主要表現(xiàn)為不同程度地削弱機(jī)體的免疫功能，包括非特異性和特異性功能。表1和圖1、圖2顯示，男性吸毒者血漿CCL19和CCL21濃度高于男性非吸毒者的(P≤0.001)，這是否可能為吸毒在降低機(jī)體免疫功能的同時(shí)，為抵御外界化學(xué)、生物等各種有害因子的損傷，機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用，通過(guò)某種上調(diào)機(jī)制升高血漿CCL19和CCL21濃度以促進(jìn)抗原的呈遞及增強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能，這有待于進(jìn)一步研究。

雖然大多數(shù)HCV感染者的自然病程是感染急性期→慢性肝炎→肝纖維化→肝硬化的過(guò)程，但仍有18%～34%的感染者在急性期可自發(fā)清除病毒[3]。一般而言，人群感染HCV的早期(也是感染急性期)會(huì)出現(xiàn)抗HCV(-)/HCV RNA(+)狀況，但出現(xiàn)抗HCV(-)/HCV RNA(+)狀況也可能是HCV感染慢性期因機(jī)體免疫反應(yīng)低下未能產(chǎn)生抗HCV抗體。從圖1、2可以發(fā)現(xiàn)，吸毒抗HCV(-)/HCV RNA(+)組的血漿CCL19及CCL21濃度是幾組中最低的，隨著感染者體內(nèi)特異性抗體的產(chǎn)生及病毒的清除，吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)組和吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(-)組血漿CCL19及CCL21濃度逐漸升高，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，表1 顯示差異明顯(P=0.001)。將不同抗HCV/HCV RNA狀況男性吸毒組和正常對(duì)照組血漿CCL19和CCL21濃度進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)(表2)，除吸毒抗HCV(+)/HCV RNA(+)組外，其他吸毒組與正常對(duì)照組差異顯著(P≤0.005)，可能為感染者機(jī)體從抗HCV(-)/HCV RNA(+)到抗HCV(+)/HCV RNA(-)的抗病毒過(guò)程中調(diào)節(jié)CCL19和CCL21發(fā)揮作用時(shí)其濃度接近健康對(duì)照組所致?？笻CV(-)/HCV RNA(+)組血漿CCL19及CCL21濃度均值最低，而病毒自發(fā)清除組[抗HCV(+)/HCV RNA(-)]血漿濃度均值最高，這一“HCV感染-抗HCV抗體產(chǎn)生-HCV自發(fā)清除”伴隨血漿CCL19及CCL21濃度逐漸升高的現(xiàn)象可能為機(jī)體感染HCV后免疫系統(tǒng)的反射性調(diào)節(jié)過(guò)程，也顯示HCV自發(fā)清除可能與血漿CCL19及CCL21濃度升高有關(guān)。而血漿CCL19及CCL21濃度降低可能預(yù)示著病程持續(xù)轉(zhuǎn)歸較差。

盡管吸毒可使男性血漿CCL19和CCL21濃度升高，血漿CCL19及CCL21濃度升高可能有助于HCV自發(fā)清除，但不可否認(rèn)，吸毒對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷是整體性的，正如一般情況下病毒感染會(huì)導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞升高不能說(shuō)明病毒感染有益于機(jī)體，我們需辯證地看待吸毒使男性血漿CCL19和CCL21濃度升高這一現(xiàn)象。

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[收稿2016-09-22 修回2016-12-05]

(編輯 倪 鵬)

Level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in male drug users infected HCV

LIHong-Xia,WEIQuan-De,ZHOUYi,LIXiao-Feng.

ZhuhaiCentersforDiseaseControlandPrevention,Zhuhai519000，China

Objective:To analyze the level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in the male drug users infected HCV.Methods: The plasma CCL19 and CCL21,anti-HCV and HCV RNA were detected by ELISA quantitation,ELISA qualitation and Real-time RT-PCR respectively.Compared with 60 healthy man,the level diversifies of plasma CCL19 and CCL21 in 391 male drug users conducted as part of HCV Surveillance Programme in Zhuhai were analyzed.Results: 180 of 391 male drug users were infected HCV and the infection rate was 46.04%.The level of plasma CCL19 and CCL21 in the male drug users[anti-HCV(-)/HCV RNA(-)] were higher than that in the healthy man (P≤0.001).The level of plasma CCL19 and CCL21 in anti-HCV(-)/HCV RNA(+) group was lower than that in the others(P≤0.05) .Compared with that in the healthy man,the level of plasma CCL19 and CCL21 in the drug abuse anti-HCV(+)/HCV RNA(-) group had significant deviation(P<0.05).Conclusion: Drug abuse can heighten the level of plasma CCL19 and CCL21 in man.Increasing the level of plasma CCL19 and CCL21 may conduce to spontaneous HCV clearance.It may prognosticate that HCV infection will be persistent and have a bad consequence when the level of plasma CCL19 and CCL21 were degraded.

Drug abuse;anti-HCV;HCV RNA;CCL19;CCL21

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.022

李紅霞(1969年-)，女，碩士，副主任技師，主要從事微生物分子流行病學(xué)方面研究。

R392.7

A

1000-484X(2017)05-0742-04