下調(diào)CD59對急性T系白血病細(xì)胞株Jurkat 凋亡相關(guān)分子的影響①

高美華 李華僑 李 冰 王 忠 叢蓓蓓 王 冰

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,青島266071)

·生物治療·

下調(diào)CD59對急性T系白血病細(xì)胞株Jurkat 凋亡相關(guān)分子的影響①

高美華 李華僑 李 冰②王 忠 叢蓓蓓 王 冰③

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,青島266071)

目的：探討下調(diào)CD59對急性T系白血病細(xì)胞株Jurkat凋亡相關(guān)分子的影響。方法：運(yùn)用RNAi慢病毒為載體下調(diào)急性T系白血病Jurkat 細(xì)胞株CD59的表達(dá)；激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染效率及CD59分子的定位；Real-time-PCR、Western blot篩選下調(diào)效果最好的一組細(xì)胞，用其做后續(xù)的分子生物學(xué)水平的實驗； Western blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)量的變化；ELISA檢測各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-3、TNF-β的表達(dá)。 結(jié)果：激光共聚焦觀察到轉(zhuǎn)染各組的轉(zhuǎn)染效率在90%以上，CD59分子主要位于細(xì)胞膜；Real-time-PCR篩選得出下調(diào)A組的轉(zhuǎn)染效果最好； Western blot結(jié)果顯示下調(diào)A組的CD59蛋白的表達(dá)量減少最明顯，將RNAi-CD59-A定義為RNAi-CD59作為實驗組進(jìn)行后續(xù)實驗；實驗組能增強(qiáng)Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.05)，抑制Bcl-2、Survivin蛋白的表達(dá)(P<0.05)；ELISA結(jié)果顯示下調(diào)組IL-3 表達(dá)水平降低(P<0.05)， TNF-β的表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論：下調(diào)D59基因表達(dá)可使急性T系白血病細(xì)胞株Jurkat的促凋亡分子表達(dá)增高，促增殖分子表達(dá)降低。

CD59；凋亡；Jurkat；轉(zhuǎn)染

20世紀(jì)90年代，人們將由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平特異性在轉(zhuǎn)錄后沉默相應(yīng)序列基因表達(dá)的過程稱為RNA干擾(RNAi)[1]。RNAi 自發(fā)現(xiàn)以來其用于腫瘤治療的主要目標(biāo)是能夠選擇性地沉默突變的或者與腫瘤相關(guān)的基因而對正?；虿粫a(chǎn)生損害[2]，其在腫瘤治療中具有巨大的潛力,利用RNAi 技術(shù),對腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因和抑癌基因進(jìn)行抑制其功能表達(dá),分析其表型發(fā)生的變化,有利于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為臨床腫瘤疾病的診斷治療提供了新思路[3]。本課題組前期運(yùn)用電轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)CD59的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率低，有一定的下調(diào)效果，對Jurkat細(xì)胞增殖具有一定的影響[4]，因此，本課題優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法，采用慢病毒為載體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，研究RNAi慢病毒下調(diào)CD59基因?qū)毙訲系白血病細(xì)胞株Jurkat凋亡相關(guān)分子的影響，為臨床白血病的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RNAi-CD59序列由本實驗室前期研究設(shè)計，RNAi-CD59序列以及陰性對照組的加強(qiáng)型綠色熒光蛋白慢病毒的包裝由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司統(tǒng)一合成(見表1)；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Real-time PCR試劑盒均購自TaKaRa生物工程有限公司；哺乳動物蛋白抽提試劑、磷酸酶抑制劑、BCA試劑盒均購自康為試劑有限公司；兔抗人CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin單克隆抗體購自Abcam公司；ELISA試劑盒購自武漢基因美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Jurkat細(xì)胞系購自上海中科院細(xì)胞庫，于本實驗室保存，培養(yǎng)細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液)，隔天換液一次；取對數(shù)生長期Jurkat細(xì)胞，接種于96孔板中(80 μl/孔 ，每組5個復(fù)孔)，加入構(gòu)建的病毒(MOI值為50)，12 h后離心換液，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.2.2 激光共聚焦觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及CD59分子的定位 取對數(shù)生長期的細(xì)胞通過熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)來確定轉(zhuǎn)染效率，每組選擇5個具有代表性的視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)的平均值，估算轉(zhuǎn)染效率；同樣取適量對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗滌后懸滴于載玻片上，自然晾干后4%多聚甲醛固定。10%山羊血清封閉30 min后，加入一抗4℃過夜孵育。羅丹明標(biāo)記的熒光二抗室溫避光孵育2 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察CD59在細(xì)胞膜上的定位情況。

表1 RNAi-CD59基因序列

Tab.1 Gene sequence of RNAi-CD59

GroupsRNAi-CD59sequenceATGAGCTAACGTACTACTGCBTGCGTGTCTCATTACCAAACGTGGGACATCCTTATCAGAGA

1.2.3 Real-time-PCP觀察各組細(xì)胞CD59 mRNA的表達(dá)情況 按TRIzol 試劑盒分別提取細(xì)胞系Jurkat正常細(xì)胞組，RNAi-CD59細(xì)胞A、B、C組及陰性對照組的總RNA，分別各取0.5 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海生工公司合成，序列(見表2)，反應(yīng)體系總體積為20 μl，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 min，40個循環(huán)。由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，采用2-ΔΔCt法計算相對定量結(jié)果。

1.2.4 Western blot觀察各組細(xì)胞CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin 分子蛋白的表達(dá)水平 收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞(107個/ml，1 ml)，提取總蛋白。于16%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫2 h，一抗4℃孵育過夜。TBST沖洗后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，避光，曝光顯色。以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Image-J灰度分析軟件進(jìn)行半定量檢測。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞分泌因子IL-3、TNF-β的表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106于6孔板培養(yǎng)48 h后，1 000 r/min離心3 min取上清，后將上清液3 000 r/min離心20 min取上清液，按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行各個數(shù)據(jù)的測定。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡顯示病毒轉(zhuǎn)染效率及CD59分子在細(xì)胞上的定位 RNAi-CD59 3個組及空載體病毒顆粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后直接在共聚焦顯微鏡下選取5個代表性的視野，觀察。兩圖中的圖1A1、A2經(jīng)488 nm發(fā)射波激發(fā)下未見綠色熒光出現(xiàn)，圖1B1、B2中可見布滿整個視野的綠色熒光，幾乎包括每個細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%；圖1C1、C2顯示CD59定位于細(xì)胞膜上細(xì)胞，圖1D1為B1、C1合并得到，同樣D2為B2、C2合并得到，說明了CD59的細(xì)胞膜表達(dá)更為明顯(如圖1)。

表2 CD59測定引物序列

Tab.2 Primer sequence of CD59

GenesForwardprimersReverseprimersCD595'-TGAGACACGCATCAAAATCAG-3'5'-CTGCCATTCAGGTCATAGCC-3'β-action5'-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3'5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3'

圖1 激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染效率及CD59分子的定位Fig.1 Rate of transfection efficiency and location of CD59 in confocal

圖2 Real-time-PCR檢測各組CD59 mRNA的表達(dá)(n=3)Fig.2 Expression of CD59 mRNA in each group by Real-time-PCR(n=3)Note: vs Jurkat,***.P<0.001.

圖3 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)情況(n=3)Fig.3 Expression of related molecule in each group(n=3)Note: vs Jarkat，*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

圖4 各組細(xì)胞分泌因子的表達(dá)情況(n=3，ng/ml)Fig.4 Expression of cells secrete factors in each group(n=3，ng/ml)Note: vs Jurkat，***.P<0.001.

2.2 Real-time-PCR篩選明顯的CD59下調(diào)序列 Real-time-PCR結(jié)果顯示RNAi-CD59-A的下調(diào)效果最好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),RNAi-NC與Jurkat細(xì)胞相比，CD59表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明RNAi-CD59下調(diào)機(jī)制構(gòu)建成功(如圖2)。

2.3 各組細(xì)胞CD59、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin 分子蛋白的表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，RNAi-CD59-A組CD59蛋白表達(dá)量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),后續(xù)用A組做實驗組進(jìn)行相關(guān)分子的檢測；實驗組Bcl-2、Survivin表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組Bax、caspase-3表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Jurkat組相比，陰性對照組(RNAi-NC)的各組蛋白表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,如圖3)。

2.4 細(xì)胞分泌因子IL-3、TNF-β的表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后，下調(diào)組細(xì)胞上清液中IL-3較Jurkat相比表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組細(xì)胞上清液中TNF-β較Jurkat組相比表達(dá)量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空病毒組上述兩個指標(biāo)較Jurkat組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，如圖4)。

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的特點(diǎn)是侵襲骨髓的未成熟的淋巴細(xì)胞進(jìn)行無限增殖，而急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)是一種由于未成熟T細(xì)胞前體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化引起的侵襲性血液系統(tǒng)的腫瘤[5]，治療與預(yù)后較差，有報道顯示白血病的發(fā)生趨于低齡化，其中14歲以下青少年主要惡性病為白血病[6]，因此對于白血病的研究有著非常重要的意義。免疫分子CD59也稱保護(hù)素(Protectin),廣泛分布于造血生成細(xì)胞和非造血生成細(xì)胞及多種組織細(xì)胞表面的補(bǔ)體終末段的一種18～20 kD的膜性調(diào)節(jié)蛋白,具有抑制補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的形成,保護(hù)細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用[7]。CD59分子在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)[8-11]，抑制補(bǔ)體殺傷，逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，因此，CD59過表達(dá)的腫瘤病人預(yù)后較差。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中CD59基因受抑制后對補(bǔ)體溶破的抵抗作用降低，在篩選有效下調(diào)效率時，根據(jù)功能性CD59可抑制MAC的形成，功能性越高，保護(hù)性越強(qiáng)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD59表達(dá)最好的一組CD59溶破作用最好，促凋亡效果最好[12，13]，并發(fā)現(xiàn)CD59可通過Cbp/LAT傳遞信號，引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子的變化[14,15]，但對于CD59與白血病凋亡相關(guān)分子的直接關(guān)系的研究，需要進(jìn)一步探討。

本實驗構(gòu)建3條RNAi-CD59序列結(jié)合綠色熒光融合蛋白，以慢病毒為載體，轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞，其中RNAi-CD59-A在本實驗室前期Hela細(xì)胞上驗證有效[16]，RNAi-CD59-B組RNAi-CD59-C組由吉凱基因合作完成，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，以空病毒為陰性對照組(RNAi-NC)，Jurkat細(xì)胞組為空白對照組。激光共聚焦觀察綠色熒光蛋白幾乎布滿整個視野，說明綠色熒光蛋白結(jié)合入細(xì)胞內(nèi)，同時我們觀察到空病毒組的綠光主要分布于胞內(nèi)，下調(diào)組綠光主要位于細(xì)胞膜，加CD59抗體孵育后，觀察到兩者紅光均位于細(xì)胞膜，進(jìn)一步說明了CD59主要定位于細(xì)胞膜。我們運(yùn)用Real-time-PCR和Western blot分別檢測CD59 mRNA和CD59蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD59在基因和蛋白水平上的表達(dá)均降低，且A組的下調(diào)效果最佳，證明了下調(diào)CD59表達(dá)的細(xì)胞模型構(gòu)建成功，后續(xù)將用A組作為實驗組(定義為RNAi-CD59)。實驗組抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Survivin的表達(dá)量降低(P<0.05)，促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)量升高(P<0.05),說明下調(diào)CD59的表達(dá)能夠增加促凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，降低促增殖相關(guān)分子的表達(dá)，具有一定的研究價值。ELISA結(jié)果顯示，實驗組IL-3的表達(dá)水平降低，說明下調(diào)CD59的表達(dá)能夠使促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的相關(guān)分泌因子表達(dá)降低，說明細(xì)胞的增殖水平有可能降低；實驗組TNF-β的表達(dá)水平升高，說明下調(diào)CD59的表達(dá)能夠發(fā)生腫瘤壞死相關(guān)因子的表達(dá)量增高，具有一定的意義。

綜上所述，下調(diào)CD59的表達(dá)能夠使Jurkat細(xì)胞的促凋亡相關(guān)分子的表達(dá)升高，促增殖的相關(guān)分子的表達(dá)降低，從而起到促進(jìn)凋亡抑制增殖的效果，但其具體的發(fā)生機(jī)制和下調(diào)后對生物學(xué)行為的影響以及靶向抑制CD59對正常T細(xì)胞的影響效果還需進(jìn)一步驗證，后期我們將采取不同的方式對其促凋亡效果進(jìn)行分析，并采用裸鼠移植瘤模型進(jìn)行動物水平實驗加以研究。

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[收稿2016-11-25]

(編輯 倪 鵬)

Effect of down-regulation of CD59 gene on apoptosis of acute T lymphocyte Jurkat cell lines

GAOMei-Hua,LIHua-Qiao,LIBing,WANGZhong,CONGBei-Bei,WANGBing.

DepartmentofImmunologyMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266071,China

Objective:To study the change of related molecular about apoptosis we reduce the expression of CD59 on acute T lymphocyte Jurkat cell lines .Methods: RNA interference (RNAi) was used to reduce the expression of CD59 gene by lentivirus,confocal was applyed to observe the transfection efficiency and the location of CD59 molecular then Real-time-PCR and Western blot were used to select the most effective group to do the rest experiment ;Western blot was used to detect the change of expression about Bcl-2,Bax,Caspase-3 and Survivin;ELISA was used to investigate the expression of IL-3 and TNF-β.Results: Confocal observed each group′s transfection efficiency over 90%,CD59 molecules were mainly located in cell membrane;Real-time-PCR and Western blot showed group A had the best down-regulation efficiency ; we defined RNAi-CD59-A as experimental group for subsequent experiments named RNAi-CD59;the experimental group can enhance the expression of Bax,caspase-3 (P<0.05),inhibit the expression of Bcl-2 and Survivin(P<0.05);ELISA showed that the expression of IL-3 in the down-regulation group increase(P<0.05),the expression of TNF-β decrease (P<0.05).Conclusion: Down-regulation CD59 can promote the expression of apoptosis molecular in acute leukemia Jurkat cell lines restrain the expression of proliferation molecular.

CD59;Apoptosis;Jurkat;Transfection

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.012

①本文受國家自然科學(xué)基金(No.81273206)資助。

高美華(1953年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子免疫方面的研究，E-mail:meihuagao66@163.com。

R392.4

A

1000-484X(2017)05-0693-04

②青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，青島266071。

③青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院科研處，青島266071。