梅毒螺旋體膜蛋白Tp0971經(jīng)TLR2/NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子①

張躍軍 蔣傳好 劉良專 蔣最明 顧 敏 吳移謀

(湖南省株洲市中心醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，株洲412007)

梅毒螺旋體膜蛋白Tp0971經(jīng)TLR2/NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子①

張躍軍 蔣傳好②劉良專②蔣最明 顧 敏 吳移謀②

(湖南省株洲市中心醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，株洲412007)

目的：探討梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp0971誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的分子機(jī)制。方法：以Tp Nichols株基因組為模板，PCR擴(kuò)增Tp0971基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0971，隨后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli Rosseta中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。經(jīng)去除Tp0971重組蛋白中的內(nèi)毒素后，將其刺激巨噬細(xì)胞，ELISA檢測細(xì)胞因子IL-8、IL-1β和IL-6的分泌水平。并采用Toll樣受體2(TLR2)中和抗體或TLR2 siRNA，以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)抑制劑PDTC處理細(xì)胞，觀察TLR2和NF-κB在介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌中的作用。結(jié)果：成功構(gòu)建pET28a(+)/Tp0791原核表達(dá)載體，并表達(dá)出一相對分子量為29 kD的重組蛋白。ELISA結(jié)果顯示，0.5～10 μg/ml Tp0791能以劑量依賴性方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA沉默TLR2表達(dá)，或用TLR2中和抗體封閉后，IL-8、IL-1β和IL-6分泌明顯減少。此外，Tp0791也能增加細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)水平，采用NF-κB抑制劑PDTC處理后，細(xì)胞因子分泌水平也顯著降低。結(jié)論：Tp0971經(jīng)TLR2/NF-κB可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

梅毒螺旋體；膜蛋白；細(xì)胞因子；Toll樣受體2

梅毒螺旋體(Treponema pallidun,Tp)是導(dǎo)致性傳播疾病梅毒的病原體，它不僅可導(dǎo)致人體多器官損害，同時也可經(jīng)胎盤由母體垂直傳播給胎兒，從而導(dǎo)致先天性梅毒的發(fā)生，給出生人口質(zhì)量帶來極大危害[1,2]。目前Tp的致病機(jī)制尚未完全明了，探討其致病因子的生物學(xué)作用是防治本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，Tp感染后的炎癥和持續(xù)的獲得性免疫應(yīng)答是導(dǎo)致機(jī)體病理損傷的主要因素[3]。本課題組的前期研究表明，Tp中的多種膜蛋白具有促炎活性，如Tp47能通過TLR2激活核轉(zhuǎn)錄因子κB，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-8等細(xì)胞因子[4]。Tp0971是近年發(fā)現(xiàn)的膜脂蛋白之一，其結(jié)構(gòu)顯示Tp0971能與哺乳動物體內(nèi)的乳鐵蛋白和Zn2+結(jié)合，而Zn2+是Tp代謝的重要輔助因子，因此Tp0971可能在Tp的新陳代謝中發(fā)揮一定作用[5]。本課題組前期研究表明，Tp0971具有較好的免疫原性[6]，但其是否還具有致炎活性目前仍不明確。本研究旨在觀察Tp0971潛在的致炎活性，并初步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株由上海皮膚性病醫(yī)院顧偉鳴主任惠贈；E.coli JM109、Rosetta、表達(dá)載體pET28a(+)和THP-1細(xì)胞均為南華大學(xué)病院研究所保存；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化提取試劑盒購自Axygen； Ni-NTA 6×His親和層析純化試劑盒、Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠、RPMI1640培養(yǎng)基以及核蛋白提取試劑盒為Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品； ECL蛋白印跡法檢測試劑盒購自Amersham Biosciences；IL-8、IL-1β和IL-6試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司； BamHⅠ、Hind Ⅲ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購自NEB；6-His-Tag(Mo)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購自四季青生物工程材料公司；TLR2 siRNA和中和抗體分別購自Santa Cruz和Imgenex。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 從GenBank中獲取Tp0971基因的堿基序列，分別設(shè)計上游和下游特異性引物5′-CGCG▼GATCC AAGAGGGTGAG-TTTGCTCGG-3′和5′-CCCA▼AGCTT CCACTGAGG-CCCCTTCCA-3′，并分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，于PCR儀上94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，56℃ 退火40 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72℃終延伸10 min。純化并回收PCR產(chǎn)物并，雙酶切純化產(chǎn)物和pET28a(+)質(zhì)粒，經(jīng)純化回收、亞克隆以及轉(zhuǎn)化篩選后獲得重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli Rosetta中，Kanamycin(50 μg/ml)篩選陽性克隆，并進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)重組菌培養(yǎng)至A600=0.6左右時，向培養(yǎng)物中加入IPTG，37℃分別誘導(dǎo)表達(dá)。取各種菌液1.0 ml 13 000 r/min離心30 s，收集菌體沉淀，分別用100 μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液重懸，然后100℃水浴中加熱5 min，13 000 r/min離心5 min，獲取上清用于SDS-PAGE分析，并進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.3 Tp0971重組蛋白純化及內(nèi)毒素的去除 將250 ml細(xì)菌培養(yǎng)液(OD600=1.5～3.0)與1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)菌沉淀并重懸于10ml B-PER試劑中并充分混勻，14 000 r/min離心15 min收集上清；打開鎳螯合柱蓋子后依次加入10 ml B-PER試劑以及10 ml 樣本使其從柱中流出。并分別用洗液1和洗液2洗滌，最后用洗脫液洗脫6×His標(biāo)簽蛋白。將獲取的蛋白樣品加至真空處理的Detoxi-Gel柱中，并用無致熱源水洗脫，收集洗脫液。隨后將Detoxi-Gel柱中加入5倍體積1%去氧膽酸鈉漂洗，再加入3～5倍無致熱源水洗滌使其再生后重復(fù)樣品過柱1次。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與刺激 接種于6孔板中的THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至密度為80%時，加入終濃度為160 nmol/L的PMA使其分化為巨噬細(xì)胞。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞加入不同濃度的上述蛋白刺激后用于下一步研究。

1.2.5 ELISA檢測IL-8、IL-1β和IL-6分泌 巨噬細(xì)胞經(jīng)Tp0971刺激結(jié)束后，吸取細(xì)胞上清，1 000 r/min離心10 min，取100 μl上清液加至預(yù)包被有IL-8、IL-1β或IL-6抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育2 h。經(jīng)洗滌后加入試劑盒提供的一抗，與37℃下避光孵育 90 min。充分洗滌后加入生物素化抗體孵育30 min，DAB顯色。酶標(biāo)儀下獲取其吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出上清液中的細(xì)胞因子濃度。

1.2.6 RNA干擾 接種于6孔板中的巨噬細(xì)胞用1%血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，隨后按照Qiagen公司提供的轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染TLR2 siRNA，100 nmol/L TLR2 siRNA或?qū)φ誷iRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合后加至細(xì)胞培養(yǎng)上清中共同孵育18 h，隨后用無血清培養(yǎng)基漂洗后更換為10%濃度血清的完全培養(yǎng)基用于下一步研究。

1.2.7 核蛋白、細(xì)胞膜蛋白提取與Western blot 巨噬細(xì)胞處理結(jié)束后，胰酶消化并吹打成細(xì)胞懸液，無菌PBS漂洗2次，加入100 μl RAPI裂解液充分裂解細(xì)胞，胞漿蛋白和核蛋白根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行，并采用Bradford法測定蛋白濃度。按照參考文獻(xiàn)提供的方法提取細(xì)胞膜蛋白[7]，即，將細(xì)胞重懸浮于含有蛋白酶抑制劑的松弛緩沖液中(relaxation buffer，100 mmol/L KCl、3 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、10 mmol/L Hepes、0.5 mmol/L PMSF)。經(jīng)超聲破碎后，4℃ 800 r/min離心10 min以去除細(xì)胞核即未破碎細(xì)胞。獲取上清液后4℃ 14 000 r/min超速離心30 min，繼續(xù)用松弛緩沖液重懸浮沉淀并充分振蕩后再次4℃14 000 /rmin超速離心30 min，上清即為細(xì)胞膜成分。將獲取的蛋白加入等體積2×上樣緩沖液混合并煮沸5 min后，取20 μl蛋白用于SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用TBST漂洗后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后分別與一抗和HRP標(biāo)記二抗孵育，化學(xué)發(fā)光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 Tp0971基因的PCR擴(kuò)增與重組載體的酶切鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后顯示，在612 bp位置可見一條清晰的條帶，與預(yù)期片段大小相符(圖1A)。隨后重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0971分別采用BamHⅠ 和Hind Ⅲ酶切，所獲得的條帶與預(yù)期片段相符(圖1B)。2.2 Tp0971誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 Tp0971重組表達(dá)體分別加入不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，圖2顯示，37℃下蛋白為可溶性表達(dá)，但加入0.2～1.5 mmol/L IPTG對Tp0971表達(dá)無明顯影響。

圖1 Tp0971基因的PCR擴(kuò)增與重組載體的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of Tp0971 gene and enzyme digestion of recombinant vectorNote: A.Electrophoretic analysis of Tp0971 PCR product in 1% agarose gel.1.DNA marker；2.PCR product；3.Negative control;B.Restriction mapping of recombinant plasmid pET28a(+)/Tp0971 digested with BamH Ⅰ and Hind Ⅲ.1,4.DNA marker；2.PCR product；3.Recombinant plasmid pET28a(+)/Tp0971 digested with BamH Ⅰ and Hind Ⅲ.

2.3 重組蛋白的鑒定 Tp0971表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，加入TBST稀釋后的6-His-Tag單抗為一抗，采用Western blot方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示在29 kD初可見明顯的條帶，而對照組無相應(yīng)條帶(圖3)。

2.4 重組蛋白的純化 重組菌用B-PER裂解并經(jīng)Ni-NTA過柱后，用Buffer1、Buffer2以及Eluent進(jìn)行洗脫。SDS-PAGE結(jié)果顯示Buffer2能洗脫所有雜蛋白，而最終Eluent洗脫后產(chǎn)物得到了進(jìn)一步純化(圖4)。

2.5 Tp0971蛋白對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 因CD11b和CD36是巨噬細(xì)胞表面的特征性分子，因此我們在Tp0971蛋白刺激巨噬細(xì)胞之前，采用Western blot檢測了PMA處理THP-1細(xì)胞前后細(xì)胞膜上CD11b和CD36表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，未經(jīng)PMA處理的THP-1細(xì)胞表面CD11b和CD36表達(dá)水平低下，經(jīng)160 nmol/L PMA誘導(dǎo)后，細(xì)胞膜上CD11b和CD36明顯增高，而內(nèi)參Gα蛋白保持恒定(圖5)，表明THP-1成功誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。此外，未經(jīng)蛋白刺激的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平很低。而用不同濃度Tp0971蛋白刺激后24 h后，細(xì)胞上清中IL-8、IL-1β和IL-6水平顯著增高(表1)。為排除細(xì)胞因子分泌為重組蛋白中內(nèi)毒素污染的可能，刺激蛋白經(jīng)去內(nèi)毒素后，鱟實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)毒素含量<10 pg/ml(結(jié)果略)。

圖2 不同IPTG對Tp0971在大腸桿菌中表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different IPTG on expression of Tp0971 in Escherichia coliNote: Lane 1,3,5,7 and 10.Supernatant of the pET28a(+)/Tp0971 expressing bacteria induced by 0.2,0.5,0.8,1.0 and 1.5 mmol/L IPTG；Lane 2,4,6,8 and 11.Precipitation of the pET28a(+)/Tp0971 expressing bacteria induced by 0.2,0.5,0.8,1.0 and 1.5 mmol/L IPTG；Lane 12.No IPTG-induced bacteria；13.Bacteria transfected with pET28a(+)；14.E.coli Rosetta.

圖3 Tp0971重組蛋白的Western blot鑒定Fig.3 Western blot identification of Tp0971 recombin-ant proteinNote: Lane 1.pET28a(+)/Tp0971 recombinant protein；Lane 2.Purificated recombination protein；Lane 3.Expression bacteria with pET28a(+).

圖4 Tp0971重組蛋白純化效果Fig.4 Purification effect of Tp0971 recombinant proteinNote: Lane 1.Supernatant of broken Tp0971 recombinant protein；Lane 2.Cell lysate flow-through；Lane 3.Buffer 1 washed protein；Lane 4.Buffer 2 washed protein;Lane 5.Buffer eluated protein;Lane 6.Protein marker.

圖5 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)CD11b和CD36Fig.5 PMA induces THP-1 cells expression of CD11b and CD36

表1 不同濃度Tp0971對細(xì)胞因子分泌的影響

Tab.1 Effects of different concentrations of Tp0971 on secretion of cytokines

GroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971(0.1mmol/kg)30.7±7.31)46.2±7.51)32.5±4.41)Tp0971(1.0mmol/kg)85.1±6.21) 147.9±18.61) 163.8±14.51)Tp0971(5.0μg/ml)113.5±5.51)251.3±5.01)209.4±5.61)Tp0971(10.0μg/ml) 131.6±10.61)272.5±6.71) 212.6±10.21)

Note：1)P<0.05,as compared with the control group.

圖6 TLR2 siRNA干擾效果Fig.6 Silence of TLR2 expression by siRNA

圖7 Tp0971或TLR2抗體對細(xì)胞核中p65含量的影響Fig.7 Effect of Tp0971 or TLR2 antibody on content of p65 in nucleus

表2 抑制TLR2和NF-κB對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

Tab.2 Inhibition of TLR2 and NF-κB on secretion of cytokines in macrophages

GroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2 Tp0971131.6±10.61)272.5±6.71)212.6±10.21)Tp0971+controlAb127.6±14.3 280.9±8.1 203.3±7.1 Tp0971+TLR2Ab63.5±10.52)114.8±9.32)70.6±8.82)Tp0971+TLR2controlsiRNA118.7±11.1 279.3±6.8 199.7±16.7Tp0971+TLR2siRNA48.9±6.62)106.6±7.02)61.4±9.42)Tp0971+PDTC44.7±10.32)113.7±8.22) 80.3±17.52)

Note：1)P<0.05,as compared with the control group; 2)P<0.05,as compared with 10.0 μg/ml Tp0971.

2.6 TLR2/NF-κB與細(xì)胞因子分泌有關(guān) 巨噬細(xì)胞在用Tp0971刺激前，先用10 μg/ml TLR2單克隆抗體孵育30 min,然后以10.0 μg/ml Tp0971刺激24 h，ELISA結(jié)果顯示,TLR2抗體能顯著抑制IL-8、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生。同時采用TLR2 siRNA干擾其表達(dá)后(圖6)，也得到了類似的結(jié)果(表2)。Western blot結(jié)果也顯示，Tp0971處理后，細(xì)胞核中p65含量顯著增多，而用TLR2抗體孵育后，其含量明顯減少(圖7)。采用25 μmol/L NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞1 h后，也可顯著抑制IL-8、IL-6和IL-1β的分泌(表2)。

3 討論

由于缺乏理想的人工培養(yǎng)基，Tp至今無法人工培養(yǎng)，因此研究Tp的致病機(jī)制依賴于體外研究。Tp0971蛋白位于細(xì)胞外膜，基因全長612 bp，編碼220個氨基酸[5]?？寺”磉_(dá)該蛋白時，表達(dá)載體的選擇至關(guān)重要。pET28a(+)是屬于pET質(zhì)粒家族的融合表達(dá)載體，其基因中含有6個組氨酸的編碼序列，這在將外源重組蛋白帶上純化標(biāo)簽的同時，對外源重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響非常小[8]。本研究在純化Tp0971時，通過組氨酸與Ni2+的螯合作用，重組蛋白與Ni-NTA瓊脂柱穩(wěn)定地結(jié)合，獲得較高純度的重組蛋白[9]。為了觀察Tp0971重組蛋白潛在的致炎活性，本研究選用成熟的巨噬細(xì)胞為研究對象，其原因是它對各種刺激因素很敏感，并且在Tp早期感染中發(fā)揮重要作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tp0971膜蛋白能刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-8、IL-6和IL-1β，且其分泌水平與Tp0971的濃度呈一定的劑量依賴關(guān)系。這些細(xì)胞因子的分泌在Tp感染過程中可能具有雙重效應(yīng):一方面是能促進(jìn)固有免疫系統(tǒng)清除病原體；另一方面也決定了炎癥反應(yīng)的結(jié)局，并可能是Tp感染病理損傷的重要因素。

TLR2是固有免疫系統(tǒng)識別Tp的重要受體。有研究表明，Tp膜蛋白在CD14分子的協(xié)同作用下，能將感染信號從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)[11]。本研究采用TLR2中和抗體以及siRNA處理后，結(jié)果顯示細(xì)胞因子分泌水平顯著減少。NF-κB是參與調(diào)控細(xì)胞因子分泌的主要核轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞靜息狀態(tài)下，它位于細(xì)胞漿內(nèi)。在應(yīng)激因素或炎癥刺激下能被激活，其p65亞基從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)。因此細(xì)胞核中p65的含量是NF-κB激活的標(biāo)志[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，Tp0971作用巨噬細(xì)胞60 min后，可顯著誘導(dǎo)p65核轉(zhuǎn)位，采用TLR2中和抗體孵育后，p65核轉(zhuǎn)位明顯降低，這表明NF-κB的激活與Tp0971和TLR2的結(jié)合有關(guān)。隨后用NF-κB特異抑制劑PDTC預(yù)處理巨噬細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDTC可明顯抑制Tp0971誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。由此可見，Tp0971誘導(dǎo)IL-8、IL-6和IL-1β的分泌與TLR2/NF-κB通路的激活有關(guān)。

總之，本研究初步證實(shí)Tp0971能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，這可能是引起梅毒免疫病理損傷的基礎(chǔ)。同時發(fā)現(xiàn)Tp0971能夠活化TLR2/NF-κB途徑信號通路，并參與了IL-8、IL-6和IL-1β的分泌。但本研究發(fā)現(xiàn)即便采用siRNA或中和抗體、抑制劑處理均不能完全抑制細(xì)胞因子的分泌，這表明除了TLR/NF-κB通路外，還存在其他的受體介導(dǎo)的信號通路本研究是進(jìn)行Tp致病因子篩選的一個新嘗試，也初步表明Tp0971可能是Tp的毒力分子，結(jié)合其具有較好的免疫原性，因此在隨后的研究中我們將對其功能開展進(jìn)一步研究。

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[收稿2016-09-05 修回2016-11-15]

(編輯 張曉舟)

Treponema pallidum membrane protein Tp0971 induce macrophages to produce cytokines via TLR2/NF-κB pathway

ZHANGYue-Jun,JIANGChuan-Hao,LIULiang-Zhuan,JIANGZui-Ming,GUMin,WUYi-Mou.

CenterofClinicalLaboratoryofZhuzhouCentralHospitalofHu′nanProvince，Zhuzhou412007，China

Objective:To investigate the production of cytokines from macrophages induced by Treponema pallidum membrane proteins Tp0971.Methods: The Tp0971 was amplified by PCR from a preparation of T.pallidum genomic DNA and then sub-cloned into the prokaryotic expression vector pET28a(+)to construct the recombinant plasmid pET28a(+)/Tp0971.The recombinant plasmids were transfected into E.coli Rosseta strain to express recombinant protein Tp0971 by IPTG induction.The expression products were purified by Ni-NTA affinity chromatography,and the concentration was determinated by BCA method.Detoxi-Gel was used to remove endotoxin contamination in during the protein preparation.After induced by PMA,cells were incubated with various concentrations of recombinant proteins Tp0971.The expression levels of IL-8,IL-1β and IL-6 were detected by ELISA.Cells were pretreated with anti-TLR2 antibody or TLR2 siRNA,or pyrrolidine dithiocarbamate,an inhibitor of NF-κB,for evaluation of the role of TLR2 and NF-κB in the production of cytokines by ELISA.Results: Tp0971 gene were amplified successfully by PCR,and the recombinant plasmids were confirmed by enzyme digestion and sequencing.SDS-PAGE results showed three recombinant proteins were expressed as the soluble with a relative molecular weight of 29 kD.0.5-10 μg/ml of Tp0971 could stimulate macrophages to produce IL-8，IL-1β and IL-6 dose-dependently.After cells were pretreated with siRNA or neutralizing antibody targeting TLR2 or the PDTC,the Tp0971 induced protein expression levels of proinflammatory cytokines were significantly reduced in macrophages.Conclusion: Tp0971 induces macrophages to produce proinflamatory cytokines via TLR2/NF-κB pathway.

Treponema pallidum;Membrane protein;Cytokines;Toll like receptor 2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.007

①本文受湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃(B2013-134)資助。

張躍軍(1979年-)，男，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)方面研究，E-mail：xiaoyezhangjun@163.com。

及指導(dǎo)教師：吳移謀(1954年-)，男，碩士，教授，主要從事病原體致病機(jī)制、快速診斷與防治研究，E-mail：yimouwu@sina.com。

R377

A

1000-484X(2017)05-0668-05

②南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽421001。