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    液相色譜-質(zhì)譜法測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷含量

    2017-06-05 15:17:23李光河
    中國藥業(yè) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:丹溪甲苷屏風

    李光河

    (廣東省深圳市人民醫(yī)院藥學部,廣東 深圳 518020)

    ·檢驗檢測·

    液相色譜-質(zhì)譜法測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷含量

    李光河

    (廣東省深圳市人民醫(yī)院藥學部,廣東 深圳 518020)

    目的 建立測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷含量的液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。方法 待測樣品用0.1 mol/L NaOH甲醇溶液室溫靜置后超聲提取,色譜柱采用Agilent SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30);質(zhì)譜采用ESI源正離子-MRM模式下檢測,選擇離子對為807.2~627.4,流速為0.4mL/min。結(jié)果黃芪甲苷質(zhì)量濃度在5.1~76.5 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,平均回收率為99.42%,RSD=3.34%(n=6)。結(jié)論 該方法適用于測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷的含量,同時可為丹溪玉屏風顆粒質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。

    丹溪玉屏風顆粒;益母草堿;液相色譜-質(zhì)譜法;質(zhì)量標準

    丹溪玉屏風顆粒收載于部頒標準[1],由黃芪、白術(shù)(炒)、防風組方,具有益氣、固表、止汗的功效。方中黃芪善補氣、固表、止汗,為方中君藥。黃芪甲苷為黃芪的重要的活性成分,具有降壓、消炎、抗衰老、抗病毒、增強免疫力等作用[2-4],故測定黃芪甲苷對于丹溪玉屏風顆粒質(zhì)量標準的建立具有重要意義。由于皂苷類成分在紫外區(qū)下有末端吸收,目前,多采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)法測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷的含量[5]。本研究中參考文獻[6-7],建立液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷的含量,目的在于建立一個簡單、快速的定量方法,為丹溪玉屏風顆粒質(zhì)量標準的建立提高準確、可靠的依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Agilent 6410三重四極桿質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);超聲波儀(上海冠特超聲儀器有限公司);MS104S電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

    1.2 試藥

    丹溪玉屏風顆粒(云南白藥股份集團有限公司,批號為 ZAB1637,ZDB1611,ZGB1615);黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號為110781-201314,含量為95.8%);甲醇(色譜純,Sigma試劑公司);氫氧化鈉(分析純,天津大茂化學試劑廠);水為娃哈哈純凈水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 溶液制備

    對照品溶液:稱取黃芪甲苷對照品適量(以黃芪甲苷計10.2mg),精密稱定,置100m L容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成貯備液Ⅰ;從貯備液Ⅰ中吸取1.0 mL溶液,置100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成貯備液Ⅱ;從貯備液Ⅱ中吸取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,7.5mL溶液,置100mL容量瓶中,用甲醇稀釋制成系列對照品溶液Ⅰ-Ⅶ。

    供試品溶液:取丹溪玉屏風顆粒,研細,取約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶,加入含0.1mol/LNaOH的甲醇50m L,室溫靜置2 h后,稱重,超聲30min后放置,冷卻至室溫,稱重,以甲醇補足失重。于離心機中離心5min (轉(zhuǎn)速為 4 000 r/min),精密吸取上清液 1.0 m L置于100mL容量瓶,流動相定容,搖勻,微孔濾膜,即得。

    陰性對照品溶液:按處方比例取缺黃芪的其余藥味,制備缺黃芪的陰性樣品,按供試品溶液制備方法得陰性對照品溶液。

    圖1 高效液相色譜圖

    2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

    色譜柱:Agilent SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流動相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30);流速:0.4m L/min;柱溫:30℃;進樣量:20μL;分析時間:5.0 min。質(zhì)譜采用 ESI源正離子-MRM模式。離子對:807.2~627.4;霧化器壓力:35.0 psi;干燥氣流速:8.0 L/min;干燥氣溫度:450℃;毛細管電壓:4 000 V;四極桿溫度:100℃。在擬訂色譜條件下,陰性對照品溶液、對照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖1。可見,陰性對照品溶液對樣品測定無干擾。

    2.3 方法學考察

    線性關(guān)系考察:吸取系列對照品溶液各20μL,按擬訂色譜條件進樣,記錄色譜峰面積。質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標,進行線性回歸,得黃芪甲苷回歸方程 A=2.07×102ρ+2.47×102,r=0.999 4。結(jié)果表明,黃芪甲苷質(zhì)量濃度在5.1~76.5 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

    精密度試驗:吸取系列對照品溶液Ⅴ,在擬訂色譜條件下進樣分析。結(jié)果黃芪甲苷樣品峰面積分別為6 022.0,6 125.0,6 238.0,6 488.0,6 235.0,6 378.0,RSD為2.7%(n=6),表明儀器精密度較好。

    重復性試驗:取丹溪玉屏風顆粒2.0 g,精密稱定,按2.1項下方法制備供試品溶液6份,在擬訂色譜條件進行測定。結(jié)果黃芪甲苷含量分別為 70.81,71.76,70.24,71.42,68.85,68.41μg/g,RSD為2.0%(n=6),表明方法重復性較好。

    穩(wěn)定性試驗:稱取同一批丹溪玉屏風顆粒2.0 g,按供試品溶液制備方法制備溶液1份,置室溫條件下,分別于0,2,4,6,8 h時進樣分析。結(jié)果黃芪甲苷樣品含量分別為 72.52,73.29,68.85,73.23,70.30μg/g,RSD為2.8%(n=5),表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    加樣回收試驗:取已知含量供試品約1.0 g,精密稱定,分別加入貯備液Ⅰ0.7mL,依法制備成供試品溶液,進樣分析,測定回收率。結(jié)果見表1。

    2.4 樣品含量測定

    取丹溪玉屏風顆粒3批,每批3份,按2.2項制備供試品溶液,進樣分析,計算上述樣品的含量。結(jié)果見表2。

    3 討論

    3.1 LC-M S/M S法選擇

    由于黃芪甲苷在紫外區(qū)下有末端吸收,會影響含量測定的準確性。藥典中采用HPLC-ELSD法測定含量[5-8],但缺點是靈敏度低、信號不穩(wěn)定、重現(xiàn)性較差。參考文獻[9-13],選擇靈敏度較高、信號穩(wěn)定的LCMS/MS法測定黃芪甲苷的含量。在條件篩選中曾經(jīng)比較正、負離子模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用正離子模式較負離子模式黃芪甲苷的信號強,基線降低,故最終確定正離子模式測定。

    表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

    表2 丹溪玉屏風顆粒中黃芪甲苷含量測定結(jié)果

    3.2 流動相條件選擇

    由于質(zhì)譜條件選擇的是正離子模式,故流動相選擇甲醇作為有機相,因為甲醇中的羥基能給出1個氫離子,有助于黃芪甲苷的解離;同時在流動相中加入一定量的有機酸也能促使黃芪甲苷的解離,嘗試加入甲酸和乙酸,發(fā)現(xiàn)加入甲酸后黃芪甲苷色譜峰響應值高、柱效好,故選擇加入0.1%的甲酸??紤]到黃芪甲苷的極性后經(jīng)過調(diào)整,確定甲醇-0.1%甲酸水溶液(70∶30),黃芪甲苷保留時間在3.5min,整個分析時間控制在5min內(nèi),可大大地縮短分析時間。

    3.3 提取條件選擇

    自然界中黃芪甲苷單體在黃芪藥材中的含量較低,黃芪藥材中含量較高的成分為黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ等。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ經(jīng)過皂化反應脫去乙?;拍苻D(zhuǎn)化為黃芪皂苷,參考文獻[2,14-15]后,現(xiàn)在室溫條件下用含0.1 mol/L NaOH的甲醇50 mL,室溫靜置2 h,充分發(fā)生皂化反應后,再用超聲提取,皂化反應充分,提取率較高。同時,比較不同的堿化試劑,最后確定用0.1 mol/L NaOH皂化反應充分;比較超聲提取、加熱回流方法,最后發(fā)現(xiàn)超聲提取法簡便易操作,且提取率較高。故選用含0.1mol/LNaOH的甲醇50m L,室溫靜置2 h,充分發(fā)生皂化反應后,再用超聲提取。

    3.4 穩(wěn)定性考察

    僅考察了樣品處理后在室溫條件下放置8 h內(nèi)的穩(wěn)定性,原因為本試驗中方法學考察時間大約為7 h,所以本試驗中只考察了室溫放置8 h的穩(wěn)定性。樣品是否能在更長時間內(nèi)保持穩(wěn)定,本試驗中未進行繼續(xù)考察。

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    Content Determ ination of Astragaloside in Danxi Yuping Feng G ranu le by LC-M S/MS

    Li Guanghe
    (Department of Pharmacy,Shenzhen City People′s Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518020)

    Objective To establish an HPLC-MS/MS method for content determination of astragaloside in Danxi Yuping Feng Granule.M ethods The sample was tested by ultrasonic extraction with 0.1 mol/L NaOH methanol solution at room temperature after stewing, The chromatographic separation was achieved on a Agilent SB-C18column(150 mm×4.6 mm,5μm)with a mobile phase of methyl alcohol-0.1% formic aicd in water(70∶30).The flow rate was 0.4 m L/min.Results The calibration curve was linear within the range of 5.1-76.5 ng/mL for astragaloside.The recovery was 99.42%,RSD=3.34%(n=6).Conclusion The method is suitable for content determination of astragaloside,it can be used for the quality control of Danxi Yuping Feng Granule.

    Danxi Yuping Feng Granule;astragaloside;HPLC-MS/MS;quality standard

    2016-12-07;

    2017-01-22)

    10.3969/j.issn.1006-4931.2017.07.007

    李光河(1978-),男,大學本科,主管藥師,研究方向為醫(yī)院藥學,(電子信箱)jntj_zgd@163.com。

    R284.1

    A

    1006-4931(2017)07-0021-03

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