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    雄激素受體在大鼠睪丸中轉(zhuǎn)錄模式的分析*

    2017-06-05 15:03:01于泊洋劉陶迪
    關(guān)鍵詞:精母細(xì)胞精子發(fā)生雄激素

    于泊洋, 張 磊, 楊 錚, 劉陶迪

    (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室, 呼和浩特 010110)

    雄激素受體在大鼠睪丸中轉(zhuǎn)錄模式的分析*

    于泊洋, 張 磊, 楊 錚, 劉陶迪△

    (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室, 呼和浩特 010110)

    目的:研究Ar(雄激素受體)基因在大鼠睪丸組織中的轉(zhuǎn)錄模式。方法:取剛出生的雄性Wistar大鼠,于出生2~65日的不同時(shí)間點(diǎn),脊椎脫臼處死3只不同窩別的幼鼠,提取睪丸組織總mRNA;將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后采用Real-time PCR方法檢測(cè)大鼠睪丸組織中Ar mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果:Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值,第16天到第30天迅速下降,第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰后到第65天持續(xù)緩慢下降。結(jié)論:Ar基因在大鼠早期發(fā)育睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高,可能與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生相關(guān)。

    雄激素受體; 精子發(fā)生; 精原干細(xì)胞; 初級(jí)精母細(xì)胞; 大鼠

    androgen receptor; spermatogenesis; spermatogonial stem cells; primary spermatocyte

    【DOI】 10.12047/j.cjap.5467.2017.041

    據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì),10%的已婚夫婦患有不育癥,其中男性因素約占50%,其中因無精子癥或嚴(yán)重少精子癥所引起的男性不育占11.2%[1]男性不育癥已經(jīng)是人類生殖研究的重要課題。目前男性生殖醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究還無法滿足臨床診治的需求,因此必須大力加強(qiáng)生殖醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究, 以解決男性不育患者的臨床診治問題。導(dǎo)致男性不育的原因非常多,其中精子發(fā)生過程中基因缺陷可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用,男性不育癥的研究也深入到分子水平,研究精子發(fā)生分子機(jī)理是解決男性不育的重要分支[2]。

    睪丸是精子發(fā)生的場(chǎng)所,精子發(fā)生是由數(shù)量眾多的基因協(xié)同控制的復(fù)雜的細(xì)胞分化過程,這一過程的每一階段都受到眾多基因的共同作用。而根據(jù)Wrobel G等[3]研究結(jié)果顯示,大鼠睪丸的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程為:出生后0~8 d主要以精原干細(xì)胞的自我更新和分化為主;出生后14 d左右減數(shù)分裂開始,此時(shí)初級(jí)精母細(xì)胞出現(xiàn);出生20 d之后進(jìn)入圓形精子發(fā)生階段,第二次減數(shù)分裂剛剛完成,此時(shí)圓形精子首

    次出現(xiàn);出生35 d后完成圓形精子向長形精子的變形,成熟的精子出現(xiàn);出生56 d后大鼠性成熟,達(dá)到成年?duì)顟B(tài)[3,4]。

    Ar是近些年來生殖生物學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一, 體內(nèi)外形態(tài)與細(xì)胞水平研究結(jié)果表明, 該受體與精子發(fā)生密切相關(guān)[5-9]。AR屬于核受體超家族中的類固醇受體。AR一般由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(N transcription activation domain, NTD)、DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding domain,DBD)、鉸鏈區(qū)(hinge region,HJ)和配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain, LBD)。雄激素受體是雄激素作用的中介物質(zhì)。雄激素受體為分子量120 000道爾頓的蛋白質(zhì),在人體的X染色體的基因指導(dǎo)下合成,與雄激素結(jié)合的單聚體(4.4S)在細(xì)胞中與受體蛋白及一個(gè)產(chǎn)生9S無活性的小分子單聚體結(jié)合[6,10]。

    本研究選用2~65日齡的雄性大鼠睪丸組織,提取其總mRNA并反轉(zhuǎn)成cDNA,采用Real-time PCR進(jìn)行mRNA水平檢測(cè)Ar基因在大鼠睪丸組織中的表達(dá),為進(jìn)一步研究Ar在精子發(fā)生過程中的功能提供依據(jù), 并為進(jìn)一步對(duì)Ar相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及尋求解決方法提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑均購自大連寶生物公司,引物均由上海生物工程公司合成。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    購買育齡Wistar大鼠,將一只雄鼠與兩只雌鼠合籠(內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買),自然交配。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)樓分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),每周換墊料一次,保證飼料和飲水的清潔和充足。記錄鼠出生的具體時(shí)間。出生當(dāng)天計(jì)第一天。飼養(yǎng),足夠日齡后處死,立即取下睪丸組織樣品,立刻放入-80℃低溫冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 實(shí)驗(yàn)樣本采集

    以出生當(dāng)天計(jì)第一天,將出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日齡的雄性大鼠脊椎脫臼法處死,取睪丸組織立刻放入-80℃低溫冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩C總€(gè)時(shí)間點(diǎn)3只不同窩別的大鼠。

    提取組織總RNA,取約50 mg睪丸組織,加入裂解液1 ml,先加300 μl將組織剪碎,再加700 μl用一次無菌性注射器沖打混勻,充分裂解后,采用總RNA提取試劑盒(TIANGEN,DP419)按照使用說明書進(jìn)行操作。提取完成后分裝出2 μl用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度(Conc)和純度(A260∶A280比值),以A260/A280接近2.0為合格。將提取的各樣品總RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩R恢軆?nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

    1.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

    根據(jù)各樣品總RNA的濃度和純度值,將樣品稀釋成終體積為30 μ1,濃度為0.2 μg的稀釋液,取相同體積的各組樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl:A液10 μl:樣品總RNA 4 μl,Oligo(dT)(10 μmol/L)1 μl,Rnase-Free dH20補(bǔ)齊至10 μl;B液10 μl:5×M-MLV buffer 4 μl,dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μl,RNase Inhibiter(40 U/μl)1 μl,M-LV Reverse Transcriptase(5 U/μl)0.5 μl,RNase.Free ddH2O 2.5 μl。反應(yīng)條件為:A液65℃水浴5 min,將A液與B液混合,渦旋離心后,42℃水浴60 min,72℃水浴10 min。將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 Ar基因引物設(shè)計(jì)

    引物序列表見表1。

    Tab. 1 List of oligonucleotide primers

    1.6 Real-time PCR方法檢測(cè)Ar的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

    利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以1.0 μg RNA模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,分別取大鼠出生第2、4、6、8、l0、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天21個(gè)cDNA模板樣品進(jìn)行Ar基因的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè),使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)試劑盒說明及引物的條件設(shè)定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀上重復(fù)兩管。用GAPDH做內(nèi)參對(duì)照,用H2O做陰性對(duì)照。采用Ct方法分析Ar mRNA的表達(dá)量,結(jié)果用基因mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)表示,計(jì)算方法用2-△△Ct法,數(shù)據(jù)和圖表使用Microsoft Excel 分析[11]。

    2 結(jié)果

    2.1 Real-time PCR檢測(cè)Ar基因在三組不同窩別大鼠早期發(fā)育睪丸組織中mRNA水平的表達(dá)情況

    根據(jù)引物的溶解曲線可知,其特異性好(圖1 A,C)。擴(kuò)增曲線在PCR平臺(tái)期幾乎重合(圖1 B,D)。

    通過Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)到Ar基因在三組不同窩別的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睪丸組織中的表達(dá)模式(圖2),三組不同窩別的大鼠睪丸組織mRNA水平表達(dá)趨勢(shì)基本一致;第2~65天的大鼠睪丸組織mRNA表達(dá)差異明顯。Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值,在第16天到第30天迅速下降,第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰之后到第65天持續(xù)緩慢下降。其中出生第16天為大鼠睪丸組織Ar 基因mRNA表達(dá)峰值。

    Fig. 1 Dissolution profile and amplification curve of Ar and GAPDH A: Dissolution profile of Ar; B: Amplification curve of Ar; C: Dissolution profile of GAPDH; D: Amplification curve of GAPDH

    Fig. 2 The mRNA expression of cxcl6 gene in 3 different nest on post-natal days 2,4,6,8,10,12,14,15,16,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65

    3 討論

    在精子發(fā)生的整個(gè)過程中精原干細(xì)胞需通過3個(gè)階段成為成熟精子:第一階段,精原干細(xì)胞位于生精上皮的基底部,根據(jù)其命運(yùn)分為暗型精原細(xì)胞(dark type A,Ad)和亮型精原細(xì)胞A(pale type A, Ap)兩種不同的類型。在正常情況下,Ad型精原細(xì)胞僅發(fā)生有絲分裂進(jìn)行增殖而作為精原干細(xì)胞的儲(chǔ)備;而Ap型精原細(xì)胞一般分裂為兩個(gè)B型精原細(xì)胞,進(jìn)一步分裂增殖為次級(jí)精母細(xì)胞。第二階段,精母細(xì)胞經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂,第一次減數(shù)分裂后產(chǎn)生初級(jí)精母細(xì)胞。次級(jí)精母細(xì)胞在第二次減數(shù)分裂后變?yōu)閱伪扼w的圓形精子細(xì)胞。第三階段:圓形精子細(xì)胞經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化變化,細(xì)胞核發(fā)生聚縮和塑性,同時(shí)頂體和鞭毛形成,胞漿明顯擴(kuò)張,最終轉(zhuǎn)變?yōu)殚L形的成熟精子[12-14]??傊?,精子發(fā)生主要分為3個(gè)階段:精原干細(xì)胞的自我更新與分化階段,減數(shù)分裂階段和精子生成階段[15-17]。

    研究表明, Ar與男性精子生成障礙有密切關(guān)系[5-9], 精子發(fā)生的啟動(dòng)和維持需要依賴下丘腦一垂體一睪丸軸的功能。體內(nèi)環(huán)境下,睪酮通過Ar的介導(dǎo)直接作用于支持細(xì)胞發(fā)揮作用,當(dāng)Ar與配體結(jié)合后,空間構(gòu)象發(fā)生變化而發(fā)生活化,活化后的Ar以二聚體的形式與靶細(xì)胞核中的雄激素效應(yīng)元件結(jié)合,并使其轉(zhuǎn)錄因子相互作用,從而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),產(chǎn)生效應(yīng)[18]。但Ar在精子發(fā)生的哪些階段發(fā)揮作用及如何發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),出生后2~10 d為大鼠青春前期精原干細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期,出生15 d前后為大鼠精母細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期,出生30 d前后為大鼠圓形精子發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期[18]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)Ar基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表達(dá)模式的檢測(cè),可以看到,Ar基因在大鼠出生早期,轉(zhuǎn)錄水平是呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的,在我們的研究中,Ar mRNA表達(dá)在出生后第2天開始緩慢上升到第16天達(dá)到最高值,在第16天到第30天迅速下降,第31天出現(xiàn)一個(gè)小高峰之后到第65天持續(xù)緩慢下降。其中出生第16天為大鼠睪丸組織Ar 基因mRNA表達(dá)峰值。

    劉陶迪等[19]主要以出生第2天至第30天大鼠的睪丸組織為研究對(duì)象,研究精子發(fā)生早期相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)。對(duì)大鼠早期發(fā)育睪丸組織精子發(fā)生的基因進(jìn)行差異性表達(dá)分析,結(jié)果在大鼠出生后第6天至第10天期間,精原干細(xì)胞標(biāo)志性基因CDH1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著變化,表明該時(shí)期是大鼠精原干細(xì)胞的增殖分化的關(guān)鍵時(shí)期。Ar mRNA水平從出生第2~8天緩慢上升,這一時(shí)期為精原干細(xì)胞增殖期,可據(jù)此推測(cè)Ar在精原干細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮一定的作用。Ar mRNA水平的這種緩慢上升趨勢(shì)從第8天繼續(xù)持續(xù)到第16天,根據(jù)Wrobel G等的研究結(jié)果,這一時(shí)期為初級(jí)精母細(xì)胞的形成期,我們可以推測(cè)Ar可能參與初級(jí)精母細(xì)胞的生成過程。在第16天達(dá)到峰值后Ar mRNA水平開始下降,表明從第一次減數(shù)分裂以后,Ar在圓形精子的形成等過程中不再發(fā)揮明顯的作用。

    我們將Ar基因做mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的檢測(cè),3組不同窩別的Ar基因mRNA表達(dá)水平基本一致,隨著大鼠早期精子發(fā)生的進(jìn)行,2~65 d呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平,表達(dá)量的高低及對(duì)應(yīng)的出生時(shí)間點(diǎn)表明Ar基因可能參與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生。通過以上結(jié)果我們得到如下結(jié)論:(1)Ar基因表達(dá)與精子發(fā)生具有一定的相關(guān)性。(2)Ar基因在大鼠早期發(fā)育睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高,與精原干細(xì)胞的增殖及初級(jí)精母細(xì)胞的發(fā)生相關(guān)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究Ar在精子發(fā)生過程中的功能提供依據(jù), 并為進(jìn)一步對(duì)Ar相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及尋求解決方法提供依據(jù)。

    [1] Yuan L, Liu JG, Zhao J,etal. The murine SCP3 gene is required for synaptonemal complex assembly, chromosome synapsis, and male fertility[J].MolCell, 2000, 5(1): 73-83.

    [2] Horvath GC, Kistler MK, Kistler WS. RFX2 is a candidate downstream amplifier of A-MYB regulation in mouse spermatogenesis[J].BMCDeveBiol, 2009, 9: 63.

    [3] 夏小雨, 陳學(xué)進(jìn). 哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的特點(diǎn)[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2008, 5(1): 65-68.

    [4] Wojtasz L, Daniel K, Roig I,etal. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, two conserved meiotic chromosomal proteins,are depleted from synapsed chromosome axes with the help of TRIP13 AAAATPase[J].PLoSGenet, 2009, 5(10): e1000702.

    [5] Hughes IA, Davies JD, Bunch TI,etal. Androgen insensitivity syndrome[J]. Lancet, 2012, 380(9851): 1419-1428.

    [6] 楊 潔, 邱曙東. 雄激素受體基因CAG多態(tài)性對(duì)男性生殖系統(tǒng)疾病的影響[J]. 中國男科學(xué)雜志, 2005, 19(3): 62-64.

    [7] Hughes IA, Werner R, Bunch T,etal. Androgen insensitivity syndrome[J].SeminReprodMed, 2012, 30(5): 432-442.

    [8] Wallerand H, Remy-Martin A, Chabannes E,etal. Relationship between expansion of the CAG repeat in exon 1 of the androgen receptor gene and idiopathic male infertility[J].FertilSteril, 2001, 76(4): 769-774.

    [9] Tufan AC, Satiroglu-Tufan NL, Aydinuraz B,etal. No association of the CAG repeat length in exon 1 of the androgen receptor gene with idiopathic infertility in Turkish men: implications and literature review[J].TohokuJExpMed, 2005, 206(2): 105-l15.

    [10]Notini AJ, Davey RA, McManus JF,etal. Genomic actions of the androgen receptor are required for normal male sexual differentiation in a mouse model[J].JMolEndocrinol, 2005, 35(3): 547-555.

    [11]陳涵斌, 馬 駿, 李慧敏, 等. 鄰苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠對(duì)雄性仔鼠睪丸Leydig 細(xì)胞形態(tài)及功能的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2015, 31(2): 97-101.

    [12]陳大元. 受精生物學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 52-57.

    [13]Dym M. Spermatogonial stem cells of the testis[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1994, 91(24): 11287-11289.

    [14]Hecht NB. Molecular mechanisms of male germ cell dif-ferentiation[J].Bioessays, 1998, 20(7): 555-561.

    [15]Yu Z, Guo R, Ge Y,etal. Gene expression profiles in different stages of mouse spermatogenic cells during spermatogenesis[J].BiolReprod, 2003, 69(1): 37-47.

    [16]Lee TL, Pang AL, Rennert OM,etal. Genomic landscape of developing male germ cells[J].BirthDefectsResCEmbryoToday, 2009, 87(1): 43-63.

    [17]Cheng CY, Mruk DD. The biology of spermatogenesis: the past, present and future[J].PhilosTransRSocLondBBiolSci, 2010, 365(1546): 1459-1463.

    [18]Tan KA, De Gendt K, Atanassova N,etal. The role of androgens in sertoli cell proliferation and functional maturation: studies in mice with total or sertoli cell-selective ablation of the androgen receptor[J].Endocrinology, 2005, 146(6): 2674-2683.

    [19]Liu TD, Yu BY, Luo FH,etal. Gene Expression Profiling of Rat Testis Development During the Early Post-Natal Stages[J].ReprodDomestAnim, 2012, 47(5): 724-731.

    2016-06-27

    2016-12-14

    R73-3

    A

    1000-6834(2017)02-163-04

    △【通訊作者】Tel: 13848129859; E-mail: taodiliu@163.com

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