預熱處理對離心運動大鼠骨骼肌超微結構、血清CK、LDH及氧化應激的影響*

梁 健, 李煥春

(華南師范大學體育科學學院, 廣東 廣州 510631)

預熱處理對離心運動大鼠骨骼肌超微結構、血清CK、LDH及氧化應激的影響*

梁 健, 李煥春△

(華南師范大學體育科學學院, 廣東 廣州 510631)

目的：采用離心運動和熱處理研究預熱處理對離心運動大鼠骨骼肌的保護作用。方法：SD大鼠分安靜組(n=8)，運動組(n=32)和預熱處理運動組(n=40)，運動組運動完成后分為運動即刻組(E1)、運動后24 h組(E2)、運動后48 h組(E3)和運動后6 d(E4)組，熱處理組在4個周期熱處理后分熱處理安靜組(HE)、熱處理運動即刻組(HE1)、熱處理運動后24 h組(HE2)、熱處理運動后48 h組(HE3)和熱處理運動后6 d(HE4)組；運動采用-16°坡度、速度20 m/min、時間120 min的一次性離心力竭跑臺運動至力竭模型；預熱處理采用每4 d為一個周期, 3 d進行熱處理、1 d休息，共4個周期，期間濕度控制在50%，肛溫起始溫度從39±0.5℃，依次遞增到39.5±0.5℃、40.5±0.5℃和41.5±0.5℃，監(jiān)測大鼠直腸溫度達到預定值以后維持15 min。實驗后取血和骨骼肌，觀察骨骼肌超微結構和血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及氧化應激指標的變化。結果：預熱處理運動后不同時相血清CK、LDH值低于單純運動組，其中HE1及HE2組與同時相的E1、E2的CK值都呈顯著性差異(P<0.05)，HE1、HE2及HE3組的血清LDH值顯著低于同時相的E1、E2及 E3組(P<0.05)；HE2及HE3組的血清超氧化物歧化酶(SOD)值都分別高于同時相的E1、E2組，并且兩兩之間呈顯著性差異(P<0.05),HE2組的血清丙二醛(MDA)值顯著低于E2組(P<0.05)。結論：運動預熱處理對預防運動性骨骼肌損傷有一定作用。

預熱處理；大鼠；運動；骨骼肌；超微結構；氧化應激

preheat treatment; rat; exercise; skeletal muscle; ultrastructure; oxidative stress

【DOI】 10.12047/j.cjap.5505.2017.026

運動骨骼肌損傷在運動活動中非常普遍，其生理特征非常復雜，一直是國內外運動醫(yī)學界研究的重點。研究表明，高強度運動或者超過習慣負荷的運動都有可能導致出現(xiàn)骨骼肌損傷[1]，使骨骼肌超微結構發(fā)生變化，并伴隨著酶、血液氧化應激等生化指標的改變[3]。生物體會對加于它的任

何應激發(fā)生非特異性反應，并通過綜合性生理體征表現(xiàn)出來。研究表明，熱處理能誘導大鼠骨骼肌產生內質網應激反應并誘導大鼠骨骼肌功能發(fā)生適應性改變,有利于骨骼肌的保護[2]，這為預熱處理對運動性骨骼肌損傷的預防提供一種可能。目前預熱處理對運動骨骼肌損傷的研究少有報道，本文試圖研究預熱處理對大強度離心運動后大鼠骨骼肌超微結構、血清CK、LDH及其血清氧化應激變化影響，為預熱處理作為運動性骨骼肌損傷的預防措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

平均重量為140.25±12.34 g的清潔級雄性SD大鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，置于溫度為22±0.3℃，濕度50%～60%下清潔級動物房中喂養(yǎng)。所有動物自由飲食、飲水，適應性喂養(yǎng)3 d后進行隨機分組。大鼠分為安靜組(8只)、運動組(32只)及熱處理運動組(40只)，其中運動組隨機分為運動即刻組(E1)、運動后24 h組(E2)、運動后48 h組(E3)和運動后6 d(E4)組，每組8只，熱處理組在熱處理完成后隨機分為熱處理安靜組(HE)、熱處理運動即刻組(HE1)、熱處理運動后24 h組(HE2)、熱處理運動后48 h組(HE3)和熱處理運動后6 d(HE4)組，每組8只。

1.2 實驗方法

1.2.1 運動方案 運動方案采用一次性離心力竭跑臺運動模型。坡度設置為-16°，跑臺恒定速度20 m/min，運動持續(xù)時間120 min，直至運動力竭。運動后大鼠運動能力顯著下降，間歇次數(shù)明顯增多，不能再次完成運動，且運動后基本無逃避能力，呈明顯疲勞狀，表明符合離心力竭運動模型。

1.2.2 預熱處理的方法 大鼠置于恒溫桑拿環(huán)境中進行預熱處理,并實時監(jiān)測肛溫。熱處理每4 d為一個周期,其中3 d進行熱處理,1 d休息，共進行4個周期。熱處理期間濕度控制在50%，熱處理肛溫起始溫度從(39±0.5)℃，依次遞增到(39.5±0.5)℃、(40.5±0.5)℃和(41.5±0.5)℃，監(jiān)測大鼠直腸溫度達到預定值以后維持15 min。熱處理期間,嚴格控制溫度和濕度,并觀察大鼠行為。

1.2.3 實驗樣本的選取與測定方法 大鼠在完成運動和熱處理后按分組分別進行宰殺。采用7%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后腹主動脈取血。取血后立即置入抗凝管并分離血清，血清置于-70℃超冰箱中保存待用。取血后進行比目魚肌分離，所得比目魚肌按電鏡要求快速切取小塊肌組織，放入2.5%戊二醛4℃固定。比目魚肌經2.5%戊二醛4℃固定過夜后進過漂洗、固定、脫水、浸透、包埋、聚合等過程后，制成超薄切片。將制備好的電鏡標本置于HITACHI，H-7500透射電子顯微鏡下觀察、拍照。觀察內容主要為肌原纖維、肌節(jié)排列的規(guī)則程度，A帶、I帶完整情況和位置關系，Z線和內質網、線粒體的改變。血清CK、LDH采用酶動力進行測定，血清SOD通過黃嘌呤氧化酶法測試，MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行測試。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 實驗后大鼠骨骼肌超微結構的變化

運動后即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，但見部分肌原纖維有小的肌溶灶，Z線模糊，肌質網輕度擴張；肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖A)；運動后24 h大多數(shù)肌原纖維正常，肌原纖維具有排列整齊的Z線，但見部分肌原纖維有小的肌溶灶，Z線消失；肌膜連續(xù)，肌膜偶見線粒體堆積，且伴有嵴疏松變性(圖B、圖C)。運動后48 h大多數(shù)肌原纖維正常，肌原纖維具有排列整齊的Z線，但見部分肌原纖維呈水紋樣疏松變性；肌膜連續(xù)，肌膜偶見線粒體堆積，細胞核周圍有線粒體堆積(圖D、圖E)。

熱處理后運動即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)、肌膜連續(xù)，肌膜下偶見線粒體堆積，數(shù)量形態(tài)正常(圖F)。預熱處理運動后24 h后肌原纖維正常，肌膜下肌原纖維具有排列整齊的Z線，肌膜連續(xù)，肌膜下偶見線粒體堆積，數(shù)量形態(tài)正常，部分肌質網輕度擴張,肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖G，圖H)。電鏡觀察預熱適應運動48 h后，肌膜下線粒體堆積較少，可見糖原顆粒；肌細胞核正常；肌膜連續(xù)(圖I)。肌膜下線粒體堆積較少，肌細胞核正常；肌原纖維結構正常，具有排列整齊的Z線；肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖J)。

Fig. 1 The change chart of micro rat skeletal muscle after eccentric exercise(×10K) A: Exercise immediate group; B,C: 24-hour group after exercise; D,E: 48-hour group after exercise

Fig. 2 The change chart of micro rat skeletal muscle after prior heat treated and eccentric exercise(×10K) F: Preheated treatment and exercise immediate group; G,H: Preheated treatment exercise group after 24 hours; I,J: Preheated treatment exercise group after 48 hours

2.2 實驗后大鼠血清CK、LDH、SOD活性、MDA濃度的變化

預熱處理運動后HE1及HE2組的CK值都分別低于同時相的E1、E2組，并且兩兩之間呈顯著性差異(P<0.05)；HE1、HE2及HE3組的值分別顯著低于同時相的E1、E2及 E3組(P<0.05)；HE4值高于E4，但兩者之間無顯著性差異(表1)。

熱處理后運動即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)、肌膜連續(xù)，肌膜下偶見線粒體堆積，數(shù)量形預熱處理運動后不同時相血清SOD活性的變化，HE2及HE3組的值均明顯高于同時相的E2、E3組(P<0.05)，HE1及HE4組的值也分別高于同時相的E1、E4組，但沒有顯著性異性(表1)。

Tab. 1 The change of CK，LDH, SOD activity and MDA concentration comparison in different groups of rats between the exercise group and preheated exercise treatment group

C: Control group; E1: Exercise immediate group; E2: 24-hour group after exercise; E3: 48-hour group after exercise; E4: 6 d group after exercise; HE: Preheated treatment group; HE1: Preheated treatment and exercise immediate group; HE2: Preheated treatment and exercise group after 24 hours; HE3: Preheated treatment and exercise group after 48 hours; HE4: Preheated treatment exercise group after 6 d; CK: Creatine kinase; LDH: Lactic dehydrogenase; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05vsE1 group；?##P<0.01vsE2 group；?△P<0.05vsE3 group

3 討論

機體在熱應激下會產生內源性保護蛋白抵抗機體抗損傷能力。結果顯示，預熱處理運動組與單純運動組比較，預熱處理運動后24 h后肌原纖維正常，肌膜下肌原纖維具有排列整齊的Z線，僅部分肌質網輕度擴張。但是在熱適應運動48 h后，肌原纖維結構正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)，肌細胞核正常。預熱處理對運動性骨骼肌損傷具有一定的預防作用。其原因可能是機體在熱應激下會發(fā)生熱應激反應并產生熱體克蛋白，提高細胞抗損傷能力，并可以通過預期熱刺激，使機體預先獲得抗損傷的能力，提高細胞對應激的耐受性，從而減少細胞受損程度[3]。本實驗熱處理骨骼肌運動后的生理特征也證實這一觀點。實驗證明，熱應激產生的熱蛋白可以參與到細胞骨架和核骨架中，并且與核仁和細胞膜結合，使細胞結構變得更加穩(wěn)定，降低核仁和細胞膜對熱的敏感性，增強細胞的熱耐受力[4]，因此本實驗預熱處理離心運動后骨骼肌的超微結構改變，可能與應激蛋白穩(wěn)定骨架有關。

血液CK和LDH濃度與骨骼肌及細胞膜受損相關，血清CK、LDH活性的改變與運動強度時間以及運動方式密切相關，本結果證實這一特征。在預熱處理后再進行運動，發(fā)現(xiàn) HE1及HE2組CK 活性都分別低于E1、E2組，并呈顯著性差異(P<0.05)；而E1、HE2及HE3組LHD的活性也分別顯著低于同時相的單純運動組(P<0.05)。表明預熱處理可以對抗運動性疲勞或骨骼肌損傷對機體的影響。預熱處理對骨骼肌及細胞膜的保護作用，可能通過降低自由基，增強抗氧化機制來實現(xiàn)。其原理是預熱應激提高機體抗氧化酶活性，抑制自由基對細胞膜脂質過氧化，從而減輕骨骼肌組織結構的損傷,進而使CK和LDH釋放減少。結果顯示，預熱處理運動后不同時相血清SOD活性的變化，HE2及HE3組的值均明顯高于同時相的E2、E3組(P<0.05)，因此預熱處理預先可能提高骨骼肌抗氧化水平，有利于運動后骨骼肌自由基的消除，并在一定程度上可以防止運動性骨骼肌損傷。研究發(fā)現(xiàn)，預熱應激可以使大鼠心肌抗氧化酶Mn-SOD和熱休克蛋白72表達增加，與應激相關的HSP70在熱應激后高表達，而HSP70具有對組織缺血-再灌注損傷的保護作用，這種作用可能是通過SOD產生的增加而實現(xiàn)減少自由基對機體的損傷[5]。

預熱處理能提高骨骼肌抗氧化酶SOD活性，降低劇烈運動過程中脂質過氧化反應對骨骼肌影響，對于運動性骨骼肌損傷或延遲性酸痛的機制預防具有較強的實踐指導意義。由于熱應激機制的復雜性，熱處理預防干預運動性骨骼肌損傷應急機制還需做進一步研究。

[1] Butterfield TA, Herzog W. The magnitude of muscle strain does not influence serial sarcomere number adaptations following eccentric exercise [J].PtlugersArch, 2006, 451(5): 688-700.

[2] 李煥春，肖國強. 鈣網蛋白介導熱處理對大鼠骨骼肌適應性變化鈣調機制的研究[J]. 中國應用生理學雜志, 2013, 29(1): 38-41.

[3] Webster KA. Serine phosphorylation and suppression of apoptosis by the small heat shock protein α B-crystallin[J].CircRes, 2003, 92(2): 130-132.

[4] Martin J, Langer T, Boteva R,etal. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of groEL through a molten globule-like intermediate[J].Nature, 1991， 352(6330): 36-42.

[5] Bedirli A, Sakrak O, Muhtaroglu S,etal. Ergothioneine pretreatment protects the liver from ischemia-reperfusion injury caused by increasing hepatic heat shock protein 70[J].JSurgRes, 2004, 122(1): 96-102.

2016-10-11

2016-12-14

Q494

A

1000-6834(2017)02-102-03

△【通訊作者】Tel: 020-39310273; E-mail: li374@163.com