3種模擬中醫(yī)體征的體虛便秘大鼠模型建立及效果觀察*

杜麗東， 任 遠△， 牛亭惠， 吳國泰， 王志旺， 劉五州， 邵 晶

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 730000； 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000)

3種模擬中醫(yī)體征的體虛便秘大鼠模型建立及效果觀察*

杜麗東1，2， 任 遠1，2△， 牛亭惠1， 吳國泰1，2， 王志旺1，2， 劉五州1， 邵 晶1，2

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 730000； 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000)

目的：分別建立大鼠血虛、陰虛和陽虛便秘模型并比較其結腸動力、結腸水代謝、結腸黏液分泌和結腸水通道蛋白2(AQP2) 的表達水平。方法:40只SD大鼠，雌雄各半，隨機分為4組(n=10)：正常對照組(N)、血虛便秘組(XC)、陰虛便秘組(YC)、陽虛便秘組(YAC)。分別采用放血+洛哌丁胺、甲狀腺素+洛哌丁胺、冰水刺激+洛哌丁胺建立血虛便秘、陰虛便秘、陽虛便秘大鼠模型，放血每周1次，藥物每天灌胃1次，連續(xù)42 d。檢測大鼠活動狀態(tài)、體質量、大便性狀、口肛傳輸時間、小腸推進率、糞便和結腸含水量等體征指標，對結腸組織進行AB-PAS染色和免疫組化染色，觀察黏液分泌情況和AQP2表達水平。結果：與正常對照組比較，3種模型大鼠體重增長減慢；造模第40 天自主活動量變化率由大到小依次為YC、XC和YAC；造模第30 天出現(xiàn)固體硬質糞便，糞便評分升高順序為XC、YC和YAC；口肛傳輸時間均顯著延長、小腸推進率均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，腸動力減低順序為YC、YAC和XC；糞便含水量均顯著減少(P<0.05，P<0.01)，XC和YAC組大鼠結腸含水量顯著減少(P<0.05，P<0.01)，YC大鼠結腸含水量有減少趨勢，結腸水代謝順序為YC、YAC和XC；3種模型大鼠結腸黏膜層腺管和杯狀細胞出現(xiàn)不同程度縮小，黏液分泌減少，分泌功能障礙順序為YAC、YC和XC，且近端和遠端結腸AQP2的表達均顯著增加(P<0.05，P<0.01)，增加順序近端結腸為YAC、YC、XC，遠端結腸為YAC、XC和YC。結論：復合因素長期刺激均可建立符合中醫(yī)體征的便秘大鼠模型，且各模型大鼠結腸運動、結腸水代謝、結腸黏液分泌和AQP2表達水平存在一定的差異。

便秘模型；腸動力、結腸水代謝、結腸黏液分泌；水通道蛋白2 (AQP2)

【DOI】 10.12047/j.cjap.5479.2017.036

便秘是多種原因引起臨床常見疾病，也是許多疾病的臨床癥狀之一，嚴重影響患者的生活質量。中醫(yī)臨床將便秘分為實秘(包括熱秘、氣秘、冷秘)和虛秘(包括血虛秘、陰虛秘、陽虛秘)，其中虛秘居多[1]。目前，便秘動物模型的研究分別依據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學理論和中醫(yī)理論進行探索性復制，多采用洛哌丁胺、復方地芬諾酯、大黃、小檗堿、硫糖鋁、嗎啡等具有抑制胃腸運動的藥物導致糞便干澀、排出困難建立基于現(xiàn)代醫(yī)學理論的便秘動物模型；依據(jù)中醫(yī)理論建立的便秘動物模型有失水燥結型、冰水寒積型、實熱型、陰虛血瘀型、脾虛型和血虛型等[2]。便秘動物模型建立方法多樣，但模型制作使用藥物、制作周期不一，模型成功判斷缺乏深度，符合中醫(yī)虛癥研究多集中在療效觀察。本研究采用主要致病因素(慢性失血、甲狀腺素、冰水刺激)聯(lián)合胃腸動力抑制劑洛哌丁胺復制血虛便秘、陰虛便秘、陽虛便秘大鼠模型，并比較其結腸運動、結腸水代謝、結腸黏液分泌和結腸水通道蛋白2(aquaporin-2，AQP2)表達水平的差異，為探索符合中醫(yī)體征的體虛便秘動物模型研究和相關潤腸通便中醫(yī)藥藥效學研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

鹽酸洛哌丁胺膠囊，批號：150623441，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)；過碘酸-雪夫(AB-PAS)染色試劑盒，批號：20150928，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；水通道蛋白2(AQP2)免疫組化試劑盒，批號：D-B1-07C17B，北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)；水合氯醛，批號：20150120，天津市致遠化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器

AU5400型全自動生化分析儀(日本Olympus)，BX51-32H01型顯微鏡(日本Olympus)，DL-5M型臺式離心機(湖南新科科學儀器有限公司)，BS110型電子天平(德國 Sartorius)。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格

證號SCXK(甘)2011-0004。自由攝食、飲水，喂食標準飼料(由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)；飼養(yǎng)溫度：20～24℃，相對濕度：50%～60%。

1.4 分組、造模及給藥

SD大鼠40只，雌雄各半，適應性飼養(yǎng)3 d后，按性別體重隨機分為正常對照組、血虛便秘組、陰虛便秘組、陽虛便秘組，共4組，每組10只，單籠飼養(yǎng)。參照文獻[3-6]方法，血虛便秘組大鼠分別于造模第1、8、15 天用75%酒精擦拭尾部使血管充血，剪去尾尖0.2～0.3 cm，將傷口浸入40℃溫水中，使大鼠失血約2 ml，第22、29、36 天眼眶靜脈叢放血，每次約2 ml；陰虛便秘組大鼠灌胃甲狀腺素片混懸液20 mg/kg；陽虛便秘組大鼠灌胃0℃生理鹽水20 ml/kg，各造模大鼠均灌胃洛哌丁胺10 mg/kg，正常對照組大鼠灌胃等容量生理鹽水，給藥容積10 mg/kg，每天1次，連續(xù)42 d。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般狀態(tài) 實驗期間觀察各組大鼠活動、精神狀態(tài)、毛色、糞便數(shù)量和形狀、尿量和尿液顏色。

1.5.2 體質量 分別在造模前和造模第10、20、30、40天稱體質量，計算每10 d的體質量變化量，判斷各組大鼠體重增長趨勢。

1.5.3 自主運動量[7]自制敞箱(高60 cm，長50 cm，寬80 cm，周壁為黑色，白色地面用黑線劃分為12 cm×12 cm的方塊)，在黑暗的、安靜的房間進行。敞箱中央上方1 m處懸掛1個100 W燈泡。造模第10、20、30、40 天將每只大鼠置于敞箱的中央，以大鼠5 min內(nèi)穿越地面方塊數(shù)作為水平運動得分，以5 min內(nèi)直立次數(shù)為垂直運動得分，水平運動得分加垂直運動得分表示大鼠的運動量，每只大鼠測定一次。

1.5.4 排便評分 分別在造模前和造模第10、20、30、40 天，在直徑60 cm的圓盆中盛滿水(水溫10±1 ℃)，水中央放置直徑10 cm的柱形平臺，平臺面高出水面約1 cm，將各組大鼠置于平臺上，觀察每只大鼠2 h 內(nèi)排便情況，定形糞便記錄粒數(shù)，不定形或稀便記錄排便次數(shù)；并累積記錄各大鼠2 h內(nèi)糞便的評分。泄瀉稀便計0分，軟便不定形計1分，軟便定形計2分，固體定形計3分。

1.5.5 腸運動功能和結腸水代謝功能 第40天給藥1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各組大鼠灌胃5%炭末糊2.0 ml/只，記錄每只大鼠首粒黑便排出時間；并收集給炭末糊后12 h內(nèi)糞便，記錄粒數(shù)，稱濕重，60℃恒溫干燥箱干燥12 h，稱干重，計算糞便含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。第42天給藥

1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各組大鼠灌胃5%炭末糊2.0 ml/只，30 min后頸椎脫臼處死各組大鼠，開腹，取出小腸，分離系膜，鋪直，測量小腸全長(幽門至回盲部距離)及推進距離(幽門至炭末前沿的距離)，計算小腸推進率=炭末推進距離/小腸全長×100%。取結腸組織(距盲腸6 cm處)2 cm，稱濕重，60℃恒溫干燥箱干燥12 h，稱干重，計算結腸含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.6 結腸黏液分泌功能 取結腸組織(距盲腸4 cm處)2 cm，Carnoy氏固定液(無水乙醇60 ml，冰醋酸10 ml，氯仿30 ml)，石蠟包埋，常規(guī)切片，AB-PAS染色，200倍光鏡下觀察結腸黏液分泌情況。

1.5.7 結腸AQP2表達水平 分別取各組大鼠近端結腸組織(距盲腸2 cm處)和遠端結腸組織(距肛門2 cm處)2 cm，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，免疫組化染色，400倍光鏡下觀察陽性染色情況，使用成都泰盟BI-2000醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)，計算陽性信號的平均積分光密度(integrated optical density，IOD)和平均光密度(optical density，OD)。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般狀態(tài)

正常對照組大鼠反應靈敏，皮毛光澤較好，糞便形狀規(guī)則，質稍硬，互不黏連，與正常對照組比較，血虛便秘大鼠均出現(xiàn)蜷縮，喜臥，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳廓、鼻唇蒼白；陰虛便秘大鼠躁動不安，多動好斗，豎毛、皮毛光澤度差，尿液顏色較深；陽虛便秘大鼠蜷縮，萎靡，體毛枯疏，光澤度差，尿量增多。3種體虛便秘大鼠在20 d后糞便逐漸成形變硬。

2.2 造模對大鼠體質量增長的影響

造模前、造模20 d各組大鼠體重增長無差異，隨著造模時間延長，各造模組大鼠體重增長減慢，與正常對照組比較，造模第30 天，血虛便秘組和陰虛便秘組大鼠體重增長顯著減慢(P<0.05)，造模第40 天，3種體虛便秘模型大鼠體重增長均顯著減慢(P<0.05，P<0.01，表1)。

2.3 造模對大鼠自主活動量的影響

與正常對照組比較，血虛便秘組大鼠造模20 d后自主活動量開始減少，第40 天差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰虛便秘組大鼠隨著造模周期延長，自主活動量逐漸增多，第30、40 天顯著增多(P<0.05，P<0.01)；陽虛便秘組隨著造模周期延長，自主活動量有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第40天自主活動量變化率由大到小依次為陰虛便秘組、血虛便秘組和陽虛便秘組(表2)。

2.4 造模對大鼠大便評分的影響

與正常對照組比較，3組造模大鼠在造模10、20 d均出現(xiàn)稀便，糞便總評分明顯降低(P<0.05，P<0.01)，造模第30 天糞便逐漸成形，出現(xiàn)定形軟便和固體糞便，造模第40天為固體定形糞便；與造模第10、20 天比較，糞便評分升高，但與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

Tab. 1 The comparison of body weight in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab. 2 The comparison of autonomic activities in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab. 3 The comparison of total feces scores of stool characteristics in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.5 造模對大鼠腸運動功能和結腸水代謝功能的影響

與正常對照組比較，血虛便秘組、陰虛便秘組和陽虛便秘組大鼠口肛傳輸時間均顯著延長、小腸推進率均顯著降低 (P<0.05，P<0.01)；腸動力減慢順序依次為陰虛便秘組、陽虛便秘組、血虛便秘組。3種模型大鼠糞便含水量均顯著減少(P<0.01)，血虛便秘組和陽虛便秘組大鼠結腸含水量顯著減少(P<0.05，P<0.01)，陰虛便秘組大鼠結腸含水量有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；結腸水代謝功能降低順序依次為陰虛便秘組、陽虛便秘組、血虛便秘組(表4)。

Tab. 4 The comparison of intestinal transport and water metabolism in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.6 造模對大鼠結腸黏液分泌的影響

大鼠結腸黏膜層可見AB或PAS染色陽性的黏液，杯狀細胞呈空泡狀，胞質內(nèi)和大腸腺腺腔內(nèi)的酸性黏液顯藍色，中性黏液顯紅色，混合黏液顯紫色。正常大鼠結腸黏膜層上皮細胞和杯狀細胞形態(tài)飽滿、圓潤，黏液分泌豐富，黏膜表面覆蓋有混合性黏液；血虛便秘組、陰虛便秘組和陽虛便秘組大鼠黏膜層上皮細胞和杯狀細胞出現(xiàn)不同程度縮小，黏液分泌減少，黏膜表面黏液覆蓋減少或者無黏液覆蓋(圖1)。

Fig. 1 The comparison of colon mucus secretion in rats (AB-PAS staining，×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

2.7 結腸AQP2表達

近端和遠端結腸粘膜上皮細胞胞質和胞膜上均有AQP2陽性表達。與正常對照組比較，3組模型大鼠近端和遠端結腸AQP2的表達水平均增加，其中近端結腸OD和IOD值均顯著增高(P<0.01)，增加順序為陽虛便秘組、陰虛便秘組、血虛便秘組；遠端結腸OD值顯著增高(P<0.05，P<0.01)，IOD值增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，增加順序為陽虛便秘組、血虛便秘組、陰虛便秘組，遠端結腸組織AQP2增加程度大于近端結腸組織(圖2、3，表5)。

Fig. 2 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in proximal colon in rats among groups (Immunohistochemical staining ×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

Fig. 3 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in distal colon in rats among groups (Immunohistochemical staining ×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

Tab. 5 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in proximal and distal colon in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

隨著人們生活節(jié)奏日漸加快，飲食結構的改變，精神和心理因素的影響，便秘的患病率增加，且隨年齡增長而升高，嚴重影響人們生活質量[8]。中醫(yī)學認為[9-10]血虛津枯，則不能下潤大腸，致大便干燥，排出不暢；下焦陰虛，則精血枯燥，津液不到而腸臟干槁；久病及腎、脾腎陽虛，腎司二便，則大便艱澀，排出困難，腹中冷痛，喜熱怕冷，腰膝酸軟。本研究采用復合因素復制3種虛癥便秘模型，失血法符合中醫(yī)血虛便秘的病因之一血的持久過度的損耗，血的滋潤和營養(yǎng)減弱，致全身血虛，腸失濡養(yǎng)，使腸壁枯衰，傳導乏力；甲狀腺素法[11]模擬臨床甲狀腺功能亢進時怕熱、多汗、神經(jīng)過敏、急躁、震顫等類似于陰虛的現(xiàn)象；0℃冰水灌胃法[5]符合中醫(yī)過寒傷陽的陽虛便秘中醫(yī)病因理論；洛哌丁胺[6]是常用的止瀉劑，主要通過阻斷外周阿片受體、抑制鈣調蛋白的功能和電壓依賴性鈣離子通道抑制腸道平滑肌收縮，減少腸道蠕動及腸液分泌, 是常用來制作便秘模型的藥物。復制的血虛、陰虛、陽虛便秘動物模型分別出現(xiàn)蜷縮，喜臥，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳廓、鼻唇蒼白，活動減少的血虛體征；出現(xiàn)躁動不安，豎毛、皮毛光澤度差，尿液顏色變深、體重增長緩慢等陰虛體征；出現(xiàn)蜷縮，萎靡，體毛枯疏，光澤度差，尿量增多等陽虛體征；同時各組大鼠出現(xiàn)不同程度口肛傳輸時間延長，小腸推進率減慢，糞便干硬等便秘體征，同時結腸殘存糞便含水量和結腸含水量減少均減少。

結腸黏膜杯狀細胞分泌液富含粘蛋白，粘蛋白與水結合形成黏液，形成“黏液屏障”，此屏障對黏膜起機械性保護作用，同時黏液能夠潤滑黏膜表面，以利糞便運行。研究顯示[12]便秘時杯狀細胞萎縮，分泌黏液能力下降甚至喪失。本研究通過對結腸組織行AB-PAS染色，結果3種模型大鼠黏膜層上皮細胞和杯狀細胞出現(xiàn)不同程度縮小，黏液分泌減少，黏膜表面黏液覆蓋減少或者無黏液覆蓋。

水通道蛋白是一類位于細胞膜或細胞內(nèi)囊泡的能夠通透水的蛋白質分子家族，廣泛存在于哺乳動物的各種組織細胞中，在水的吸收、腺體的分泌和細胞內(nèi)外的水平衡等方面起到重要的生理作用。近年來，隨著對水通道蛋白研究的不斷深入，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn) 13 種水通道蛋白(AQP0- AQP12)，而在結腸表達的AQPs亞家族至少有7種，包括：AQP1、2、3、4、5、8，9，其中AQP2在遠端結腸[13-17]表達。AQPs 在便秘發(fā)病中的作用機制研究逐漸增多，許多學者認為AQPs在大腸內(nèi)的異常表達或者缺失，導致結腸對水分的吸收過度和(或)腸液分泌減少參與便秘的發(fā)生。研究顯示[18-19]結腸AQP2參與結腸水液調節(jié)，遠端結腸AQP2表達降低時，糞便含水量增加。本研究結果顯示3種體虛便秘模型大鼠近端和遠端結腸AQP2含量增加，糞便干結，提示結腸AQP2表達增多，可能使結腸水分重吸收增多而黏液分泌減少。

本研究建立的血虛便秘大鼠模型、陰虛便秘大鼠模型和陽虛便秘大鼠模型分別兼具血虛、陰虛、陽虛3種虛癥和便秘的體征。模型復制方法簡單可行，在目前沒有更好體現(xiàn)中醫(yī)病癥結合動物模型的情況下，可作為開展虛癥便秘的基礎研究和開發(fā)有效治療虛癥便秘藥物評價的動物模型。但該虛癥便秘模型未能反映中醫(yī)臨床因虛致秘的因果關系，還需進一步深入研究。

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Establishment and effect observation on three kinds of Ti-Xu with constipation rat models

DU Li-dong1,2， REN Yuan1,2△, NIU Ting-Hui1， WU Guo-tai1,2， WANG Zhi-wang1,2， LIU Wu-Zhou1， SHAO Jing1,2

(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2. Gansu Province Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To establish three types constipation models with the syndrome of Xue-Xu, Yin-Xu and Yang-Xu in rats, and to compare the difference of colonic motility, colonic water metabolism, colonic mucus secretion and the level of aquaporin-2 (AQP2). Methods: Forty Sprague Dawley rats, male and female in half, were randomly divided into four groups: normal control group(N), Xue-Xu with constipation group(XC), Yin-Xu with constipation group(YC) and Yang-Xu with constipation group(YAC). Bloodletting and loperamide were used to induce the Xue-Xu with constipation in rats, thyroxin and loperamide were used to induce the Yin-Xu with constipation in rats, ice-water stimulation and loperamide were used to induce the Yang-Xu with constipation in rats. Bloodletting was coducted once a week，drug was administrated orally to rats once a day for continuous 42 days．Rats’ state, body weights, stool character, transfer time between mouth and anal, small intestinal propulsion rate were measured. The colon tissues of rats were stained with alcian blue-periodic acid schiff (AB-PAS) to analyze the changes of mucus secretion. The aquaporin-2 expressions in proximal and distal colon of rats were measured by immunohistochemical method. Results: Compared to normal control group, weight-increasing speed of the rats were reduced in three models. The order of independent movement change was YC, XC and YAC. Solid stool appeared at 30 d, fecal scores were increased. Transfer time between mouth and anal was significantly extended, small intestinal propulsion rate were significantly decreased(P<0.05，P<0.01). Water content in stool were significantly decreased in three type models(P<0.05，P<0.01), the content of water in colon were decreased in XC and YAC group (P<0.05，P<0.01). The colonic gland and goblet cells were narrowed in some extent, the mucus excretion were decreased. The levels of aquaporin-2 expressions in proximal and distal colon of rats were increased(P<0.05，P<0.01), increasing order of AQP2 expression in proximal colon was YAC, YC and XC, increasing order of AQP2 expression in distal colon was YAC, XC and YC. Conclusion: Long term stimulation of complex factors could induce Ti-Xu with constipation animal model, and there were some differences in colonic motility, water metabolism, colonic mucus secretion and AQP2 in rats.

constipation model； intestinal motility； colonic water metabolism； colonic mucus secretion； aquaporin 2 (AQP2)

甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金項目(ZDSYS-KJ-2015-009，ZDSYS-ZZ-2015-002)；隴原青年創(chuàng)新人才扶持計劃項目(甘組電明字[2015]34號)；甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院基金項目(YWW-2015050)

2016-07-25

2016-11-28

R285.5

A

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