血必凈對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用*

羅 鵬, 周振興

(1. 天津市東麗醫(yī)院急診科, 天津 300300； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 北京 100010)

血必凈對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用*

羅 鵬1, 周振興2△

(1. 天津市東麗醫(yī)院急診科, 天津 300300； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科, 北京 100010)

目的：研究血必凈對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。方法：60 只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松(10 mg/kg)組與血必凈低、中、高劑量(5、10、15 ml/kg)組，每組10只。通過(guò)腹腔注射5 mg/kg內(nèi)毒素建立大鼠急性肺損傷模型，模型成功4 h 后腹腔注射給藥，每天1 次，連續(xù)7 d；正常對(duì)照組和ALI模型組靜脈注射等體積的生理鹽水。7 d后采集動(dòng)脈血，檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、血清丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)的活性；取肺組織，檢測(cè)肺系數(shù)(LI)、左肺濕/干質(zhì)量比(W/D)、肺含水率[(W-D)/W]，檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和高遷移率族蛋白-1 (HMGB1)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠LI、W/D、(W-D)/W, TNF-α和HMGB1蛋白表達(dá)以及血清MDA含量升高，PaO2， IL-10蛋白表達(dá)和血清SOD活性減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，血必凈低、中、高劑量組大鼠LI、W/D及(W-D)/W，TNF-α和HMGB1蛋白表達(dá)以及血清MDA含量降低，PaO2，IL-10 蛋白表達(dá)和血清SOD活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中血必凈高劑量組效果較好，與中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)。結(jié)論：血必凈能減輕對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，其藥理機(jī)制可能與下調(diào)TNF-α 和HMGB1蛋白表達(dá)和血清MDA水平和上調(diào)IL-10蛋白表達(dá)和血清SOD活性有關(guān)，且以高劑量組效果較好。

血必凈；內(nèi)毒素；急性肺損傷；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素10；高遷移率族蛋白-1

【DOI】 10.12047/j.cjap.5464.2017.034

急性肺損傷(the acute lung injury, ALI)是指各種直接或間接致傷因素引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的廣泛損傷，釋放多種炎癥介質(zhì)及氧自由基[1]，其中腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-10)在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2-3]。ALI是多器官功能障礙綜合征(MODS)的起始階段, 啟動(dòng)全身其他臟器損傷, 其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病死率高，早期防治ALI對(duì)預(yù)防MODS的發(fā)生發(fā)展具有重要意義[4]。經(jīng)過(guò)大量的臨床實(shí)踐證明，血必凈用于治療急性肺損傷患者效果滿(mǎn)意, 為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理, 本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腹腔注射LPS誘導(dǎo)急性肺損傷模型，并采用血必凈干預(yù)，觀察干預(yù)后肺組織中各種因子的變化，評(píng)價(jià)血必凈對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 儀器

I-STAT200血?dú)夥治鰞x(美國(guó)雅培公司生產(chǎn))；Microm HM315 型切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司生產(chǎn))；YB-6LF型包埋機(jī)(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司生產(chǎn))； Flexstation 3 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn))。

1.2 試劑

血必凈注射液(10 ml/支，天津紅日藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；內(nèi)毒素(LPS，美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn))；TNF-α、IL-10、 HMGB1羊抗多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；TNF-α、IL-10免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；MDA、SOD檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4 模型制備及分組

采用腹腔注射5 mg/kg LPS制備急性肺損傷大鼠模型。健康Wistar大鼠60 只隨機(jī)均分為6組，即正常對(duì)照組、ALI模型組、地塞米松(10 mg/kg)組與血必凈低、中、高劑量(5、10、15 ml/kg)組，每組10只。復(fù)制模型4 h后腹腔注射給藥，每天1 次，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組和ALI模型組靜脈注射等體積的生理鹽水。

1.5 動(dòng)脈氧分壓檢測(cè)

取主動(dòng)脈血0.5 ml，用肝素抗凝，迅速進(jìn)行血?dú)夥治?，檢測(cè)動(dòng)脈氧分壓(PaO2)。

1.6 血清MDA、SOD檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)最后一天給藥1 h后通過(guò)大鼠腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min分離血清，分別采用硫代巴比妥酸法和亞硝酸鹽法檢測(cè)血清中MDA含量和SOD活力。根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，按順序加入待測(cè)標(biāo)本和試劑，最后分別在532 nm和550 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定OD值，用提供的公式分別計(jì)算MDA濃度和SOD活力。

1.7 肺系數(shù)(LI)、肺濕/干質(zhì)量比(W/D)與肺含水率(W-D)/W

大鼠采血結(jié)束后，用剪刀剪開(kāi)胸腔，取出全部肺組織并用濾紙吸除肺表面的液體，稱(chēng)取肺組織質(zhì)量，計(jì)算肺系數(shù)[肺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10]。取大鼠左肺，稱(chēng)濕質(zhì)量后，置烤箱中，60℃連續(xù)烘烤48 h，取出稱(chēng)其干質(zhì)量，計(jì)算W/D[肺濕質(zhì)量(mg)/肺干質(zhì)量(mg)×100%]、肺含水率[(W-D)/W×100%]。

1.8 肺組織TNF-α、IL-10、HMGB1蛋白表達(dá)

留取右肺下葉組織用10%甲醛固定，常規(guī)脫蠟、水化、檸檬酸浸泡，標(biāo)本染色按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。所有切片放大倍數(shù)為40倍，每張切片隨機(jī)選取直徑為1 mm 的10 個(gè)視野進(jìn)行觀察，利用圖像分析軟件(LEICAQwin)測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)物相對(duì)含量的平均灰度值，以單位面積平均灰度作為參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血必凈對(duì)大鼠LI、W/D、肺含水率以及動(dòng)脈氧分壓的影響

與正常組相比，ALI模型組大鼠LI、W/D、肺含水率明顯增加，動(dòng)脈氧分壓明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ALI組比較，血必凈劑量組大鼠LI、W/D、肺含水率明顯降低，動(dòng)脈氧分壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與血必凈低劑量組比較，血必凈中、高劑量組大鼠LI、W/D、肺含水率明顯降低，動(dòng)脈氧分壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 血必凈對(duì)大鼠TNF-α、IL-10、HMGB1蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，ALI組大鼠肺組織TNF-α、HMGB1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ALI組相比，血必凈劑量組大鼠肺組織炎性因子TNF-α蛋白表達(dá)明顯減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與血必凈低劑量組相比，血必凈中、高劑量組大鼠肺組織炎性因子TNF-α蛋白表達(dá)明顯減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，表2)。

Tab.

LI: Lung index; W/D: Wet/dry weight ratio; (W-D)/W： Moisture content of lung; PaO2: The arterial oxygen tension

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsdexamethasone group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

GroupTNF-αIL-10HMGB1 Normal69.82±4.96113.70±4.7680.30±5.85Model116.05±3.78**75.40±2.01**122.40±4.55**Dexamethasone91.81±5.12##101.47±3.11##94.60±5.52##Low94.60±4.72##86.70±3.68##△△111.60±4.25##△△Middle80.28±6.90##△△▲▲90.70±2.71##△△92.60±4.45##▲▲High72.50±5.10##△△▲▲101.90±5.07##▲▲○○85.70±3.74##△△▲▲○○

TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-10: Interleukin-10; HMGB1: High mobility group protein B1

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsdexamethasone group;?▲P<0.05，▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

2.3 血必凈對(duì)大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

與正常對(duì)照組比較，ALI組大鼠血清SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與ALI組比較，血必凈劑量組大鼠血清SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血必凈低劑量組，血必凈中、高劑量組大鼠血清SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。

GroupSOD(U/L)MDA(nmol/ml)Normal101.06±3.562.65±0.18Model68.19±3.29**4.44±0.21**Dexametha-sone78.73±3.97##2.70±0.13##Low76.08±3.57##3.01±0.21##△△Middle83.91±1.70##△△▲▲2.86±0.17##△High90.37±4.76##△△▲▲◇◇2.63±0.10##▲▲○○

SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vsnormal group;?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsDexamethasone group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vslow dose group;?○○P<0.01vsmiddle dose group

3 討論

革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分是LPS，其所致敗血癥是導(dǎo)致ALI 的常見(jiàn)原因。大鼠通過(guò)腹腔注射、靜脈注射、氣管滴注輸入的方式給予LPS能夠造成大鼠ALI模型[5-6]。本研究中，大鼠腹腔注射內(nèi)毒素以后，肺組織LI、W/D 及肺含水率等指標(biāo)明顯升高，提示明顯肺水腫的病理改變；動(dòng)脈血氧分壓降低，說(shuō)明肺功能受損，急性肺損傷模型復(fù)制成功。

ALI主要表現(xiàn)為肺微血管通透性增高，導(dǎo)致肺水腫的產(chǎn)生和透明膜的形成,同時(shí)伴有肺間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生[7]。本結(jié)果顯示, 大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后,肺含水量增加和動(dòng)脈血氧分壓降低。

近年來(lái)研究表明，HMGB1是一種核內(nèi)蛋白，是內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷的晚期重要的炎癥介質(zhì)。HMGBl致病作用的另一大特點(diǎn)是對(duì)炎癥具有維持和放大作用。細(xì)胞受到感染因素或非感染因素的刺激，可主動(dòng)或被動(dòng)釋放HMGB1。HMGB1通過(guò)與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及TLR4，2 結(jié)合， 將信號(hào)傳到細(xì)胞外環(huán)境。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可被分泌到胞漿乃至胞外，可與TNF-α等重要炎癥因子相互誘生，引起炎癥信號(hào)分子NF-κB 的核移位。抗HMGB1抗體對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷、膿毒癥均有積極的治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn), 內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、HMGB1 蛋白表達(dá)明顯增加，而IL-10明顯降低；血必凈治療能明顯降低TNF-α, HMGB1的蛋白表達(dá),升高IL-10的蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥因子的生成,減輕肺臟的炎癥反應(yīng)。說(shuō)明血必凈可以通過(guò)降低TNF-α、HMGB1等炎性反應(yīng)因子的蛋白表達(dá)水平、增強(qiáng)抗炎因子IL-10 的蛋白表達(dá)水平，重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡，抑制急性肺損傷的發(fā)展。

肺受到損傷時(shí)，肺組織內(nèi)氧自由基大量增加，機(jī)體同時(shí)啟動(dòng)自身的抗氧化系統(tǒng)，抵御氧自由基的過(guò)量損傷，若機(jī)體抗氧化系統(tǒng)機(jī)能低下，急性肺損傷則迅速發(fā)展，這一事實(shí)已為人們所公認(rèn)[8]。正常機(jī)體，氧化-抗氧化酶系統(tǒng)保持相對(duì)的平衡。各種損傷因素可以導(dǎo)致氧自由基的過(guò)多釋放，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的MDA， 檢測(cè)大鼠血清中MDA 可以反映機(jī)體氧自由基產(chǎn)生的速度和強(qiáng)度[9]。SOD是機(jī)體清除氧自由基最重要的酶之一[10-11]，檢測(cè)大鼠血清中SOD水平可以反映機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的能力。結(jié)果顯示，模型組血清SOD 活性與正常組相比明顯降低，血必凈劑量組與模型組相比，大鼠血清SOD活力明顯升高，說(shuō)明血必凈有抵抗氧自由基損傷的作用。文獻(xiàn)報(bào)道血必凈注射液對(duì)應(yīng)激性臟器損傷具有良好的保護(hù)作用，同時(shí)可通過(guò)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善器官超微結(jié)構(gòu)的損傷[12-13]。本研究中，急性肺損傷大鼠給予血必凈注射液治療后，可顯著降低大鼠的MDA 水平， 升高SOD活力，提示血必凈注射液對(duì)內(nèi)毒素引起的氧自由基損傷具有修復(fù)作用，其抗氧化作用可能與抑制MDA 的釋放和升高SOD活性有關(guān)。

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Protective effects of xuebijing on the acute lung injury in rats

LUO Peng1， ZHOU Zhen-xing2△

(1. Emergency Department of Tianjin Dongli Hospital， Tianjin 300300； 2. Department of Clinical Laboratory, Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100010, China)

Objective: To investigate the protective effects of xuebijing (Traditional Chinese Medicine)on the acute lung injury in rats. Methods: Sixty Wistar rats were randomly divided into normal control group，model group，dexamethasone (10 mg/kg) group, xuebijing low-dose，medium-dose and high-dose groups(5, 10, 15 ml/kg)，10 rats in each group. The acute lung injury model was induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide 5 mg/kg. They were given relevant medicines intraperitoneally after modeling，once a day，for consecutive 7 days. Normal control group and acute lung injury(ALI) model group were given the equal bulk of saline by tail vein. 7 days after treatment, the arterial blood samples were collected for detecting the arterial oxygen tension (PaO2) and the serum levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD). Pulmonary tissue samples were obtained for the measurement of lung index(LI), wet/dry weight ratio(W/D), moisture content of lung [(W-D)/W] and the expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-10 (IL-10) and high mobility group protein B1(HMGB1). Results: Compared with normal control group，the levels of LI，W/D，(W-D)/W and PaO2and the expressions of TNF-α, HMGB1 protein and the serum level of MDA in model group were increased，while the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD were decreased；there was statistical significance(P<0.01). Compared with model group，the levels of LI，W/D，moisture content of lung and the protein expressions of TNF-α and HMGB1 and the serum level of MDA in xuebijing groups were decreased significantly，while PaO2and the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD were increased, there was statistical significance (P<0.01).The effects in xuebijing high-dose group were better than those in xuebijing middle-dose and low-dose groups (P<0.01,P<0.05), Conclusion: Xuebijing could alleviate lipopolysaccharide-induced ALI，and its pharmacological mechanism may be related to down-regulation the protein expressions of TNF-α and HMGB1 and the serum level of MDA and up-regulation the protein expression of IL-10 and the serum level of SOD and the high-dose is more effective.

Xuebijing injection; lipopolysaccharide; acute lung injury; TNF-α; IL-10; HMGB1

2016-06-16

2016-12-08

R563

A

1000-6834(2017)02-132-04

△【通訊作者】Tel: 18201048920; E-mail: zzx0406@126.com