間歇運動對卵巢切除大鼠脊髓背角內(nèi)嗎啡肽2表達的影響

趙曉慧

間歇運動對卵巢切除大鼠脊髓背角內(nèi)嗎啡肽2表達的影響

趙曉慧

目的：探討間歇運動對卵巢切除（ovariectomized，OVX）大鼠脊髓背角內(nèi)嗎啡肽2（endomorphin-2，EM-2）表達的影響。方法：體重180～200 g雌性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組（Sham）、卵巢切除安靜組（OVX）、卵巢切除+間歇運動組（OVXex），每組8只。建立模擬女性絕經(jīng)后狀況的卵巢切除模型，OVXex采用小動物跑臺進行7周間歇訓(xùn)練。每周訓(xùn)練結(jié)束后次日，對各組大鼠進行熱異常痛行為學(xué)檢測，評定大鼠卵巢切除后的痛敏狀況；7周訓(xùn)練結(jié)束后次日取腰膨大處脊髓背角，切片并進行EM-2免疫組織化學(xué)染色，檢測其表達。結(jié)果：卵巢切除引起了明顯的熱異常痛敏，同時EM-2表達明顯降低。間歇運動可有效改善熱異常痛敏，同時上調(diào)脊髓EM-2的表達。結(jié)論：間歇運動可顯著增加脊髓背角EM-2的表達，減弱卵巢切除引起的熱異常痛敏。運動干預(yù)卵巢切除所引起的脊髓背角EM-2表達和熱痛行為學(xué)反應(yīng)的改變，將為絕經(jīng)后女性的異常性痛敏提供治療的新思路。

間歇運動；卵巢切除；脊髓背角；內(nèi)嗎啡肽2；熱異常痛敏；絕經(jīng)期

對于疼痛敏感性和疼痛應(yīng)答來說，性激素（尤其是雌激素）是一種決定性的因素［11，12，20］。女性絕經(jīng)期雌激素減少的極端狀態(tài)與疼痛有著密切的關(guān)聯(lián)［15，19］。與正常女性相比，絕經(jīng)期女性中報道的疼痛幾乎是她們的2倍［2］。在絕經(jīng)期相關(guān)疼痛治療中，激素替代療法是一種臨床常用的鎮(zhèn)痛療法。然而，這種療法有著不可忽視的副作用，例如，使接受治療的患者遭受各種疼痛的困擾［13，17，21］。運動療法在預(yù)防及緩解骨質(zhì)疏松癥狀療法中占據(jù)一個很重要的位置［1］，而運動療法能否緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的熱異常疼痛鮮見研究。在本研究中，我們采用雌鼠雙側(cè)卵巢切除（ovariectomized，OVX）模型，模擬女性絕經(jīng)期后狀態(tài)，觀察大鼠的熱異常痛行為學(xué)變化，并通過對脊髓內(nèi)嗎啡肽2（endomorphin-2，EM-2）表達水平的檢測，來探討其與OVX熱異常痛行為學(xué)反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，通過對OVX大鼠進行間歇性運動訓(xùn)練，探討運動療法對OVX致熱異常痛敏以及腰膨大處脊髓背角（Spinal dorsal horn，SDH）EM-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要試劑：EM-2多克隆抗體（美國Chemicon），DAB顯色試劑盒（武漢博士德）。

主要儀器：冷凍切片機（德國Kryostat 1720），BX-51奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，TC-1型疼痛反應(yīng)測試儀（西安博邦化工）。

1.2 大鼠分組與OVX模型建立

采用清潔級雌性SD（Sprague Dawley，SD）大鼠（購于西安交通大學(xué)實驗動物管理中心，動物質(zhì)量合格證號：陜醫(yī)動證字08-004），體重180～200 g。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食飲水，環(huán)境溫度22 ℃±1 ℃，濕度在55% ± 10%之間，12 h的晝夜節(jié)律（7：00～19：00開燈)。大鼠適應(yīng)環(huán)境3天后，隨機分為假手術(shù)組（Sham）、卵巢切除安靜組（OVX）、卵巢切除+間歇運動組（OVXex），每組8只。各組大鼠行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。

OVX模型建立：手術(shù)依照文獻中的操作方法進行［22］，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，i.p.）腹腔注射麻醉，剪去大鼠中下背部被毛，取俯臥位于手術(shù)臺。切口處常規(guī)碘伏消毒，大鼠肋弓與脊椎邊緣夾角位置稍向下1 cm做與脊柱平行切口，向兩側(cè)分離皮膚、筋膜及肌肉，并于腹后壁肌肉層較薄弱處打開腹腔，切口長約1 cm，切口處暴露卵巢。用鑷子牽起脂肪組織尋找卵巢，成熟卵巢為淡紅色桑葚狀，略大于綠豆，與子宮相連。以無齒鑷探入腹腔將卵巢輕輕提出體外，小號止血鉗夾閉卵巢與子宮相連部位，0號手術(shù)線結(jié)扎并以眼科剪移除卵巢，去掉止血鉗并依次縫合肌肉層、皮膚層。同法去掉另一側(cè)卵巢。假手術(shù)組暴露卵巢但不去除。

1.3 運動方案

方案依照文獻中操作方法進行［2］，OVXex組大鼠在OVX手術(shù)1周后開始動物跑臺訓(xùn)練。訓(xùn)練起始負(fù)荷為10～15 m/min，30 min/天 × 5天/周，之后遞進式訓(xùn)練。準(zhǔn)備活動為10 m/min × 10 min；正式運動：25 m/min × 7 min和15 m/min × 3 min依次交替，訓(xùn)練持續(xù)60 min/天 × 5 天/周× 7 周。

1.4 大鼠的熱異常痛行為學(xué)檢測

每周訓(xùn)練結(jié)束1天后上午進行。實驗采用雙盲法進行，測試部位為大鼠的后足。應(yīng)用改進的Hargreaves法，以TC-1型疼痛反應(yīng)測試儀進行熱刺激測試［22］，出現(xiàn)縮足逃避反射所用時間即為熱刺激反應(yīng)潛伏期（Paw withdrawal thermal latency，PWL）。單次時間大于40 s而動物無反應(yīng)則停止照射，以免造成組織損傷。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測脊髓EM-2表達

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg，i.p.）麻醉，以500 mL含4%多聚甲醛和2%飽和苦味酸的0.1 mol/L PB（pH 7.4）行主動脈灌注固定。取脊髓腰膨大（L4～L5）節(jié)段置入30%蔗糖（w/v）溶液中，4℃保存。在冷凍切片機中切片，片厚25 μm。EM-2免疫組織化學(xué)染色方法參考以前的報道進行［22］。所有切片依次進行以下步驟：1）兔抗EM-2抗血清孵育（4℃ 48 h）；2）生物素?；难蚩雇肐gG（室溫4 h）；3）卵白素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物（ABC）試劑盒反應(yīng)（1 h）；4）置入含有0.04% 二氨基聯(lián)苯四氫氧化物（DAB）和0.003% 雙氧水（H2O2）的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH7.6）中反應(yīng)，使EM-2-免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物顯色。每個步驟之間，切片要以0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶液清洗。并將切片貼到載玻片上，風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片并于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1 熱異常性痛行為學(xué)測定結(jié)果

在進行OVX手術(shù)前，測量獲得幾組大鼠的PWL在同一水平（約21 s）。OVX手術(shù)后，與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠的PWL明顯降低（約10 s，P＜0.05），這種降低趨勢持續(xù)到手術(shù)后8周；與OVX組比較，OVXex組大鼠的PWL顯著性增高（P＜0.05，圖1）。這個實驗結(jié)果說明，OVX模型誘發(fā)出強烈的熱異常性痛行為反應(yīng)，而間歇運動可以減弱OVX誘發(fā)的熱痛行為學(xué)反應(yīng)。

2.2 脊髓背角的EM-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

OVX手術(shù)8周后的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與Sham組相比較，OVX組脊髓背角EM-2的表達降低了，而OVXex組的EM-2表達變化不大（圖2）。對于這些圖形的半定量分析顯示，EM-2的表達在OVX手術(shù)后8周（P＜0.05，vs Sham）顯著性的降低；EM-2在OVXex組的表達則明顯增多（P＜0.05，vs OVX），與Sham組無明顯差異（圖3）。

3 討論與分析

臨床和實驗研究均表明，伴隨著女性月經(jīng)周期的雌激素波動，女性的疼痛敏感性也隨之波動。研究中對實驗雌性大鼠傷害性刺激的痛覺評分結(jié)果表明，大鼠雌激素水平較低時，其痛覺評分高于雌激素水平較高時［9］。這說明雌激素在疼痛感受過程中有著極為重要的作用。因此，絕經(jīng)后的女性更易于經(jīng)歷各種疼痛，如纖維肌痛、偏頭疼和背痛等［15，19］。采用標(biāo)準(zhǔn)化骨質(zhì)疏松大鼠模型——OVX模型所做的前期研究表明，雌激素降低到極端狀態(tài)的OVX大鼠出現(xiàn)了明顯的熱痛敏行為學(xué)反應(yīng)［22］。針對激素相關(guān)疼痛的鎮(zhèn)痛，目前在臨床上多采用激素替代療法。這種療法有著很好的鎮(zhèn)痛效果，但同時又隱伏著使患者罹患背痛和顳頜關(guān)節(jié)病等疼痛的風(fēng)險［18］。對于臨床上作為鎮(zhèn)痛金標(biāo)準(zhǔn)的嗎啡，也因其引起強烈的副作用，如耐受性、成癮性和戒斷綜合征等，而限制了其臨床應(yīng)用。于是，與嗎啡有著相似作用途徑的內(nèi)嗎啡肽（endomorphins，EMs）引起了研究者的重視。EMs或者在脊神經(jīng)節(jié)處的初級感覺神經(jīng)元處合成，繼而運輸?shù)郊顾璞辰堑臏\層，通過其內(nèi)源性配體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［14］；或者由同側(cè)傳入纖維和起源于孤束核的下行纖維釋放而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用［23］。進一步的研究表明，脊髓EM-2呈卵巢/性激素依賴性釋放［10］，即在雌鼠動情周期的各個階段，雌激素水平呈周期性變化，與此相應(yīng)，EM-2的釋放也呈周期性變化［10］。所以在本研究中，我們采用模擬女性絕經(jīng)期的常用大鼠OVX模型，探討間歇運動對OVX大鼠熱異常痛敏及其腰膨大處脊髓背角EM-2的表達所產(chǎn)生的影響。

圖1 各組大鼠的熱痛行為學(xué)結(jié)果Figure 1 Graphs Showing Timecourse of PWL in the Thermal Hyperalgesia Test

圖2 各組大鼠脊髓背角EM-2的免疫組織化學(xué)染色圖片F(xiàn)igure 2 Photomicrograph Showing the Immunohistochemicalstaining for EM-2 in SDH in the Sham，OVX and OVXex Group

前期［22］和本實驗結(jié)果均顯示，在雌激素極端下降的OVX狀態(tài)，脊髓背角EM-2的表達呈明顯的下降趨勢，到OVX手術(shù)8周后，EM-2的表達呈一個穩(wěn)定狀態(tài)。這些數(shù)據(jù)說明，脊髓背角EM-2的減少可能是OVX誘導(dǎo)熱異常痛敏的一個病理生理學(xué)機制。同時，我們對于OVX手術(shù)后大鼠，于每周末所進行的熱痛行為學(xué)測試結(jié)果表明，從OVX手術(shù)1周后開始，大鼠出現(xiàn)了明顯的熱異常痛敏反應(yīng)，此狀態(tài)一直維持到手術(shù)后8周。這與女性更年期有更強的痛感研究結(jié)果相一致［15，19］。這些實驗結(jié)果提示我們，增加脊髓EM-2可能作為一種針對OVX大鼠的熱異常痛行為反應(yīng)的鎮(zhèn)痛措施。對OVX大鼠進行外源性鞘內(nèi)注射EM-2，結(jié)果表明，EM-2能劑量依賴性地抑制OVX誘發(fā)的熱痛敏，且不影響OVX大鼠的運動能力，也不引起OVX大鼠的焦慮情緒。在給予EM-2的拮抗劑后，鞘內(nèi)注射EM-2的鎮(zhèn)痛效果被屏蔽［22］。由此說明，針對OVX引起的大鼠熱痛敏，EM-2是有希望作為一個強效鎮(zhèn)痛劑的。但是，引起我們注意的是，鞘內(nèi)注射EM-2有一個很大的缺陷，即由于EM-2在體內(nèi)的快速降解，所以它的鎮(zhèn)痛效用非常短暫，大約持續(xù)30 min［22］。與之相反，激素相關(guān)性疼痛常常是慢性，而且持久存在的，所以，怎樣使EM-2鎮(zhèn)痛能夠持久發(fā)揮作用則是更應(yīng)該受到關(guān)注的問題。

圖3 EM-2表達的半定量分析柱形圖Figure 3 The Semi-quantitative Analyses of the EM-2 Expression Presented in the Histograph

大鼠OVX模型除了被用于模擬雌激素降低的極端狀態(tài)，也是標(biāo)準(zhǔn)的骨質(zhì)疏松模型，在術(shù)后8周，可出現(xiàn)明顯的骨密度降低等骨質(zhì)疏松癥癥狀。對于骨質(zhì)疏松的療法，除了激素替代療法以外，運動療法也是一種常見的治療措施［3］。運動療法可預(yù)防和改善骨質(zhì)疏松癥引起的骨密度降低等癥狀［6］。長期的合理運動改善了絕經(jīng)后綜合征的疼痛癥狀［7，8，16］。然而，關(guān)于運動對于OVX模型所引起的熱異常痛敏，目前尚缺乏這方面的實驗數(shù)據(jù)。因此，運動能否改善OVX模型所引起的熱異常痛敏，能否影響脊髓背角的EM-2就成為本實驗關(guān)注的焦點。

以前的研究顯示，具有一定負(fù)荷的持續(xù)性運動（60 min/天，4～5/周）對于絕經(jīng)后癥狀有更好的改善作用［8］。本實驗所采用的運動模式為每日60 min，每周5天的間歇運動模式。結(jié)果表明，此負(fù)荷的間歇運動能減緩OVX引起的大鼠熱異常痛敏，同時，EM-2的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，間歇運動也改善了脊髓背角EM-2的降低狀況。與前期的實驗相結(jié)合，似乎可以推測，熱異常痛敏的緩解可能是因為間歇運動增加了脊髓背角EM-2的表達，使其發(fā)揮了強效的鎮(zhèn)痛效果。而且這種EM-2的內(nèi)源性增加與外源性鞘內(nèi)注射EM-2不同，它是一種持續(xù)的增加效果，不受EM-2的快速降解影響。另外，從文獻中了解到，不同的運動對于絕經(jīng)期后女性的性激素水平的影響不同，與過度運動和不運動相比較，適當(dāng)?shù)倪\動可以引起性激素水平的升高［5］。鑒于脊髓EM-2的性激素依賴性，似乎可以推測運動與EM-2增高之間的關(guān)系，當(dāng)然，這是需要更進一步探討的問題。

4 結(jié)論

間歇運動可顯著減弱OVX手術(shù)引起的熱異常痛敏反應(yīng)，這種減緩的機制可能與間歇運動誘發(fā)大鼠脊髓背角EM-2的增加相關(guān)，這個結(jié)論還需要進一步的實驗來證實。本實驗結(jié)果有利于證明開展運動干預(yù)骨質(zhì)疏松癥，不僅可改善骨密度狀況，也可抑制骨質(zhì)疏松引起的熱異常痛敏癥狀。

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Effect of Interval Exercise on the Expression of Spinal Dorsal Horn Endomorphin-2 in Ovariectomized Rat

ZHAO Xiao-hui

Objectives：The present study was designed to test effects of interval exercise on expression of spinal dorsal horn endomorphin-2 (EM-2) in ovariectomized (OVX) rats. Methods：Female Sprague Dawley (SD) rats，180～200 g，were randomly divided into three groups：Sham-operated group (Sham，n=8)，ovariectomized group (OVX，n=8) and OVX with interval exercise group (OVXex，n=8). The OVX model was established to simulating conditions of female menopause. The rats in OVXex were subjected to 7 weeks interval training. The thermal hyperalgesia was detected by behavioral tests 24 hour post each week training. The EM-2 expression of spinal dorsal horn (SDH) in lumbar enlargement was determined with immunohistochemistry staining 24 hour post the end of training. Results：The OVX operation induced obviously thermal hyperalgesia and signif i cantly decreased the EM-2 levels in the superf i cial layers of SDH. Meanwhile，the interval exercise up-regulated EM-2 expression and alleviated the pain behavioral responses in OVX rats. Conclusion：The interval exercise training attenuated the increased pain behavioral responses and might be used as an analgesic strategy for post menopause pain.

interval exercise；ovariectomized；spinal dorsal horn；endomorphin-2；thermal hyperalgesia；Menopause

G804.5

A

1002-9826（2017）03-0037-04

10. 16470/j. csst. 201703006

2016-07-07；

2017-04-18

西安建筑科技大學(xué)擇優(yōu)立項課程建設(shè)項目。

趙曉慧，女，講師，博士，主要研究方向為痛與鎮(zhèn)痛的神經(jīng)機制，Tel：029-82202881，E-mail：zxh7612@126.com。

西安建筑科技大學(xué) 體育系，陜西 西安710055。Xi’an University of Architecture and Technology，Xi’an 710055，China.