• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    漳州市夏秋季主要貝類中副溶血性弧菌分布情況分析

    2017-06-01 12:21:12胡元慶周贊虎黃玉容張燕瑜
    食品工業(yè)科技 2017年5期
    關(guān)鍵詞:文蛤漳州市溶血性

    胡元慶,周贊虎,黃玉容,張燕瑜,莊 蕾

    (1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.揚州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇揚州 225000;3.漳州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建漳州 363000)

    漳州市夏秋季主要貝類中副溶血性弧菌分布情況分析

    胡元慶1,2,周贊虎3,黃玉容1,張燕瑜1,莊 蕾1

    (1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.揚州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇揚州 225000;3.漳州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建漳州 363000)

    調(diào)查漳州市售主要貝類中副溶血性弧菌的帶菌狀況,為消費者提供食品安全風(fēng)險參考。從漳州市區(qū)的8大市場無菌采集花蛤、文蛤和蟶的新鮮樣品;用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)分離純化疑似菌落,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增不耐熱溶血素基因(thermolabile hemolysin,tlh)的特異片段;并對分子檢測陽性的菌株進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果表明,采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS 篩選分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%;PCR確定副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42);革蘭氏染色和主要生化實驗確定疑似菌均為副溶血性弧菌,符合率達(dá)100%。漳州市所售水產(chǎn)品受副溶血性弧菌污染較為嚴(yán)重,市民食用需嚴(yán)格無害化處理,避免不同種類水產(chǎn)品間的交叉污染。

    副溶血性弧菌,花蛤,文蛤,蟶,漳州市

    副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌,是重要的污染性病原微生物。它廣泛分布于近海岸的魚類、貝類等海產(chǎn)品中,是引起食源性疾病的重要病原之一[1-2]。人們食用被副溶血性弧菌污染的食物后極可能會引起以腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等為主要癥狀的急性腸胃炎。副溶血性弧菌所致的食物中毒已在數(shù)量上超過沙門氏菌的中毒案例,居我國食源性致病菌的首位[3]。特別是在一些沿海城市,由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒總數(shù)的比例達(dá)60%以上[4]。副溶血性弧菌引起的食物中毒具有明顯的季節(jié)性,以夏秋為高發(fā)季節(jié),夏季的海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的平均帶菌率高達(dá)94.8%[5]。

    花蛤、文蛤和蟶味道鮮美且價格實惠,是夏秋季節(jié)最常見的海產(chǎn)食品,也是沿海居民飯桌上常見的菜肴。但近來由副溶血性弧菌引起的海產(chǎn)品中毒報道屢見不鮮,如何更好的預(yù)防和控制副溶血性弧菌引起的食物中毒是食品安全的重要內(nèi)容。分離檢測貝類食品中的可疑副溶血性弧菌并對其鑒定,研究副溶血性弧菌的來源對食物中毒的預(yù)防和控制具有重要的意義。本實驗選擇PCR檢測作為主要的鑒定方法,配合革蘭氏染色、嗜鹽性實驗、3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面實驗和氧化酶實驗,保障實驗結(jié)果的可靠性[6]。從漳州市場采集花蛤、文蛤和蟶樣品進(jìn)行副溶血性弧菌帶菌情況分析,為市民食用水產(chǎn)食品提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    水產(chǎn)樣品 2015年7~10月,從漳州市區(qū)8個市場(新西市場,北橋市場,金峰市場,西洋坪市場,中山橋水產(chǎn)市場,九龍江漁業(yè)碼頭市場,八卦樓漁產(chǎn)市場,古街市場)每月各采集10份樣品,共采集53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的新鮮樣品。副溶血性弧菌ATCC 17802和大腸桿菌D5株 由漳州出入境檢驗檢疫局提供。

    Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國Biometra公司,red 個人型凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司,MIKRO 220R冷凍離心機 德國Hettich公司。

    針對副溶血性弧菌的tlh基因設(shè)計上下游引物,上游引物:5′-AAGCGGATT ATGCAGAAGCA-3′,下游引物:5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′ 由上海生工合成;氯化鈉、瓊脂粉、牛肉浸膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、TCBS瓊脂培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技公司;三羥甲基氨基甲烷(tris)、乙酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O) 國產(chǎn)分析純;2×Taq Master Mix 上海捷瑞科技有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 無菌采樣 對漳州市區(qū)8個市場的新鮮花蛤、文蛤和蟶隨機抽樣,先用無菌的采樣袋不加運送液密封后,置于冰盒內(nèi)低溫快速運達(dá)實驗室。采樣時間在2015年7~10月,每個攤位每次采樣2~3只鮮活樣品,一次采樣15只。

    1.2.2 接種和培養(yǎng) 超凈工作臺預(yù)先紫外滅菌20 min,開啟風(fēng)機,在無菌操作臺內(nèi)點燃酒精燈,將鑷子、剪刀在火焰上滅菌冷卻,找到斧足肌肉外層的內(nèi)臟和瓣鰓,用經(jīng)過酒精燈滅菌的接種環(huán)碰觸肌肉外層,劃在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上,于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18~24 h,觀察,并記錄。

    1.2.3 可疑菌的純化 待培養(yǎng)18~24 h后的TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板上長出淡綠色細(xì)菌,挑出可疑單菌落,劃線于新的TCBS 瓊脂培養(yǎng)基平板上。在培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)18~24 h后觀察菌落。

    1.2.4 液體培養(yǎng)基擴菌 在無菌操作臺挑取每個TCBS瓊脂平板中的一個單菌落,接種至液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)u床180 r/min培養(yǎng)18~24 h,待液體渾濁后留用。

    1.2.5 PCR方法初篩副溶血性弧菌 檢測副溶血性弧菌tlh基因,擴增片段長度約為449 bp。水煮法制備模板,擴增體系:25 μL的PCR反應(yīng)體系中含3 μL模板,上下游引物各1 μL,12.5 μL 2×Taq Master Mix(含酶),用去離子H2O補足到25 μL體系。PCR擴增條件為95 ℃,2 min,再按94 ℃,30 s變性、54.5 ℃,60 s退火、72 ℃,45 s延伸,循環(huán)擴增30次后72 ℃,10 min。在 1%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果。

    1.2.6 嗜鹽性實驗 PCR鑒定陽性的菌株分別接種至0、7%、10% NaCl液體培養(yǎng)基中。恒溫振蕩搖床37 ℃,180 r/min培養(yǎng)18~24 h,觀察并記錄。副溶血性弧菌在0和10%氯化鈉溶液中不生長,在7%氯化鈉溶液中可旺盛生長。

    1.2.7 氧化酶實驗 將氧化酶試紙平鋪在潔凈的玻片上(玻片底部用一層白紙墊上易于觀察顏色變化),用移液槍吸取一滴菌液涂布在氧化酶試紙上,如果濾紙在10 s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅色或紫紅色,即為氧化酶陽性;不變色為氧化酶陰性。副溶血性弧菌為氧化酶陽性,大腸桿菌為陰性對照。

    1.2.8 3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面實驗 超凈工作臺中進(jìn)行3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面穿刺。將試管直立于燒杯中,在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察實驗現(xiàn)象。

    1.2.9 統(tǒng)計分析 對不同市場來源的3種樣品中副溶血性弧菌分離率和陽性率進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行χ2檢驗,p<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離純化結(jié)果

    漳州的8個市場中分別采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS選擇性培養(yǎng)基分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%。在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上,挑選藍(lán)綠色單菌落進(jìn)行分離純化,菌落呈圓形、半透明、表面光滑。在細(xì)菌分離約3~5次后,即可觀察到TCBS瓊脂平板上生長的菌落全部為統(tǒng)一的藍(lán)綠色,說明此時細(xì)菌已經(jīng)成功分離純化,見圖1A。接種與分離的過程中,對于無藍(lán)綠色菌落生長的平板,作無害化處理,見圖1B。

    圖1 副溶血性弧菌的TCBS分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of Vibrio parahaemolyticus on TCBS medium

    2.2 PCR方法鑒定

    副溶血性弧菌可在449 bp處檢測出特異條帶。圖2中顯示,樣品1~7號于449 bp處出現(xiàn)特異性條帶,判定為陽性結(jié)果。PCR確定3種水產(chǎn)樣品中副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)。

    圖2 PCR擴增出副溶血性弧菌tlh基因的特異片段Fig.2 The specific fragment of Vibrio parahaemolyticus tlh gene by PCR

    2.3 革蘭氏染色

    將PCR鑒定陽性菌株進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察到均為紅色,呈革蘭氏陰性,形態(tài)呈弧狀或短桿狀。革蘭氏染色結(jié)果證明全部符合副溶血性弧菌的革蘭氏陰性特征。

    圖3 革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 The result of strain isolated using Gram stain

    2.4 嗜鹽性實驗結(jié)果

    將PCR鑒定陽性菌進(jìn)行嗜鹽性實驗,所有菌株均在7%氯化鈉液體培養(yǎng)基中生長良好,在0和10%氯化鈉液體培養(yǎng)基中不生長。嗜鹽性實驗結(jié)果證明PCR陽性菌株全部符合副溶血性弧菌嗜鹽性特性。

    圖4 嗜鹽性實驗結(jié)果Fig.4 The result of salt tolerance test

    圖5 3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗結(jié)果Fig.5 The result of 3.5% sodium chloride three sugar iron agar slant test

    2.5 3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗

    PCR陽性菌株在3.5%三糖鐵瓊脂試管斜面實驗結(jié)果為:斜面產(chǎn)堿變紅,底層產(chǎn)酸變黃,不產(chǎn)氣,如圖5。根據(jù)副溶血性弧菌的培養(yǎng)特性,在3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面上層產(chǎn)堿為紅色,底層產(chǎn)酸為黃色,無氣泡,不變黑(不產(chǎn)H2S)。3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗結(jié)果表明,分離的PCR陽性菌株均符合副溶血性弧菌的特性。

    2.6 氧化酶實驗結(jié)果

    將PCR陽性菌液涂布在氧化酶試紙上,10 s內(nèi)均出現(xiàn)紫紅色,表明全部呈現(xiàn)氧化酶陽性,如圖6。

    圖6 氧化酶實驗結(jié)果Fig.6 The result of oxidase test注:A,B,C,D是4種副溶血性弧菌分離株的 氧化酶實驗結(jié)果,紫紅色為陽性。

    表1 三種貝類產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測結(jié)果


    注:表中分離率括號中數(shù)字代表分離疑似菌與樣品數(shù)之比;陽性率括號中數(shù)字代表分子鑒定陽性菌與樣品數(shù)之比。

    2.7 統(tǒng)計結(jié)果

    漳州市8大市場分離率和陽性率比較差異顯著(p<0.05),同一市場的3種貝類水產(chǎn)品中副溶血性弧菌分離率和陽性率比較差異顯著(p<0.05),本實驗所得數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.8 討論

    本實驗采集的53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS 選擇性培養(yǎng)基分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%;PCR確定3種水產(chǎn)樣品中副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)(見表1);經(jīng)革蘭氏染色、嗜鹽性實驗、氧化酶實驗和3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面確定PCR檢測的疑似菌均符合副溶血性弧菌的生化和細(xì)菌形態(tài)染色特性,符合率達(dá)100%[7-9]。

    因每個市場規(guī)模不同,故在采樣選擇的攤位和樣品數(shù)也因市場規(guī)模大小而有所不同。從分離率和陽性率來看,8個市場來源的樣品中細(xì)菌的分離率達(dá)到40%以上,中山橋市場和九龍江漁業(yè)碼頭市場的分離率最高,達(dá)到100%,西洋坪社區(qū)市場分離率也比較高;而陽性率以九龍江漁業(yè)碼頭市場為最高,達(dá)到50%以上。3種貝類樣品中,文蛤和蟶中副溶血性弧菌的分離率偏高,分別為90%和85.7%;蟶的副溶血弧菌陽性率比花蛤和文蛤分別高出19和24.8個百分點。蟶中副溶血性弧菌污染較為嚴(yán)重,可能與其捕撈環(huán)境衛(wèi)生狀況有關(guān),其高效的富集作用也可使細(xì)菌的攜帶量明顯增加。綜合分析得知,市區(qū)市場中的副溶血性弧菌攜帶率不高,而距離九龍江較近的中山橋和九龍江漁業(yè)碼頭2個市場中陽性率偏高,可能與市場中各種水產(chǎn)品間來源復(fù)雜,且由于缺乏規(guī)范管理而導(dǎo)致交叉污染的幾率增加。從8個市場的調(diào)查和檢測結(jié)果分析,漳州市區(qū)市場在7~10月間所售貝類均有不同程度的副溶血性弧菌污染,陽性率相對較高,市民在食用時需注意衛(wèi)生和安全,充分清洗并徹底加熱后食用,不要生吃或半生食用,以防食源性病原菌直接感染。本實驗樣品為7~10月份平均采集,每個月每種樣品采集10份左右。不同月份間未表現(xiàn)明顯分離率和陽性率差異。分析原因:漳州地區(qū)是亞熱帶海洋氣候,5月份即進(jìn)入夏季,一般每年7~10月份為最炎熱天氣,氣溫基本穩(wěn)定在35 ℃左右,對副溶血性弧菌的分布影響不顯著。

    隨著人們生活水平的不斷提高和觀念意識的不斷更新,水產(chǎn)品因其較高的營養(yǎng)價值越來越受廣大消費者的喜愛,并且許多消費者為追求水產(chǎn)食品的鮮美、原滋原味與新穎的烹飪方式喜歡生食水產(chǎn)品[10]。但是生食和食用未熟的海產(chǎn)品都可能引起食物中毒,威脅健康。副溶血性弧菌引起的食物中毒一般多發(fā)于5~11月,高峰季節(jié)在7~9月,有明顯的季節(jié)性,但在外界環(huán)境中容易死亡。當(dāng)溫度為56 ℃時5 min即可將其殺滅,在食醋中只能存活1 min。所以,應(yīng)進(jìn)一步加強這方面衛(wèi)生知識的宣傳與普及,引導(dǎo)市民在食用花蛤及其他水產(chǎn)食品一定要煮熟蒸透,以確保殺死病原微生物,并提倡經(jīng)常食用花蛤的市民蘸取食醋,提高對食物中毒的預(yù)防,減少食品安全隱患。同時,衛(wèi)生監(jiān)督部門應(yīng)重視流通領(lǐng)域和餐飲行業(yè)的衛(wèi)生監(jiān)督,通過宣傳教育有效加強餐飲從業(yè)人員的食品安全意識,從而減少食源性病原菌的污染。

    3 結(jié)論

    本文分析了漳州市7~10月8大市場的貝類水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染狀況。結(jié)果表明:距離九龍江水域越近的市場,所售水產(chǎn)品受副溶血性弧菌污染越嚴(yán)重;蟶的副溶血性弧菌陽性率最高,比花蛤和文蛤分別高出19和24.8個百分點。市民食用需嚴(yán)格無害化處理,避免不同種類水產(chǎn)品間的交叉污染。

    [1]Xu X,Wu Q,Zhang J,et al. Prevalence,pathogenicity,and serotypes of Vibrio parahaemolyticus in shrimp from Chinese retail markets[J]. Food Control,2014,46(46):81-85.

    [2]Anjay,Das S C,Kumar A,et al. Pathogenic and pandemic vibrio parahaemolyticus detection in fish and shellfish isolates[J]. Indian Journal of Geo-marine Sciences,2016,45(9):1195-1198.

    [3]斯國靜,吳奇志,韋東芳,等. 2001-2003年杭州市細(xì)菌性食物中毒病原菌檢測和分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2004,14(3):320-320.

    [4]陳瑞英,魯建章,蘇意誠,等. 食品中副溶血性弧菌的危害分析[J]. 食品科學(xué),2007,28(1):341-347.

    [5]Alaboudia R,Ababneh M,Osaili T M,et al. Detection,Identification,and Prevalence of Pathogenic Vibrioparahaemolyticus in Fish and Coastal Environment in Jordan[J]. Journal of Food Science,2016,81(1):M130-M134.

    [6]李紅娜,袁飛,周偉娥,等. 副溶血弧菌檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技2016,37(12):371-374.

    [7]葛菲菲,徐鋒,沈莉萍,等. 副溶血性弧菌PCR檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(3):220-230.

    [8]王建紅,王東方,陳洪永,等. 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢驗及方法探討[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(2):360-361.

    [9]周燕,陳孟權(quán),陳新元,等. 海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速檢測方法[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,21(8):1952-1955.

    [10]紀(jì)懿芳,胡文忠,姜愛麗,等. 海產(chǎn)品中副溶血弧菌檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(5):365-369.

    Survey of the pollution ofVibrioparahaemolyticusfrom three shellfish products in Zhangzhou City

    HU Yuan-qing1,2,ZHOU Zan-hu3,HUANG Yu-rong1,ZHANG Yan-yu1,ZHUANG lei1

    (1.School of Biological Science and Biotechnology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou 225000,China;3.Comprehensive Technical Service Center,Zhangzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhangzhou 363000,China)

    To analyze the carrying status ofVibrioparahaemolyticusof shellfish products in Zhangzhou City and provide reference for the food safety problem of shellfish. The fresh sample were collected by sterile operation from 8 markets in Zhangzhou City. The suspected colony was obtained by culturing on TCBS plates and detected using PCR amplification of a specific tlh gene. The positive strain was verified using biochemical test and Gram staining. 53 Venerupis philippinarum,50 Meretrix and 42 Scalprum samples were collected from 8 main markets,37 Venerupis philippinarum,45 Meretrix and 36 Scalprum suspected colony were screening with TCBS selective medium. The separation rate were 69.8%,90.0% and 85.7% forVenerupisphilippinarum,Meretrix and Scalprum,respectively. PCR positive rate were 35.8%(19/53),30.0%(15/50)and 54.8%(23/42). These positive strain were confirmed by Gram staining and biochemical test. The shellfish products in Zhangzhou City are polluted byVibrioparahaemolyticus,seafood should be strictly disposed,to avoid cross contamination between different types of aquatic products.

    Vibrioparahaemolyticus;Venerupisphilippinarum;Meretrix;Scalprum;Zhangzhou City

    2016-09-06

    胡元慶(1979-),男,博士,副教授,研究方向:食源性病原微生物控制,食品安全檢測技術(shù),E-mail:huyuanqing1979@163.com。

    福建省自然科學(xué)基金面上項目(26171082);福建省教育廳A類項目(JA14203);漳州市自然基金項目(ZZ2014J20);江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室資助項目(R1402);國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室開放課題(HY1503);國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201610402012)。

    TS254.7

    A

    1002-0306(2017)05-0293-05

    10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.047

    猜你喜歡
    文蛤漳州市溶血性
    漳州市永良針紡機械有限公司
    紡織機械(2023年5期)2023-12-15 09:25:16
    池塘養(yǎng)殖文蛤死亡原因分析及防控對策
    碳氧血紅蛋白在新生兒ABO溶血性黃疸中的臨床意義
    首創(chuàng)“巧婦貸”漳州市婦聯(lián)扎實推進(jìn)“巾幗脫貧行動”
    海峽姐妹(2020年6期)2020-07-25 01:26:02
    印 璽
    寶藏(2019年1期)2019-03-20 02:29:38
    以文蛤為主題課程的實踐與反思
    漳州市早秈優(yōu)質(zhì)稻新品種比較試驗初報
    撿文蛤
    利巴韋林片致溶血性貧血伴急性腎衰竭1例
    去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞儲血袋兩種放置方式的溶血性分析
    一进一出抽搐动态| 99久久九九国产精品国产免费| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品一二三区在线看| 波多野结衣高清无吗| 51国产日韩欧美| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 最新中文字幕久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 色综合色国产| 97热精品久久久久久| 不卡一级毛片| 免费看日本二区| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 精品无人区乱码1区二区| 激情 狠狠 欧美| 国产精品一及| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲国产精品国产精品| 精品久久久久久久末码| 国产精品三级大全| 美女大奶头视频| 人人妻人人看人人澡| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本在线视频免费播放| 在线观看午夜福利视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 久久韩国三级中文字幕| 嫩草影院精品99| 日本色播在线视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲美女搞黄在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品一及| 日日啪夜夜撸| 免费无遮挡裸体视频| 成人美女网站在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 听说在线观看完整版免费高清| 少妇丰满av| 精品熟女少妇av免费看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一进一出抽搐动态| 久久久久久大精品| 五月伊人婷婷丁香| 国产极品精品免费视频能看的| 国产在线男女| 成年av动漫网址| 亚洲国产精品成人久久小说 | 老司机福利观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品无大码| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美精品一区二区大全| 国产伦理片在线播放av一区 | 桃色一区二区三区在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 黄片wwwwww| 亚洲天堂国产精品一区在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久性生活片| av免费在线看不卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产午夜福利久久久久久| 日韩视频在线欧美| 欧美最黄视频在线播放免费| 色尼玛亚洲综合影院| 久久国产乱子免费精品| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美在线乱码| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品一区二区三区视频在线| 一区二区三区四区激情视频 | 国产久久久一区二区三区| 三级毛片av免费| 最后的刺客免费高清国语| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产私拍福利视频在线观看| 中文欧美无线码| 悠悠久久av| 亚洲成人av在线免费| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 九九热线精品视视频播放| 精品久久国产蜜桃| 青春草亚洲视频在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 69av精品久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品久久视频播放| 天美传媒精品一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 国产成人91sexporn| 亚洲av男天堂| 国产男人的电影天堂91| 麻豆久久精品国产亚洲av| 特级一级黄色大片| 97超碰精品成人国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 99久久人妻综合| 国产色婷婷99| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产综合懂色| 免费观看精品视频网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 一进一出抽搐动态| 国产精品一二三区在线看| 日韩一区二区三区影片| 免费看美女性在线毛片视频| 国产黄a三级三级三级人| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久热精品热| 永久网站在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本熟妇午夜| 国产伦理片在线播放av一区 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 色尼玛亚洲综合影院| 校园春色视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 国产亚洲av嫩草精品影院| 嫩草影院入口| av卡一久久| 嫩草影院入口| 国产片特级美女逼逼视频| 久久国内精品自在自线图片| 嫩草影院新地址| 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产精品成人综合色| 69人妻影院| 深爱激情五月婷婷| 国产成人91sexporn| 国国产精品蜜臀av免费| 成人午夜高清在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| 激情 狠狠 欧美| 亚洲精品国产成人久久av| 高清日韩中文字幕在线| 99久久精品热视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 爱豆传媒免费全集在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久国产a免费观看| av在线天堂中文字幕| 中国国产av一级| 丰满乱子伦码专区| 国产 一区 欧美 日韩| 一本一本综合久久| 欧美色视频一区免费| av女优亚洲男人天堂| 成人鲁丝片一二三区免费| 99热这里只有精品一区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久人人爽人人片av| 久久久国产成人免费| 久久久久网色| 国产淫片久久久久久久久| 欧美色视频一区免费| 午夜爱爱视频在线播放| 乱系列少妇在线播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 99热全是精品| a级毛色黄片| 久久草成人影院| 中文字幕免费在线视频6| 免费黄网站久久成人精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99久久人妻综合| 久久人妻av系列| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲图色成人| 老女人水多毛片| 国产精品电影一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 成人国产麻豆网| 亚洲最大成人av| 国模一区二区三区四区视频| 午夜福利在线观看吧| 毛片女人毛片| 能在线免费观看的黄片| 老司机福利观看| 亚洲三级黄色毛片| 国产免费男女视频| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 男人舔奶头视频| 久久国产乱子免费精品| 少妇的逼好多水| 一区二区三区免费毛片| 国产麻豆成人av免费视频| 秋霞在线观看毛片| 青春草国产在线视频 | 久久久久性生活片| 久久精品国产亚洲av天美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲在久久综合| 在线a可以看的网站| 天堂中文最新版在线下载 | 直男gayav资源| 国产高清三级在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧美日韩东京热| 日本成人三级电影网站| 欧美精品一区二区大全| 国产真实伦视频高清在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品午夜福利在线看| 黄色视频,在线免费观看| 一区二区三区四区激情视频 | 免费看光身美女| 日本成人三级电影网站| 日韩人妻高清精品专区| av国产免费在线观看| 亚洲av一区综合| 好男人在线观看高清免费视频| 国产人妻一区二区三区在| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本爱情动作片www.在线观看| 一级毛片我不卡| 又爽又黄无遮挡网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩欧美国产在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲av一区综合| 久久久久九九精品影院| 欧美极品一区二区三区四区| av在线亚洲专区| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 婷婷色综合大香蕉| 变态另类丝袜制服| 91久久精品国产一区二区成人| 秋霞在线观看毛片| 日本一本二区三区精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品久久久久久久性| 最近的中文字幕免费完整| 联通29元200g的流量卡| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产精品成人久久小说 | 色综合亚洲欧美另类图片| 六月丁香七月| 国产av一区在线观看免费| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品久久久久久精品电影| 最后的刺客免费高清国语| 精品日产1卡2卡| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 国内精品一区二区在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲国产精品sss在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产极品精品免费视频能看的| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热全是精品| 一本久久精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品久久久久久久久亚洲| 成人漫画全彩无遮挡| 国产在视频线在精品| 在线观看免费视频日本深夜| 97在线视频观看| 日韩一区二区三区影片| 成人二区视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 天美传媒精品一区二区| 级片在线观看| 久久热精品热| 六月丁香七月| 国产精品人妻久久久久久| av天堂在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 性欧美人与动物交配| 麻豆成人av视频| 日本色播在线视频| 色播亚洲综合网| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 12—13女人毛片做爰片一| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆乱淫一区二区| 欧美人与善性xxx| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人av在线播放网站| 麻豆成人av视频| 亚洲精品成人久久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日本视频| 欧美日韩在线观看h| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲图色成人| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久久久久久久黄片| 秋霞在线观看毛片| 网址你懂的国产日韩在线| 高清日韩中文字幕在线| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩欧美在线乱码| 91av网一区二区| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久午夜欧美精品| 嫩草影院入口| 精品久久久噜噜| av免费观看日本| 亚洲精品国产av成人精品| 少妇高潮的动态图| 亚洲五月天丁香| 久久久久久久久久久免费av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| h日本视频在线播放| 两个人视频免费观看高清| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一夜夜www| 伊人久久精品亚洲午夜| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产探花极品一区二区| 日韩av在线大香蕉| 看十八女毛片水多多多| 国模一区二区三区四区视频| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩亚洲欧美综合| 精品人妻偷拍中文字幕| 熟女人妻精品中文字幕| av天堂在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产视频内射| 亚洲精品成人久久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 在线观看一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久人人爽人人片av| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩一区二区三区影片| 91av网一区二区| 国产亚洲欧美98| 日韩精品青青久久久久久| 秋霞在线观看毛片| 久久国产乱子免费精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品久久久久久精品电影| 级片在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久久中文| 中文字幕熟女人妻在线| 免费看光身美女| 亚洲内射少妇av| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 日本欧美国产在线视频| 国产高潮美女av| 久久精品夜色国产| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99热这里只有精品一区| 亚洲av男天堂| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美性感艳星| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 在线观看66精品国产| 99久久精品国产国产毛片| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久色成人| 国产乱人视频| 久久草成人影院| 久久亚洲精品不卡| 亚洲在线自拍视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 日日干狠狠操夜夜爽| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲av男天堂| 精品国内亚洲2022精品成人| 青春草亚洲视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人毛片60女人毛片免费| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲真实伦在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲美女视频黄频| 男女那种视频在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本爱情动作片www.在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久九九精品影院| 男女啪啪激烈高潮av片| 99久国产av精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 丰满乱子伦码专区| 欧美高清成人免费视频www| 超碰av人人做人人爽久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费电影在线观看免费观看| 免费人成在线观看视频色| a级毛片免费高清观看在线播放| 特级一级黄色大片| 国产精品久久视频播放| 男的添女的下面高潮视频| 国产69精品久久久久777片| 成人国产麻豆网| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久大精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精华一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 1024手机看黄色片| 不卡一级毛片| 美女cb高潮喷水在线观看| 成年版毛片免费区| 91久久精品国产一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产自在天天线| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产伦精品一区二区三区四那| 波多野结衣高清作品| 午夜久久久久精精品| 在线观看一区二区三区| 一级av片app| 亚洲国产精品sss在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 村上凉子中文字幕在线| 久久久国产成人精品二区| 日本五十路高清| 免费在线观看成人毛片| 此物有八面人人有两片| 可以在线观看的亚洲视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美色视频一区免费| 精品一区二区三区人妻视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产免费一级a男人的天堂| 日本欧美国产在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品福利在线免费观看| 欧美精品国产亚洲| 午夜激情欧美在线| 看免费成人av毛片| 一级毛片电影观看 | 国产69精品久久久久777片| av.在线天堂| 日本欧美国产在线视频| 不卡一级毛片| 在线免费十八禁| 不卡一级毛片| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久久国产网址| 久久韩国三级中文字幕| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品电影一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品国产清高在天天线| 真实男女啪啪啪动态图| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 精品久久久久久久久av| 国产成人精品一,二区 | 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久久久久黄片| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩一区二区视频免费看| 国产男人的电影天堂91| 成人综合一区亚洲| 我要看日韩黄色一级片| 久久久欧美国产精品| 国产一区二区在线av高清观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 老女人水多毛片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品久久久久久久久久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日韩在线观看h| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 深夜a级毛片| 成年av动漫网址| 五月伊人婷婷丁香| 久久久a久久爽久久v久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 99精品在免费线老司机午夜| 九色成人免费人妻av| 看黄色毛片网站| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 久久99精品国语久久久| 久久人人爽人人片av| 一区福利在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 免费观看精品视频网站| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲精品av在线| 久久综合国产亚洲精品| 在线观看66精品国产| 美女cb高潮喷水在线观看| 男的添女的下面高潮视频| a级毛色黄片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 黑人高潮一二区| 18+在线观看网站| 久久综合国产亚洲精品| 黄色日韩在线| 男插女下体视频免费在线播放| 看十八女毛片水多多多| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美一区二区亚洲| 婷婷亚洲欧美| 国产亚洲av嫩草精品影院| 在线观看66精品国产| 在现免费观看毛片| 久久人人精品亚洲av| 日韩欧美国产在线观看| a级毛片a级免费在线| 国产黄片美女视频| 日韩欧美精品免费久久| 男的添女的下面高潮视频| 中出人妻视频一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人a区在线观看| 久久久久久大精品| 三级经典国产精品| 在线观看午夜福利视频| 大型黄色视频在线免费观看| 免费在线观看成人毛片| 最新中文字幕久久久久| 日本在线视频免费播放| 在线免费观看的www视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 夜夜爽天天搞| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 99久久精品一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 看免费成人av毛片| 一级毛片我不卡| 国产高潮美女av| 桃色一区二区三区在线观看| 久久精品国产自在天天线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲欧洲日产国产| 日韩国内少妇激情av|