檸檬酸-反相微膠團(tuán)法提取蝦殼中甲殼素的研究

張 鐘,高佳欣

(廣東石油化工學(xué)院,廣東茂名 525000)

檸檬酸-反相微膠團(tuán)法提取蝦殼中甲殼素的研究

張 鐘,高佳欣

(廣東石油化工學(xué)院,廣東茂名 525000)

以蝦殼為原料,采用檸檬酸反向微膠團(tuán)法研究出一種新型的制備甲殼素的方法。首先用食品級的檸檬酸結(jié)合超聲波輔助萃取技術(shù)脫除蝦殼中的無機(jī)鹽,再用微膠團(tuán)萃取技術(shù)脫除蝦殼中的蛋白質(zhì),再用30%的雙氧水脫色,從而制得甲殼素。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面設(shè)計(jì),得到檸檬酸反相微膠團(tuán)法提取蝦殼中甲殼素的最優(yōu)條件。并將該法與酸堿法和酶法制備甲殼素產(chǎn)率進(jìn)行了對比。結(jié)果表明,最優(yōu)條件為:40 mL反相微膠團(tuán)中蝦殼的原料添加量為0.62 g、KCl濃度為0.15 mol/L、萃取時(shí)間為116 min,產(chǎn)率為 47.32%。檸檬酸反相微膠團(tuán)法甲殼素產(chǎn)率極顯著低于傳統(tǒng)的酸堿法,但極顯著高于酶法。該方法可行,可為甲殼素生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供理論基礎(chǔ)。

蝦殼,檸檬酸,反相微膠團(tuán),甲殼素

我國蝦類資源十分豐富,蝦仁加工后,蝦頭、蝦殼成為加工廢棄物[1]。甲殼素又名幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)等,化學(xué)名為β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D葡聚糖,分子式為(C8H15NO6)n。甲殼素廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱動(dòng)物的甲殼,其中蝦殼中甲殼素含量為20%～25%,蟹殼為15%～20%之間[2]。蝦殼中主要有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、色素和甲殼素四類物質(zhì)[1],因此,除去前三類物質(zhì),就可以制得甲殼素。目前甲殼素的生產(chǎn)工藝主要有酸堿法[3-4]、酶法[5]、發(fā)酵法[6]、EDTA法[7]等。酸堿法使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿,對環(huán)境污染大,成本高,耗能大;酶法雖然污染小,且條件溫和,但提取率較低;發(fā)酵法操作較為復(fù)雜,對生產(chǎn)條件要求嚴(yán)格,生產(chǎn)周期長;EDTA法成本低,耗時(shí)少,但工藝中使用的NaOH仍對環(huán)境有影響,且目前用EDTA法制備甲殼素的工藝還不夠成熟。因此,研究出一種新的甲殼素提取方法尤為必要。

在反相微膠團(tuán)中,表面活性劑的極性基團(tuán)部分圍成一個(gè)極性核心,稱為“水池”。這個(gè)水池包括表面活性劑的極性基團(tuán)內(nèi)表面和其中的水分,以及溶解于水中的離子等。這個(gè)水池可以萃取蛋白質(zhì)等水溶性大分子物質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)蛋白的分離[8]。反相微膠團(tuán)在天然成分提取中的應(yīng)用越來越重視[9-10]。

目前,國內(nèi)外主要采用傳統(tǒng)的酸堿化學(xué)方法生產(chǎn)甲殼素,生產(chǎn)過程中會(huì)引起嚴(yán)重的環(huán)境污染,同時(shí)造成水資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[11]。而本研究采用檸檬酸和反相微膠團(tuán)萃取技術(shù)結(jié)合的方法提取甲殼素,不僅減少了對環(huán)境的污染,用食品級的檸檬酸脫鈣后的副產(chǎn)物檸檬酸鈣還能作為食品添加劑添加于各種食品中,因此也實(shí)現(xiàn)了資源的回收,促進(jìn)了原料的綜合利用。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

南美白對蝦蝦殼 茂名新洲海產(chǎn)有限公司；檸檬酸 食品級,天津市百世化工有限公司;CTAB(十六烷基三甲基溴化銨) 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;異辛烷 分析純,天津市百世化工有限公司;硫酸、尿素、苯甲酸鈉、碘化鉀、HCl、HCl、氫氧化鈉、硫酸銅、碘均為分析純,過氧化氫溶液等。

SHZ-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州長城儀器有限公司;XO-1200超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)南京先歐儀器制造有限公司;DHG-9012A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司;DG120半斤裝中藥粉碎機(jī) 浙江省瑞安市春海藥材器械廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;HZ-9212S數(shù)顯水浴恒溫震蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;TD5B臺(tái)式大容量離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 挑選新鮮蝦殼作為制備甲殼素的原料,用清水將蝦殼內(nèi)外表面的異物去除干凈,于60 ℃烘箱中烘干后用粉碎機(jī)粉碎,備用。

1.2.2 超聲波輔助檸檬酸脫除無機(jī)鹽 根據(jù)彭元懷[12]等人的實(shí)驗(yàn),脫除蝦殼中無機(jī)鹽的最佳條件為:室溫、功率180 W、檸檬酸濃度為14 %、液料比為12∶1 (mL/g)、反應(yīng)時(shí)間22 min。

1.2.3 反相微膠團(tuán)技術(shù)脫除蛋白質(zhì) 取適量CTAB溶解于尿素∶異辛烷為1 g∶4 mL的混合溶液中,構(gòu)成透明澄清的反膠團(tuán)溶液[13]。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.4.1 原料加入量的單因素實(shí)驗(yàn) 分別量取20 mL異辛烷于5個(gè)250 mL的錐形瓶中,各加入5 g尿素、0.8 g CTAB、10 mL C6H8O7-Na2HPO4緩沖溶液、10 mL 0.1 mol/L KCl溶液,搖勻,構(gòu)成反膠團(tuán)溶液。再分別加入0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 g經(jīng)檸檬酸脫鹽后的蝦殼,調(diào)反膠團(tuán)體系的pH至9.0,在45 ℃,180 r/min的條件下震蕩120 min。震蕩完畢后,取出置于離心機(jī)中以3000 r/min離心5 min,去除上層物質(zhì),抽濾,干燥,稱重。

1.2.4.2 KCl濃度的單因素實(shí)驗(yàn) 分別量取20 mL異辛烷于5個(gè)250 mL的錐形瓶中,各加入5 g尿素、0.8 g CTAB、10 mL C6H8O7-Na2HPO4緩沖溶液、分別加入10 mL 0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mol/L KCl溶液,搖勻,構(gòu)成反膠團(tuán)溶液。再分別加入0.60 g經(jīng)檸檬酸脫鹽后的蝦殼,調(diào)反膠團(tuán)體系的pH至9.0,在45 ℃,180 r/min的條件下震蕩120 min。震蕩完畢后,取出置于離心機(jī)中以3000 r/min離心5 min,去除上層物質(zhì),抽濾,干燥,稱重。

1.2.4.3 萃取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn) 分別量取20 mL異辛烷于5個(gè)250 mL的錐形瓶中,各加入5 g尿素、0.8 g CTAB、10 mL C6H8O7-Na2HPO4緩沖溶液、10 mL 0.1 mol/L KCl溶液,搖勻,構(gòu)成反膠團(tuán)溶液。再分別加入0.60 g經(jīng)檸檬酸脫鹽后的蝦殼,調(diào)反膠團(tuán)體系的pH至9.0,分別在45 ℃,180 r/min的條件下震蕩60、80、100、120、140 min。震蕩完畢后,取出置于離心機(jī)中以3000 r/min離心5 min,去除上層物質(zhì),抽濾,干燥,稱重。

1.2.4.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),來確定影響蝦殼中甲殼素產(chǎn)率的最佳因素水平,以原料添加量、萃取時(shí)間、KCl濃度為實(shí)驗(yàn)因素,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析均采用Dseign Expert 6.5.0軟件進(jìn)行。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.5 H2O2溶液脫色 將脫鈣、脫蛋白質(zhì)后的蝦殼,浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫中浸泡2 h(反應(yīng)過程中低速攪拌,便于排除氣體,并加速反應(yīng)的進(jìn)行),蝦殼顏色漸變淺黃,逐步完全脫色,經(jīng)水洗,干燥得到甲殼素產(chǎn)品。

1.2.6 甲殼素的定性分析 在提取出的甲殼素中加入1滴0.03%的碘-碘化鉀溶液和1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H2SO4溶液,在白瓷點(diǎn)滴試樣板上顯示紫褐色,再加數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的H2SO4溶液,觀察顏色反應(yīng),若紫色逐漸消失,說明該測試產(chǎn)品為甲殼素[14]。

1.2.7 甲殼素產(chǎn)率的計(jì)算 甲殼素的產(chǎn)率包括檸檬酸脫除無機(jī)鹽后甲殼素的產(chǎn)率、反相微膠團(tuán)技術(shù)脫除蛋白質(zhì)后甲殼素的產(chǎn)率以及最終甲殼素的產(chǎn)率,其計(jì)算公式如下:

檸檬酸脫除無機(jī)鹽后甲殼素的產(chǎn)率(%)=檸檬酸脫除無機(jī)鹽后蝦殼的重量(g)/樣本中蝦殼的重量(g)×100

反相微膠團(tuán)脫除蛋白質(zhì)后甲殼素產(chǎn)率(%)=反相微膠團(tuán)脫除蛋白質(zhì)后蝦殼的重量(g)/檸檬酸脫除無機(jī)鹽后蝦殼的重量(g)×100

最終甲殼素的產(chǎn)率(%)=經(jīng)檸檬酸脫除無機(jī)鹽和反相微膠團(tuán)脫除蛋白質(zhì)后蝦殼的重量(g)/樣本中蝦殼的重量(g)×100

1.2.8 與成熟工藝對比實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 酸堿法 挑選新鮮蝦殼作為制備甲殼素的原料,用清水將蝦殼內(nèi)外表面的異物去除干凈,于60 ℃烘箱中烘干后用粉碎機(jī)粉碎。稱取3份1.00 g蝦殼,于100 mL 5% HCl中浸泡4 h至無氣泡冒出,再補(bǔ)加50 mL 5 % HCl,浸泡2 h,除去蝦殼中的鈣質(zhì)和無機(jī)鹽,抽濾用蒸餾水洗至中性,加100 mL 10 % NaOH于50 ℃水浴中加熱2 h,除去蛋白,過濾,用蒸餾水洗至中性,然后用0.1% HCl浸泡0.5 h,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫溶液100 mL浸泡2 h,水洗至中性,抽濾,烘干后得白色粉末狀甲殼素,分別計(jì)算甲殼素產(chǎn)率,取平均值[15]。

表2 原料添加量對甲殼素產(chǎn)率的影響

注：不同小寫字母表示在0.05水平上的顯著,大寫字母表示在0.01水平上的顯著,表3、表4、表7同。

表3 KCl濃度對甲殼素產(chǎn)率的影響

表4 萃取時(shí)間對甲殼素產(chǎn)率的影響

1.2.8.2 酶法 挑選新鮮蝦殼作為制備甲殼素的原料,用清水將蝦殼內(nèi)外表面的異物去除干凈,于60 ℃烘箱中烘干后用粉碎機(jī)粉碎。稱取3份1.00 g蝦殼,分別于100 mL 5% HCl中浸泡4 h至無氣泡冒出,再補(bǔ)加50 mL 5% HCl,浸泡2 h,除去蝦殼中的鈣質(zhì)和無機(jī)鹽,抽濾用蒸餾水洗至中性,干燥。底物濃度為10%(重量百分比),pH8.0,沸水浴15 min,加入蛋白酶0.25%～1%(占反應(yīng)液中蛋白量的百分比),溫度55 ℃,時(shí)間24～48 h,再用沸水浴加熱15 min,冷卻,抽濾,烘干后得白色粉末狀甲殼素,分別計(jì)算甲殼素產(chǎn)率,取平均值[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料添加量對甲殼素產(chǎn)率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表2所示。

由表2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,隨著原料添加量的增加,甲殼素產(chǎn)率先增加后減少,在0.60 g時(shí)達(dá)到最大值,為41.56%，極顯著高于除0.80 g以外的添加量(p<0.01)。

2.1.2 KCl濃度對甲殼素產(chǎn)率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 由表3可知,在一定范圍內(nèi),甲殼素的產(chǎn)率隨著KCl濃度的增加而增加,在0.14 mol/L時(shí)達(dá)到最大值,為49.67%,繼續(xù)增加KCl濃度時(shí),甲殼素產(chǎn)率反而下降,因此選擇0.14 mol/L為KCl的最佳濃度。當(dāng)KCl濃度為0.14 mol/L時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著性差異，(p<0.01)。

2.1.3 萃取時(shí)間對甲殼素產(chǎn)率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 由表4可知:在一定的范圍內(nèi),甲殼素產(chǎn)率隨著萃取時(shí)間的增加而增加,在120 min時(shí)達(dá)到最大值,為49.67%,繼續(xù)增加萃取時(shí)間時(shí),甲殼素產(chǎn)率反而下降。因此選擇120 min為最佳萃取時(shí)間。當(dāng)萃取時(shí)間為120 min時(shí),與其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在極顯著性差異，(p<0.01)。

2.2 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 運(yùn)用Desingn-Expert 6.5.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,并通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步的回歸擬合,可以得到原料添加量、KCl濃度和萃取時(shí)間與甲殼素產(chǎn)率之間的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y(%)=49.67-1.59A+0.22B+2.75C-4.24A2-4.63B2-4.21C2-1.49AB-0.27AC+2.89BC

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回歸模型方差分析的結(jié)果表明,該模型顯著(p<0.005),失擬項(xiàng)不顯著,由此可見,該方程可以比較準(zhǔn)確地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以利用該回歸方程確定最佳配方組成。

表6 回歸模型的方差分析

注：“**”為差異極顯著(p<0.01);“*”為差異顯著(0.01

2.2.2 原料添加量與KCl濃度的交互作用對蝦殼中甲殼素產(chǎn)率的影響 響應(yīng)面圖形的等高線(圖1)表明,當(dāng)萃取時(shí)間為120 min時(shí),原料的添加量與KCl濃度沒有明顯的交互作用。當(dāng)KCl濃度一定時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著原料添加量在0.40～0.60 g范圍內(nèi)的增大而增加,當(dāng)原料添加量大于0.60 g時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著原料添加量的增大而降低。當(dāng)原料添加量一定時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著KCl濃度在0.10～0.14 mol/L范圍內(nèi)的增大而增加,KCl濃度大于0.14 mol/L時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率又隨著KCl濃度的增大而降低。

圖1 原料添加量與KCl濃度的 交互作用對甲殼素產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of raw material content and concentration of KCl interactions on the extraction ratio of chitin

2.2.3 原料添加量與萃取時(shí)間的交互作用對蝦殼中甲殼素產(chǎn)率的影響 響應(yīng)面圖形的等高線(圖2)表明,當(dāng)KCl濃度為0.14 mol/L時(shí),原料添加量與萃取時(shí)間沒有明顯的交互作用。當(dāng)原料添加量一定,萃取時(shí)間在100～120 min范圍內(nèi)時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著萃取時(shí)間的增加而增加;當(dāng)萃取時(shí)間大于120 min時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著萃取時(shí)間的增加而降低。當(dāng)萃取時(shí)間一定,原料添加量在0.40～0.60 g的范圍內(nèi)時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著原料添加量的增加而增加;當(dāng)原料添加量大于0.60 g時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著原料添加量的增加而降低。

圖2 原料添加量與萃取時(shí)間的 交互作用對甲殼素產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of raw material content and extraction time interactions on the extraction ratio of chitin

圖3 KCl濃度與萃取時(shí)間的交互作用對甲殼素產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of concentration of KCl and extraction time interactions on the extraction ratio of chitin

2.2.4 KCl濃度與萃取時(shí)間的交互作用對蝦殼中甲殼素產(chǎn)率的影響 響應(yīng)面圖形的等高線(圖3)表明,當(dāng)原料添加量0.60 g時(shí),KCl濃度與萃取時(shí)間有明顯的交互作用。當(dāng)KCl濃度一定,萃取時(shí)間在100～120 min范圍內(nèi)時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著萃取時(shí)間的增加而增大;萃取時(shí)間大于120 min時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著萃取時(shí)間的增大而降低。當(dāng)萃取時(shí)間一定,KCl濃度在0.10～0.14 mol/L的范圍內(nèi)時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著KCl濃度的增大而增大;當(dāng)KCl濃度大于0.14 mol/L時(shí),蝦殼中甲殼素的產(chǎn)率隨著KCl濃度的增大而降低。

通過分析與研究,得到檸檬酸反相微膠團(tuán)法提取蝦殼中甲殼素的最優(yōu)條件是:原料添加量為0.62 g、KCl濃度為0.15 mol/L、萃取時(shí)間為116.25 min,產(chǎn)率為 47.69%。

實(shí)際進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程中,采用原料添加量為0.62 g、KCl濃度為0.15 mol/L、萃取時(shí)間為116 min,產(chǎn)率為47.32%。

2.3 與成熟工藝的對比

檸檬酸反相微膠團(tuán)法、酸堿法和酶法提取蝦殼中甲殼素產(chǎn)率的對比如表7。

表7 甲殼素產(chǎn)率的對比

由表7可知,檸檬酸反相微膠團(tuán)法甲殼素產(chǎn)率顯著低于傳統(tǒng)的酸堿法,存在極顯著性差異,但檸檬酸反相微膠團(tuán)法甲殼素產(chǎn)率明顯高于酶法,也存在著極顯著性差異。

3 結(jié)論

由單因素實(shí)驗(yàn)總結(jié)可知,檸檬酸反相微膠團(tuán)法在pH9.0提取蝦殼中甲殼素的最佳條件是:原料添加量為0.60 g、KCl濃度為0.14 mol/L、萃取時(shí)間為120 min。通過響應(yīng)面優(yōu)化后,得到檸檬酸反相微膠團(tuán)法提取蝦殼中甲殼素的最優(yōu)條件是:原料添加量為0.62 g、KCl濃度為0.15 mol/L、萃取時(shí)間為116 min。而本實(shí)驗(yàn)方法與酸堿法對比,產(chǎn)率明顯低于傳統(tǒng)的酸堿法,但該方法反應(yīng)條件溫和,用食品級檸檬酸代替鹽酸,不但減小了對環(huán)境的污染,而且還實(shí)現(xiàn)了資源的充分利用;而與酶法相比,檸檬酸反相微膠團(tuán)法的產(chǎn)率極顯著高于酶法,而且還大大節(jié)省了時(shí)間,因此此法是可行的。

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Study on the extraction of chitin from shrimp shell by citric acid-reverse micelles method

ZHANG Zhong,GAO Jia-xin

(Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China)

A novel method of preparing chitin by reverse micelles and citric acid was studied. Chitin was made by means of citric acid and ultrasonic assisted extraction technology to remove inorganic salt and reverse micelles extraction technology to remove protein in the shrimp shell,and 30% hydrogen peroxide for bleaching. Based on the single factor experiment result,through the response surface design,the optimum conditions of extracting chitin by citric acid-reverse micelles method was studied. The results showed that the optimal conditions by citric acid-reverse micelle method were raw material content of 0.62 g,concentration of KCl 0.15 mol/L,extraction time of 116.25 min,and the rate of extraction was 47.32%. The yield of chitin was significantly lower than that of the traditional acid base method,but it was significantly higher than that of the enzyme method. The method is feasible,and it can provide theoretical basis for the improvement of the production process of chitin.

hrimp shell;citric acid;reverse micelle;chitin

2016-08-19

張鐘(1962-)，男，本科，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：47108887@qq.com。

廣東省科技計(jì)劃2015B020230001。

TS254.9

B

1002-0306(2017)05-0269-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.042