獨(dú)活寄生湯對硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型增殖的影響

王武煉　林煜　張怡元　劉振濤　肖莉莉　劉獻(xiàn)祥

[摘要] 目的 探討?yīng)毣罴纳鷾幯鍖ο跗这c誘導(dǎo)的膝軟骨細(xì)胞凋亡模型增殖的影響。 方法 不同濃度硝普鈉（SNP）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，MTT法檢測軟骨細(xì)胞半數(shù)致死量（LD50）的硝普鈉濃度，以確定硝普鈉最佳誘導(dǎo)濃度；10%獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)72 h后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；Hoechst 33258染色，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。qPCR法檢測各組轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1 mM硝普鈉為最佳誘導(dǎo)濃度；含藥血清干預(yù)后，軟骨細(xì)胞的凋亡率降低，干預(yù)組低于模型組，空白組軟骨細(xì)胞中TGF-β1 mRNA的表達(dá)最高，模型組最低，干預(yù)組介于兩組之間，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 獨(dú)活寄生湯含藥血清能抑制硝普鈉誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的膝軟骨細(xì)胞凋亡模型的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 獨(dú)活寄生湯；凋亡；軟骨細(xì)胞；增殖

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）34-0098-03

Effects of parasitic soup on proliferation of chondrocyte apoptosis model induced by sodium nitroprusside

WANG Wulian1 LIN Yu1 ZHANG Yiyuan1 LIU Zhentao1 XIAO Lili1 LIU Xianxiang2

1.Department of Joint Surgery， Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University， Fuzhou 350007， China； 2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350102， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of serum containing parasitic soup on the proliferation of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside. Methods Since different concentrations of sodium nitroprusside （SNP） induced chondrocyte apoptosis，the half-lethal dose（LD50） concentration of sodium nitroprusside sodium nitroprusside（SNP） in chondrocyte cell was determined by MTT assay to determine the optimal concentration of sodium nitroprusside（SNP）. The morphological changes of the cells were observed by light microscope after treated with 10% for 72 h. After being stained by the dye Hoechst 33258， cell apoptosis was observed by fluorescence inversion microscope. The expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） mRNA was detected by qPCR. Results 1 mM sodium nitroprusside was the best induction concentration. The apoptosis rate of chondrocytes decreased after treatment with serum containing drugs，and the apoptosis rate of the intervention group was lower than that of model group.The expression of TGF-β1 mRNA in the chondrocytes in the blank group was the highest， the lowest in the model group and the level of TGF-β1 mRNA in the treatment group was between the two groups. There was significant difference between the three groups（P<0.01）. Conclusion The serum containing parasitic soup can inhibit the apoptosis of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside in vitro.

[Key words] Parasitic soup； Apoptosis； Chondrocytes； proliferation

軟骨細(xì)胞的凋亡是膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的發(fā)生發(fā)展中重要環(huán)節(jié)，而一氧化氮（NO）在軟骨細(xì)胞的凋亡中起著關(guān)鍵作用。前期研究顯示獨(dú)活寄生湯治療OA久痹而致肝腎兩虛，氣血不足證能獲得良好療效[1]。本研究采用硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NO調(diào)控通路，促進(jìn)其凋亡來模擬OA發(fā)展過程，并用獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)凋亡模型，探討?yīng)毣罴纳鷾珜w外軟骨細(xì)胞凋亡模型的影響，為臨床防治KOA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物

2月齡雄性清潔級SD大鼠40只，4周齡SPF級SD大鼠10只[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0011]。獨(dú)活寄生湯劑量及組成參照唐·孫思邈《備急千金要方》原方（廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科）。

1.2 試劑及檢測儀器

DMEM 低糖培養(yǎng)基、BPS、0.25%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司）；胎牛血清（四季青公司）；Ⅱ型膠原酶粉末（Sigma公司）；Hoechst 33258試劑盒（Invitrogen公司）；Prime ScriptTM RT和SYBRR PCR Kit（寶生公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱，Elx800酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），熒光倒置相差顯微鏡（徠卡儀器公司）。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 隨機(jī)將2月齡清潔級雄性SD大鼠40只分為生理鹽水對照組13只[按10 mL/（kg·d）的量給予0.9%生理鹽水]和獨(dú)活寄生湯臨床等效劑量組27只[按9.3 g/（kg·d）的量給予獨(dú)活寄生湯]。連續(xù)灌胃7 d，在末次灌胃2 h后，腹主動(dòng)脈采血、離心，取血清，-20℃凍存。

1.3.2 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定 取4周齡SD大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨，采用Ⅱ型膠原蛋白酶消化法分離軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)調(diào)節(jié)為：5% CO2，1次/2 d更換培養(yǎng)基，采用倒置相差顯微鏡觀察分離的細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁至80%后進(jìn)行傳代。取第2代細(xì)胞爬片Ⅱ型膠原免疫組化法染色，鑒定分離細(xì)胞是否為軟骨細(xì)胞。

1.3.3 確定最佳誘導(dǎo)濃度 將密度為1×104細(xì)胞接種于96孔板，在培養(yǎng)基中加入硝普鈉，終濃度調(diào)整為0、0.5、1、2、3 mM，24 h孵育，MTT檢測細(xì)胞在不同時(shí)間段下的存活率，半數(shù)致死量（LD50）最低的濃度即為最佳干預(yù)濃度。

1.3.4 細(xì)胞分組、形態(tài)觀察及干預(yù) 將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，過夜貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后分為3組。A組空白組（10%空白血清干預(yù)）；B組模型組（硝普鈉誘導(dǎo)凋亡+10%空白血清干預(yù)）；C組干預(yù)組（硝普鈉誘導(dǎo)凋亡+10%獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)）。72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，根據(jù)Hoechst33258說明書對細(xì)胞核染色，之后采用熒光顯微鏡拍照。采集各組軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3.5 qPCR檢測細(xì)胞TGF-β1的表達(dá) 用Trizol提取各組別軟骨細(xì)胞總RNA，并按照說明書逆轉(zhuǎn)錄后在7500PCR儀上擴(kuò)增，最終將所得CT值由軟件換算成最終值。TGF-β1引物：5ACGCAACCAACATCCGCTA 35ACCGGTAAACCAGAGGAAT3；β-actin引物：5 CTTGACGGAGAAAAAGCCTC 35GCACAGTGAGGCTTGAACAA 3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 提取的軟骨細(xì)胞形態(tài)變化及鑒定

剛從膝軟骨分離的軟骨細(xì)胞呈圓形并懸浮于培養(yǎng)液中，1 d后開始貼壁，3 d后貼壁細(xì)胞加速分裂增殖，5 d后軟骨細(xì)胞呈鋪路石樣并成簇生長；培養(yǎng)至第8 d細(xì)胞增殖鋪滿瓶底。培養(yǎng)過程可見第2、3代細(xì)胞增殖速度最快、分泌基質(zhì)的能力最強(qiáng)；當(dāng)傳至第4代后，細(xì)胞增殖速度減慢、體積增大、細(xì)胞核變大、胞膜和胞漿逐漸變模糊，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，呈纖維細(xì)胞樣改變。免疫組化鑒定顯示：培養(yǎng)的細(xì)胞胞核不著色，胞漿呈棕黃色，即提取的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)呈陽性（圖1）。

2.2硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的劑量關(guān)系

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著SNP濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸降低，具有濃度依賴性（圖2）。結(jié)果顯示半數(shù)致死率（LD50）為（1.145±0.073）mM。因此，本研究中選用1 mM SNP孵育24 h來誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡模型。

2.3 獨(dú)活寄生湯含藥對SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模型細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響

硝普鈉干預(yù)軟骨細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞形態(tài)變化明顯：空白組細(xì)胞成簇生長，形態(tài)規(guī)則、邊界清楚，以梭形和橢圓形為主，細(xì)胞核邊緣整齊、大小較均一（封三圖4A）；SNP誘導(dǎo)后，細(xì)胞變圓、變亮或萎縮，甚至相互分離或浮動(dòng)在培養(yǎng)液中，細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核致密濃縮、核變亮、核碎裂或月牙狀等細(xì)胞凋亡特征（封三圖4B）；經(jīng)過獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)后，變圓、變亮或萎縮，甚至相互分離或浮動(dòng)在培養(yǎng)液中的細(xì)胞明顯減少（封三圖4C）。

2.4 獨(dú)活寄生湯含藥血清對軟骨細(xì)胞凋亡模型TGF-β1的影響

SNP干預(yù)軟骨細(xì)胞24 h后：空白組軟骨細(xì)胞中TGF-β1mRNA的表達(dá)最高相對表達(dá)量為1，模型組最低為（0.452±0.012），干預(yù)組介于二組之間為（0.653±0.023），各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

當(dāng)前軟骨細(xì)胞的提取多采用兩種酶聯(lián)合序貫消化法，但是由于分離步驟較多、操作復(fù)雜，且同時(shí)使用可能會(huì)對軟骨細(xì)胞造成損傷[2-5]。有研究單純采用Ⅱ型膠原蛋白酶分離膝軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示分離后軟骨細(xì)胞活性良好[6，7]。因此本研究采用Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠膝軟骨細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)采用此法不僅簡化了分離的步驟，還減少了因多種酶反復(fù)消化、洗滌、離心而對軟骨細(xì)胞造成的損傷，從而使分離獲得的細(xì)胞具有良好的活性。在原代軟骨細(xì)胞貼壁傳代后軟骨細(xì)胞貼壁和增殖的速率均加快，傳代至第2、3代細(xì)胞增殖速度最快、分泌基質(zhì)的能力最強(qiáng)，第4代后則呈“去分化”現(xiàn)象，這與之前文獻(xiàn)研究結(jié)論相一致[8-10]。

KOA軟骨細(xì)胞凋亡主要通過NO誘導(dǎo)途徑和Fas介導(dǎo)途徑發(fā)生，其中以NO依賴通路更重要[11]。硝普鈉是一種由NO產(chǎn)生的供體，在KOA的發(fā)生早期階段， NO產(chǎn)生的硝普鈉等供體可誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞凋亡且存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，因此NO及其產(chǎn)物升高導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡是KOA發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制[12，13]。因此，SNP作為NO的一種供體能模擬KOA患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)的微環(huán)境，復(fù)制體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡的過程。TGF-β1是軟骨的生長和重建的重要因子，影響著軟骨細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)發(fā)揮軟骨誘導(dǎo)作用、促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成起著關(guān)鍵的作用。軟骨細(xì)胞凋亡模型中的TGF-β1的表達(dá)與其細(xì)胞狀態(tài)和增殖能力呈正相關(guān)，并最終與KOA的病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)性[14，15]。

本文利用硝普鈉復(fù)制軟骨細(xì)胞的凋亡模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SNP濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸降低，且具有濃度依賴性。而經(jīng)過獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)后，培養(yǎng)液中的凋亡細(xì)胞明顯減少，表明獨(dú)活寄生湯含藥血清能抑制硝普鈉誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的膝軟骨細(xì)胞凋亡模型的凋亡。同時(shí)本研究采用Hoechst 33258染色觀察其對軟骨細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核致密濃縮、核變亮、核碎裂或月牙狀等細(xì)胞凋亡特征，經(jīng)過獨(dú)活寄生湯含藥血清干預(yù)后，凋亡軟骨細(xì)胞明顯降低，而各組細(xì)胞中以空白組中TGF-β1mRNA的表達(dá)最高，模型組最低，干預(yù)組介于兩組之間，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明獨(dú)活寄生湯可能通過抑制NO產(chǎn)生，提高軟骨細(xì)胞的凋亡模型中TGF-β1的表達(dá)，發(fā)揮抑制軟骨細(xì)胞的凋亡模型其退變的作用?？傊?dú)活寄生湯含藥血清能抑制硝普鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模型的凋亡，這可能是獨(dú)活寄生湯治療KOA的機(jī)制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 吳廣文，褚劍鋒，許惠鳳，等. 獨(dú)活寄生湯的藥理作用及其在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用[J]. 中醫(yī)正骨，2012，24（1）：37-39.

[2] Iakoubov R，Ahmed A，Lauffer LM，et al. Essential role for protein kinase Cζ in oleic acid-induced glucagon-like peptide-1 secretion in vivo in the rat[J]. Endocrinology，2011， 152（4）：1244-1252.

[3] Zhao H，Liu J，Song L，et al. Oleanolic acid rejuvenates testicular function through attenuating germ cell DNA damage and apoptosis via deactivation of NF-κB，p53 and p38 signalling pathways[J]. J Pharm Pharmacol，2016，9（10）：1111.

[4] 張艷，柴崗，劉偉，等. 體外培養(yǎng)過程中去分化的人軟骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化[J]. 中華整形外科雜志，2007， 23（4）：331-334.

[5] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)[M]. 北京：世界圖書出版社，2004：250-252.

[6] Ryu JH，Chun JS. Opposing roles of WNT-5A and WNT-11 in interleukin-1 beta regulation of type Ⅱ collagen expression in articular chondrocytes[J]. J Bilo Chem，2006，281（31）：22039-22047.

[7] Nalesso G，Thomas BL，Sherwood JC，et al. WNT16 antagonises excessive canonical WNT activation and protects cartilage in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis，2017，76（1）：218-226.

[8] Irie Y，Mizumoto H，F(xiàn)ujino S，et al. Reconstruction of cartilage tissue using scaffold-free organoid culture technique[J]. J Biosci Bioeng，2008，105（5）：450-453.

[9] Huang Y，Wan G，Tao J. C1q/TNF-related protein-3 exerts the chondroprotective effects in IL-1β-treated SW1353 cells by regulating the FGFR1 signaling[J]. Biomed Pharmacother，2016，85（32）：41-46.

[10] 劉小榮，張?bào)?，高武，? 新西蘭兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012， 33（19）：2307-2312.

[11] Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors[J]. Cancer，2000，89（12）：2637-2645.

[12] Li H，Huang L，Xie Q，et al. Study on the effects of gradient mechanical pressures on the proliferation，apoptosis，chondrogenesis and hypertrophy of mandibular condylar chondrocytes in vitro[J]. Arch Oral Biol，2017， 73（13）：186-192.

[13] Shen P，Li X，Xie G，et al. Time-dependent effects of arthroscopic conditions on human articular cartilage：An in vivo study[J]. Arthroscopy，2016，32（12）：2582-2591.

[14] Yoshifusa A，Toru S，Craig B. TGF-β1 stimulates mitochondrial oxidative phosphorylation and generation of reactive oxygen species in cultured mouse podocytes，mediated in part by the mTOR pathway[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2013，305（10）：1477- 1490.

[15] Blanco FJ，Ochs RL，Schwarz H，et al. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide[J]. Am J Pathol，1995，141（1）：75-85.

（收稿日期：2016-09-23）