炙甘草湯含藥血清對(duì)兔離體膀胱平滑肌的作用

海青山 楊榆青 孟卓然 汝晶 金亞菊

摘要：目的觀察炙甘草湯含藥血清對(duì)正常家兔離體膀胱平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響，探討其作用機(jī)制。方法運(yùn)[JP]用Powerlab生物信號(hào)系統(tǒng)記錄家兔離體膀胱平滑肌標(biāo)本的活動(dòng)，觀察不同濃度組炙甘草湯含藥血清對(duì)膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度、收縮頻率和活動(dòng)力的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，空白血清和炙甘草湯含藥血清各濃度組均可以不同程度增加膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度（低濃度血清組P<001，空白血清、中濃度和高濃度血清組（P<005），但含藥血清組與空白血清組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較，低濃度血清組可增加膀胱平滑肌收縮頻率（P<001），與空白血清組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低濃度血清組與空白血清組比較，可增加膀胱平滑肌活動(dòng)力（P<005）。在低濃度血清組基礎(chǔ)上應(yīng)用阻斷劑，維拉帕米可以降低膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度（P<005），阿托品可以降低膀胱平滑肌收縮頻率（P<001），且均可降低膀胱活動(dòng)力（P<005）。結(jié)論炙甘草湯含藥血清可以增強(qiáng)膀胱平滑肌活動(dòng)力，該作用通過(guò)鈣通道、M受體起作用。

關(guān)鍵詞：炙甘草湯；含藥血清；膀胱平滑肌

中圖分類號(hào)：R2855文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）05-0021-05

[WT5HZ][JZ]Effect of Zhigancao Decoction Containing Serum on Rabbits Isolated Vascular Smooth Muscle

[WT5BZ][JZ]HAI Qing-shan， YANG Yu-qing， MENG Zo-ran， RU Jing， JIN Ya-ju

[WT5"BX][JZ]（1. School of Basic Medical Sciences， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan； [JZ]2. School of Acupuncture and Massage Rehabilitation， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan）

[WT5HZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To observe the effect of Zhigancao Decoction containing serum on the movement of bladder smooth muscle in normal rabbits and to explore its mechanism. Methods： The activity of bladder smooth muscle in rabbits was recorded by using Powerlab biological signal system. The effects of different concentrations of Zhigancao Decoction on contraction intensity， the contraction frequency and activity of bladder smooth muscle were observed. Results： Compared with the blank control group， the blank serum group and groups of different concentration of Zhigancao Decoction containing serum could increase the contraction intensity of the bladder smooth muscle （the low concentration serum group， P<0.01， the blank serum， medium concentration and high concentration serum groups， P< 0.05）， but there was no significant difference between the drug serum group and the blank serum group. Compared with the blank control group， the low concentration serum group could increase the contraction frequency of the bladder smooth muscle （P<0.01）. In the low concentration serum group based on the application of blockers， verapamil could reduce the contraction intensity of bladder smooth muscle （P<0.05） and atropine could decrease the contraction frequency of bladder smooth muscle （P<0.01）， and also decrease the activity of bladder （P<0.05）. Conclusion： Zhigancao Decoction containing serum can promote the activity of bladder smooth muscle， which can act through calcium channel and M receptor.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Zhigancao Decoction， drug-containing serum， bladder smooth muscle

炙甘草湯方出自《傷寒論》，主要治療“脈結(jié)代”，又名復(fù)脈湯。在臨床報(bào)道中，多用于治療心律失常和心血管相關(guān)疾病[1-2]。但文獻(xiàn)報(bào)道顯示，炙甘草湯的治療范圍可能不僅限于心血管系統(tǒng)，對(duì)氣血兩虛的多個(gè)系統(tǒng)疾病均有作用[3]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯含藥血清對(duì)血管平滑肌和子宮平滑肌均有不同程度的作用，文獻(xiàn)顯示其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)鈣離子通道和相應(yīng)受體有關(guān)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察炙甘草湯含藥血清對(duì)離體膀胱平滑肌的作用，探討炙甘草湯對(duì)各系統(tǒng)平滑肌作用機(jī)制的共性。

1材料與方法

11試劑與儀器炙甘草湯方（炙甘草、麥冬、火麻仁、人參、阿膠、生地黃、桂枝、生姜、大棗、清酒）、離心機(jī)、恒溫水浴鍋（DZKW-C；北京光明醫(yī)療儀器廠）、洛氏（Locke）液（g/L：NaCl 80，KCl 02，MgCl2 01，CaCl2 02，NaHCO3 10，NaH2PO4 005，Glucose 111）、異博定（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、阿托品（浙江醫(yī)藥股份有限公司）、普萘洛爾（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司）、Powerlab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司）、自動(dòng)離體組織恒溫平滑肌槽（西班牙PANLAB公司）、張力換能器（西班牙PANLAB公司）、哺乳動(dòng)物手術(shù)器材、混合氣體（95% O2 + 5% CO2，昆明氧氣有限公司）。

12動(dòng)物清潔級(jí)雌性日本大耳白兔24只，未孕，體重2-25 kg，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滇）2011-2014。

13方法

131炙甘草湯水煎劑制備炙甘草、麥冬、火麻仁各12 g，人參、阿膠各6 g，生地黃50 g，桂枝、生姜各9 g，大棗15 g[7]。原方比例不變，煎煮時(shí)加清酒50 mL，濃縮成含生藥450%的濃縮液，于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

132炙甘草湯含藥血清和空白血清制備日本大耳白兔14只，隨機(jī)分為四組：炙甘草湯低劑量組6只；炙甘草湯中劑量組2只；炙甘草湯高劑量組2只；空白對(duì)照組2只。灌胃給藥：藥物組每日給予炙甘草水煎液，每日2次，共3天，劑量分別為：115 g/kg·次、23 g/kg·次、46 g/kg·次?？瞻捉M給予等容積的生理鹽水。末次灌藥前禁食12 h，不禁水，給藥后15 h頸部手術(shù)，頸動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存待用[8]。

133兔離體膀胱平滑肌條標(biāo)本制備大耳白兔，鈍性擊昏，迅速剪開腹腔，取出膀胱，立即放于盛有洛氏液的玻璃平皿內(nèi)，小心清除殘留結(jié)締組織，制備成5 mm×2 mm膀胱平滑肌標(biāo)本條。一端固定于L型通氣道小鉤上，另一端與換能器相連。

134炙甘草湯含藥血清對(duì)兔離體膀胱平滑肌影響的離體實(shí)驗(yàn)將膀胱平滑肌條標(biāo)本懸掛于含（375±05）℃洛氏液恒溫平滑肌槽中，連接張力換能器，通入95% O2 + 5% CO2的混合氣體，給予基礎(chǔ)張力2 g，用Powerlab生物信號(hào)系統(tǒng)記錄收縮波，穩(wěn)定45 min，每15 min換液一次。待標(biāo)本平衡后，開始實(shí)驗(yàn)。Powerlab生物信號(hào)系統(tǒng)記錄收縮波，觀察標(biāo)本的收縮強(qiáng)度（g）、收縮頻率（次/10 min）和活動(dòng)力（g·次/10 min）。每次實(shí)驗(yàn)后，用37℃洛氏液沖洗3次，使標(biāo)本張力恢復(fù)至基線再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

膀胱活動(dòng)力（g·次/10 min）=收縮強(qiáng)度（g）×收縮頻率（次/10 min）

14統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS140軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料的自身前后對(duì)比，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<005時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21不同濃度炙甘草湯含藥血清對(duì)兔離體膀胱平滑肌的影響在恒溫平滑肌槽中分別加入空白血清和不同濃度炙甘草湯含藥血清，觀測(cè)標(biāo)本收縮強(qiáng)度、收縮頻率、膀胱活動(dòng)力的變化。結(jié)果見表1。

與空白對(duì)照組比較，空白血清組和低、中、高濃度炙甘草湯含藥血清組均能夠明顯增強(qiáng)膀胱平滑肌條收縮強(qiáng)度（低濃度血清組P<001；空白血清和中、高濃度血清組P<005）。低濃度含藥血清組可增加膀胱平滑肌的收縮頻率（P<001）。空白血清組與低、中濃度含藥血清組對(duì)膀胱活動(dòng)力具有明顯的增強(qiáng)作用（空白血清和低濃度血清組P<001；中濃度血清組P<005）。

與空白血清組比較，炙甘草湯低濃度含藥血清組對(duì)膀胱平滑肌的收縮強(qiáng)度和頻率的影響不明顯（P >005），但增強(qiáng)膀胱平滑肌活動(dòng)力的作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。中濃度和高濃度炙甘草湯含藥血清對(duì)膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度、收縮頻率和活動(dòng)力的影響與空白血清組比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

32炙甘草湯低濃度含藥血清加阻斷劑對(duì)兔離體膀胱平滑肌的影響在恒溫平滑肌槽中先滴加體積濃度比為10%的低濃度含藥血清作為對(duì)照，分別加入不同受體阻斷劑。結(jié)果見表2。

4討論

41炙甘草湯含藥血清對(duì)兔膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度的作用如圖1所示，各濃度炙甘草湯含藥血清組均能明顯的增加膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度。以作用最強(qiáng)的低濃度含藥血清組作對(duì)照，應(yīng)用三種不同的受體和通道阻斷劑：維拉帕米、阿托品和普萘洛爾，分別阻斷鈣通道、M受體和β受體，觀察膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度的變化，僅維拉帕米可降低膀胱平滑肌的收縮強(qiáng)度。說(shuō)明，炙甘草湯含藥血清對(duì)膀胱平滑肌的興奮作用與血清中可興奮鈣通道的生物活性成分有關(guān)，與M受體和β受體無(wú)關(guān)。維拉帕米作為一種鈣通道阻滯劑能抑制Ca2+內(nèi)流，炙甘草湯含藥血清有可能通過(guò)增加Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而使Ca2+與肌鈣蛋白的結(jié)合加強(qiáng)，橫橋和細(xì)肌絲的結(jié)合增加，進(jìn)而增加膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度。這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果相似[6，9]。但空白血清自身含有的生物活性成分也顯示出類似的興奮膀胱平滑肌的作用，提示空白血清中也含有興奮鈣通道的生物活性成分。排除空白血清自身的作用，含藥血清對(duì)膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度的作用不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明興奮鈣通道的生物活性成分與炙甘草湯誘導(dǎo)作用尚無(wú)確切的相關(guān)性。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，或可通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)例數(shù)確定。

42炙甘草湯含藥血清對(duì)兔膀胱平滑肌收縮頻率的作用如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，僅低濃度炙甘草湯含藥血清組有明顯的增加膀胱平滑肌收縮頻率的作用。在低濃度含藥血清作用的基礎(chǔ)上，分別用維拉帕米、阿托品和普萘洛爾阻斷鈣通道、M和β受體。結(jié)果顯示，阿托品則對(duì)膀胱平滑肌的收縮頻率具有降低的效果，說(shuō)明炙甘草湯含藥血清增加膀胱平滑肌頻率的作用與M受體有關(guān)。M毒蕈堿型受體廣泛的存在與平滑肌中，M受體興奮時(shí)可引起平滑肌收縮頻率增加。但排除空白血清自身的作用后，低濃度含藥血清組增加膀胱平滑肌收縮頻率的作用就不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義了。說(shuō)明血清中含有興奮M受體的生物活性成分，如乙酰膽堿（Ach）等，可以引起類似的增強(qiáng)膀胱平滑肌收縮頻率的作用。炙甘草湯能否誘導(dǎo)血清中Ach或類似Ach的活性成分的增加，尚無(wú)確切的依據(jù)。

43炙甘草湯含藥血清對(duì)兔膀胱平滑肌活動(dòng)力的作用如圖3所示，膀胱活動(dòng)力疊加了收縮強(qiáng)度和收縮頻率兩個(gè)影響因素。低、中濃度炙甘草湯含藥血清組均顯示出增加膀胱平滑肌活動(dòng)力的作用。排除空白血清自身作用后，低濃度含藥血清依然可增強(qiáng)膀胱平滑肌的活動(dòng)力。以低濃度含藥血清組作對(duì)照，維拉帕米和阿托品均能夠阻斷低濃度炙甘草湯血清的興奮作用。說(shuō)明，炙甘草湯低濃度含藥血清對(duì)膀胱平滑肌的興奮作用可能通過(guò)兩條途徑有關(guān)，一方面興奮鈣通道，增加Ca2+內(nèi)流，增加膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度；另一方面興奮M受體，增加膀胱平滑肌收縮頻率。但其興奮作用沒(méi)有濃度依賴性的增加，可能與其雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)[1]。說(shuō)明在劑量增加的情況下誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)發(fā)生了變化，興奮作用反而減弱。[KG）]

5結(jié)論

低濃度炙甘草湯含藥血清組對(duì)膀胱平滑肌條具有興奮作用，隨著劑量的增加其興奮作用反而減弱，這與劑量增加的情況下誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)發(fā)生變化有關(guān)。炙甘草含藥血清對(duì)增加膀胱平滑肌收縮強(qiáng)度和收縮頻率的單一影響不確定，但疊加收縮強(qiáng)度和頻率兩種因素后，低濃度炙甘草湯含藥血清對(duì)膀胱的興奮作用確切。通過(guò)添加阻斷劑反向證明，炙甘草湯低濃度含藥血清對(duì)膀胱平滑肌的興奮作用可能與興奮鈣通道和M受體兩條途徑有關(guān)。該機(jī)制可能是炙甘草湯對(duì)各系統(tǒng)平滑肌作用的共性基礎(chǔ)[4-5]。炙甘草湯興奮鈣通道是通過(guò)哪些中間產(chǎn)物[FL）][SD1，1][FQ（11*3/2。175mm，X，DY-W][SQ+1mm][CD=175mm]發(fā)揮作用，興奮M受體的作用是否與Ach相關(guān)，其雙向調(diào)節(jié)作用的機(jī)制與誘導(dǎo)血清內(nèi)成分改變的關(guān)系等，還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。[KH*1D]

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