• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    施氏假單胞菌胞內(nèi)NapA/NapB蛋白的多克隆抗體制備及蛋白免疫印跡分析

    2019-11-19 01:51:10柴曉利
    山東化工 2019年20期
    關(guān)鍵詞:包被印跡效價

    周 萌,柴曉利

    (同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092)

    聚羥基脂肪酸酯(PHAs)是存在于細(xì)胞質(zhì)中被膜包圍的直徑0.2~0.5 μm的微粒,由于其低水溶性和高分子質(zhì)量,也是理想的碳能量貯存物質(zhì)。PHAs的合成需要還原性輔酶I,其來源有兩種觀點:一是由乙酰輔酶通過三梭酸循環(huán)產(chǎn)生[1],一是細(xì)胞內(nèi)糖原降解產(chǎn)生[2]。其中,第二種觀點被廣泛接受。PHAs的貯存通常發(fā)生在電子供體與受體的來源不穩(wěn)定的條件下,有碳源儲備的細(xì)菌相比沒有碳源儲備的細(xì)菌而言,更具競爭優(yōu)勢。最常見的PHAs是聚羥基丁酸酯(PHB),在能以PHB為碳源的細(xì)菌胞內(nèi)存在PHB水解酶,在這類酶的作用下細(xì)菌完成對PHB的降解。許多能利用PHB的細(xì)菌也能以硝酸鹽作為電子受體,如Comamonadaceae[3],Brevundimonas[4]和Acidovorax[5]等。當(dāng)營養(yǎng)條件受到限制時,這些細(xì)菌就會從以氧氣為電子受體轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵跛猁}為電子受體。

    在反硝化脫氮過程中,硝態(tài)氮是電子受體,外加有機(jī)碳源是間接電子供體,直接電子供體是有機(jī)碳源在細(xì)菌體內(nèi)合成的PHAs。對于內(nèi)源反硝化,在碳氮比相對較高的環(huán)境下PHAs才會積累,因此已有的研究主要關(guān)注如何通過改變工藝條件提高PHAs的合成量[6-7]。大部分的反硝化細(xì)菌都是兼性厭氧菌,在氧氣作為更高效的電子受體存在時,通過直接競爭或是酶的作用抑制反硝化過程。Schulthess和Gujer[8]首次報道了低C/N比進(jìn)水條件下,反硝化過程中不同價態(tài)氮素(硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氧化亞氮)的共存對還原效率具有抑制作用,這是由于異養(yǎng)反硝化細(xì)菌可以利用多種胞外碳源作為電子供體,相互之間產(chǎn)生競爭。Pan[9]等人也報道了在反硝化系統(tǒng)中甲醇作唯一碳源,當(dāng)外界碳源過量時發(fā)生了類似的“電子競爭”效應(yīng)。

    在先前的研究中,為探究碳源對微生物生長代謝的影響機(jī)理,筆者利用組學(xué)手段宏觀分析了細(xì)菌體內(nèi)蛋白的變化水平,發(fā)現(xiàn)在不同碳源培養(yǎng)條件下,典型反硝化細(xì)菌施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)胞內(nèi)NapA及NapB的蛋白表達(dá)量有明顯變化,且這兩種蛋白質(zhì)與硝酸鹽還原過程息息相關(guān)[10-11]。宏蛋白組學(xué)可以覆蓋到多個代謝途徑的蛋白,但對儀器有特殊需求且檢測成本較高。為更深入地探究碳源和細(xì)菌生長代謝的內(nèi)在聯(lián)系,需要進(jìn)一步驗證PHAs對兩種蛋白的調(diào)控作用,擬通過免疫學(xué)手段直接檢測細(xì)菌體內(nèi)NapA和NapB的含量。蛋白免疫印跡法是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗原抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測的方法。經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體如PVDF膜上,能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,和特異性抗體結(jié)合,再與標(biāo)記過的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色以達(dá)到檢測的目的[12]。蛋白免疫印跡已被廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá),本研究針對已知的蛋白NapA和NapB,選取多肽片段合成抗原,作用于免疫對象使其產(chǎn)生特異性抗體,并將抗體用于施氏假單胞菌胞內(nèi)目標(biāo)蛋白檢測,旨在建立較為成熟的免疫印跡方法,為進(jìn)一步研究碳源對微生物生長代謝的影響機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 菌種及其培養(yǎng)條件

    實驗用菌種(CICC 10428)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,活化后接種至LB培養(yǎng)基中,于30℃ 160r/min條件下培養(yǎng)。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    對照組培養(yǎng)基A:CH3COONa 10g,KNO32.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,KH2PO40.5g,微量元素溶液 2mL,用蒸餾水定容至1L pH值 7.2。實驗組培養(yǎng)基B:其他條件不變,將對照組中的10g CH3COONa換成10g PHA。其中微量元素溶液:EDTA 50.0g,ZnSO42.2g,CaCl25.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4·7H2O 5.0g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.61g,溶解后用蒸餾水定容至1 L pH值 7.0。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 單一碳對照試驗

    將配置好的培養(yǎng)基A/B分裝至250mL錐形瓶中,每個錐形瓶100mL培養(yǎng)液,編號A1/A2/B1/B2,進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液各1mL接種至四個錐形瓶中,于30℃、160 r/min 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。48h后取菌液在4℃ 12000 g條件下離心10min,去除上清液后用PBS清洗三次,每一步完成后經(jīng)4℃ 12000 g離心5min。將樣品放入-80℃冰箱備用。

    1.2.2 免疫原的制備與免疫過程

    根據(jù)蛋白序列選擇如下幾個肽段進(jìn)行合成(表1):

    表1 NapA和NapB的抗原合成肽段序列Tab.e 1 Synthetic peptides of NapA and NapB antigen

    采用Fmoc固相合成法[13]從多肽的羧基端向氨基端合成得到多肽樹脂,用TFA法將多肽從樹脂上切割下來,粗提后得到粗品,再經(jīng)高效液相色譜儀C18反相色譜分離柱分離純化后冷凍抽干。取純化后的多肽10mg與血藍(lán)蛋白15mg在縮合劑的催化下進(jìn)行縮合反應(yīng),得到多肽-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物,即為免疫原。

    取四只健康、大小相近的新西蘭大白兔Luran、Viran、Blubb和Resan,進(jìn)行病原菌檢疫后,經(jīng)過一周的觀察,兔子皮毛光澤且飲食正常,可進(jìn)行免疫。免疫原與等量的弗氏完全佐劑(FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)充分乳化后,分別在兔子背部皮內(nèi)多點注射。免疫程序見表2。最后一次免疫后得到的抗血清,經(jīng)ProteinA親和層析柱純化,得到純化后抗體lg G。

    表2 免疫程序Tab.e 2 Immune schedule

    1.2.3 ELISA效價測定

    將抗原稀釋在包被緩沖液0.1M NaHCO3溶液中,使多肽片段的包被濃度為4 μg/mL。用抗原包被液包被酶聯(lián)反應(yīng)板,每孔100 μL,并用塑料薄膜蓋住酶聯(lián)反應(yīng)板以防溶液揮發(fā),37℃包被2h。包被完成后用ELISA wash buffer(1% NaCl,0.05% Tween 20)清洗反應(yīng)板3次,每次停留5min,濾紙上拍干備用。在包被好的酶聯(lián)板中每孔先加入100uL PBST,取第3次免疫后兩周的兔抗血清,按1∶11稀釋。向第一個孔中加入10 μL稀釋后的血清,用槍頭輕輕吸取若干次使其混勻。再從第一個孔中吸取10 μL液體到下一個孔中,重復(fù)以上操作。最后一孔用免疫前的兔血清做陰性對照,37℃孵育1h并在搖床上振蕩10min,用ELISA wash buffer洗滌3次,每次停留5min,拍干。用PBST按1∶20000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Agrisera,AS09 602),振蕩器上孵育30min,再用ELISA wash buffer洗滌。顯色劑為TMB顯色液(AS15 TMB-HRP),每孔加入100 μL,然后加入終止反應(yīng)液,30min內(nèi)在450nm處讀數(shù)。

    1.2.4 蛋白免疫印跡鑒定

    取出-80℃保存的樣品,每組加100μL RIPA裂解液,裂解液中已經(jīng)加入1mM PMSF,以及廣譜蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑。超聲3次,每次5 s,冰上裂解2 h。4℃ 12000 g高速離心10 min,吸取上清液用于蛋白定量。每孔200μL BCA液與4μL硫酸銅溶液,配制成BCA 蛋白定量工作液使用。37°C恒溫下孵育30 min,讀取酶標(biāo)儀讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度,并最終將濃度調(diào)整為2μg/μL。

    根據(jù)目的蛋白的分子量,配制10%和15%的分離膠,濃縮膠為5%。樣品中加入5X loading buffer,充分混勻后,沸水浴10min,使蛋白質(zhì)變性。電泳條件:濃縮膠恒壓90V約20min;分離膠恒壓160V,通過預(yù)染蛋白Marker來確定電泳停止時間。電泳時兩塊凝膠同時進(jìn)行,其中一塊凝膠用來考馬斯亮藍(lán)染色,確保蛋白質(zhì)分離。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜:300mA恒流,0.45μm孔徑PVDF膜,轉(zhuǎn)膜時間60min。轉(zhuǎn)膜完成后,用麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色,觀察轉(zhuǎn)膜效果。然后將膜浸沒在5% BSA-TBST中室溫下輕搖60min。棄去封閉液,用TBST清洗5次,每次3min。用5% BSA-TBST稀釋一抗,室溫孵育15min,放4℃過夜。倒掉一抗稀釋液,TBST洗5次,每次3min。用5% NFDM-TBST稀釋二抗,加入識別對應(yīng)一抗的HRP標(biāo)記二抗,

    1∶5000稀釋,室溫輕搖40mins。ECL加到膜上后反應(yīng)3~5min,膠片曝光10s到5min(曝光時間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整),顯影2min,定影。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗體效價檢測結(jié)果

    圖1 抗NapA的血清效價

    Fig.1 Serum titer of anti-NapA antibody

    圖2 抗NapB的血清效價Fig.2 Serum titer of anti-NapB antibody

    用合成的多肽作為包被源,包被濃度4 μg/mL,四只小鼠第三次免疫后兩周的血清按照1∶121,1∶1331,1∶14641,1∶161051的比例稀釋。根據(jù)ELISA結(jié)果對其效價進(jìn)行分析,對NapA,Luran和Virkat產(chǎn)生的血清多抗效價為1∶14000(圖1),而對NapB,Blubb產(chǎn)生的血清多抗效價為1∶160000,Resan產(chǎn)生的血清多抗效價更高大于1∶160000(圖2)。

    2.2 蛋白免疫印跡結(jié)果

    圖3 菌體內(nèi)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

    Fig.3 SDS-PAGE of proteins extracted from strains

    圖4 菌體內(nèi)蛋白的Western Blotting分析Fig.4 Western Blotting of proteins extracted from strains

    SDA-PAGE結(jié)果如圖3所示,各組樣品都有明顯分離,且在低蛋白分子量區(qū)域更為明顯。對菌體內(nèi)提取的總蛋白進(jìn)行免疫印跡分析,與合成的NapA及NapB抗體進(jìn)行反應(yīng),實驗結(jié)果表明在四組樣品中在30-40KDa附近的條帶清晰可見且較為整齊,在100KDa和15KDa附近也出現(xiàn)了明顯的反應(yīng)帶(圖4)。

    3 討論

    本研究選取三個片段進(jìn)行多肽合成,制備了免疫原,并通過免疫兔子獲得了NapA和NapB蛋白的多克隆抗體。免疫效果的好壞對抗體制備及后續(xù)免疫印跡分析可靠性有直接影響,故需要一系列的驗證試驗。ELISA檢測結(jié)果表明,制備的NapA和NapB免疫抗原均能夠針對實驗兔子產(chǎn)生良好的免疫效果。NapB免疫原效果甚佳,血清效價大于1∶160000,NapA免疫原的效價也可以達(dá)到1∶14000。

    與單克隆抗體不同,多克隆抗體無法進(jìn)行敏感性分析,效價相對較低的抗體在免疫印跡分析中可能也會對目標(biāo)蛋白產(chǎn)生敏感可靠的反應(yīng)[14]。選取Virkat和Blubb產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行后續(xù)Western Blot實驗,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫,目標(biāo)蛋白NapA和NapB的理論蛋白質(zhì)分子量分別約為93KDa和16KDa,所選的內(nèi)參蛋白GADPH為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶,檢測條帶一般為36KDa[15]。本研究中的內(nèi)參條帶清晰且整齊,在目標(biāo)條帶區(qū)域也可以看到明顯反應(yīng)帶,說明制備出的抗體可針對NapA或NapB進(jìn)行免疫印跡分析。

    一般而言內(nèi)參蛋白在同種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量一般恒定且不受誘導(dǎo)物質(zhì)影響,若對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析,可通過內(nèi)參蛋白實現(xiàn)半定量。后續(xù)試驗中將改變施氏假單胞菌培養(yǎng)過程中的碳源條件,進(jìn)一步測定NapA及NapB的含量變化,探究其內(nèi)在聯(lián)系。

    4 結(jié)論

    本研究中制備的多克隆抗體具有良好的免疫性能,可用于檢測施氏假單胞菌胞內(nèi)的NapA及NapB蛋白,特異性強(qiáng)且成本相對較低。選取GADPH作為內(nèi)參蛋白,后續(xù)研究改變實驗條件,還可通過灰度分析進(jìn)行半定量。

    猜你喜歡
    包被印跡效價
    多糖包被在急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生、診斷及治療中的作用研究進(jìn)展
    馬 浩
    陶瓷研究(2022年3期)2022-08-19 07:15:18
    情緒效價的記憶增強(qiáng)效應(yīng):存儲或提取優(yōu)勢?
    走進(jìn)大美滇西·探尋紅色印跡
    云南畫報(2021年10期)2021-11-24 01:06:56
    ELISA兩種包被方法在牛乳氯霉素測定中的比較
    成長印跡
    應(yīng)用HyD在仔豬斷奶早期可提高維生素D的效價
    坐公交
    上海故事(2015年13期)2016-01-22 13:25:09
    跟一天了
    伴侶(2015年5期)2015-09-10 07:22:44
    如何提高抗生素效價管碟測定法的準(zhǔn)確性
    国产一级毛片在线| 久久久久久久久大av| 国产熟女欧美一区二区| 99久久精品一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 麻豆成人午夜福利视频| 99视频精品全部免费 在线| 白带黄色成豆腐渣| 中文在线观看免费www的网站| 又爽又黄无遮挡网站| 大片电影免费在线观看免费| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲人成网站在线观看播放| 免费大片18禁| 一级毛片电影观看| 嫩草影院精品99| 一本色道久久久久久精品综合| 人体艺术视频欧美日本| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av.在线天堂| 97超碰精品成人国产| 免费少妇av软件| 伊人久久国产一区二区| 秋霞在线观看毛片| 中文字幕免费在线视频6| 99热全是精品| 久久久久性生活片| 日本一二三区视频观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲欧洲国产日韩| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产黄a三级三级三级人| 一级二级三级毛片免费看| 校园人妻丝袜中文字幕| 性插视频无遮挡在线免费观看| 18禁在线播放成人免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久精品欧美日韩精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产精品专区欧美| 精品午夜福利在线看| 又大又黄又爽视频免费| 成人国产麻豆网| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲国产精品999| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品久久久久久久性| 偷拍熟女少妇极品色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男人狂女人下面高潮的视频| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品一二三| 精品熟女少妇av免费看| 在线观看一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 青春草国产在线视频| 香蕉精品网在线| 亚洲欧洲日产国产| 男的添女的下面高潮视频| 国产色婷婷99| 国产成人aa在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 中文欧美无线码| 欧美激情国产日韩精品一区| 干丝袜人妻中文字幕| av免费在线看不卡| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久久久成人| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 黄色日韩在线| 人妻 亚洲 视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 观看美女的网站| 国产乱来视频区| 欧美高清成人免费视频www| 我的老师免费观看完整版| 五月玫瑰六月丁香| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久久久久成人| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲av成人精品一区久久| .国产精品久久| 国产成人91sexporn| 久久午夜福利片| 日本三级黄在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 久久99精品国语久久久| 久久97久久精品| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲av成人精品一二三区| 丝袜美腿在线中文| 中文在线观看免费www的网站| 插逼视频在线观看| 97在线视频观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲图色成人| 亚洲电影在线观看av| 色吧在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美清纯卡通| a级一级毛片免费在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 三级国产精品片| 在线观看国产h片| 联通29元200g的流量卡| 99热这里只有是精品在线观看| 色视频www国产| 色播亚洲综合网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 人人妻人人看人人澡| 欧美高清成人免费视频www| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜爱爱视频在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲精品久久久com| a级毛色黄片| tube8黄色片| 国产色爽女视频免费观看| 色5月婷婷丁香| 日韩电影二区| 又爽又黄a免费视频| 美女内射精品一级片tv| 日本wwww免费看| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产爽快片一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲欧美精品自产自拍| 丝袜喷水一区| 久久久久九九精品影院| 日日撸夜夜添| 亚洲欧美精品自产自拍| 黄色欧美视频在线观看| 性色av一级| 欧美zozozo另类| 高清日韩中文字幕在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 少妇人妻久久综合中文| 日韩av免费高清视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲av一区综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 听说在线观看完整版免费高清| 日韩成人av中文字幕在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人黄色视频免费在线看| 欧美日韩精品成人综合77777| 男人舔奶头视频| 中文资源天堂在线| 高清毛片免费看| 国产美女午夜福利| 九色成人免费人妻av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 天天一区二区日本电影三级| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 中文天堂在线官网| 日日撸夜夜添| 久久久久久久精品精品| 在线免费观看不下载黄p国产| a级一级毛片免费在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 少妇的逼好多水| 午夜爱爱视频在线播放| 午夜免费观看性视频| 欧美精品一区二区大全| 有码 亚洲区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91精品国产九色| 91精品一卡2卡3卡4卡| 我的老师免费观看完整版| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美国产精品一级二级三级 | 五月开心婷婷网| 亚洲精品成人久久久久久| 国产视频首页在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 联通29元200g的流量卡| 身体一侧抽搐| 成人国产av品久久久| 国产69精品久久久久777片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久久久久久久大av| 午夜老司机福利剧场| 欧美高清成人免费视频www| 草草在线视频免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 51国产日韩欧美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美国产精品一级二级三级 | 女人被狂操c到高潮| av.在线天堂| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产乱人偷精品视频| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲国产色片| 精品国产露脸久久av麻豆| 偷拍熟女少妇极品色| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩在线观看h| 高清欧美精品videossex| 国产成人一区二区在线| 五月玫瑰六月丁香| 日本三级黄在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 岛国毛片在线播放| 超碰av人人做人人爽久久| 在线观看一区二区三区激情| 国产真实伦视频高清在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 99re6热这里在线精品视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 亚洲四区av| 国产成人freesex在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 美女视频免费永久观看网站| freevideosex欧美| 久久久久精品性色| 精品熟女少妇av免费看| 成人无遮挡网站| 久久亚洲国产成人精品v| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品人妻偷拍中文字幕| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品国产av在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 少妇的逼好多水| 国产精品久久久久久精品古装| 国产毛片a区久久久久| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品久久久久久精品古装| 免费av不卡在线播放| 久久99热这里只有精品18| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 特级一级黄色大片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜亚洲福利在线播放| 51国产日韩欧美| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 97在线视频观看| 久热久热在线精品观看| av福利片在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 下体分泌物呈黄色| 人人妻人人看人人澡| 久久99精品国语久久久| 色视频在线一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲图色成人| 国产有黄有色有爽视频| 国产男人的电影天堂91| 久久久久精品性色| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品偷伦视频观看了| 国产高清有码在线观看视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 1000部很黄的大片| 日韩av免费高清视频| 少妇熟女欧美另类| 内射极品少妇av片p| 少妇人妻 视频| 日韩免费高清中文字幕av| 国产淫语在线视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品少妇久久久久久888优播| 国产91av在线免费观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲内射少妇av| 精品人妻熟女av久视频| av福利片在线观看| 欧美激情在线99| 亚洲无线观看免费| 中国国产av一级| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 2018国产大陆天天弄谢| 联通29元200g的流量卡| 国产成人精品婷婷| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲国产精品专区欧美| av黄色大香蕉| 国产成人免费观看mmmm| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美成人午夜免费资源| 99久久精品热视频| 新久久久久国产一级毛片| 精品国产三级普通话版| 国产久久久一区二区三区| 少妇丰满av| 精品一区二区三区视频在线| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲国产色片| 国产乱人视频| 熟女人妻精品中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美成人a在线观看| 精品酒店卫生间| av国产精品久久久久影院| 欧美激情国产日韩精品一区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女国产视频网站| 国产精品国产av在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 超碰av人人做人人爽久久| 在线播放无遮挡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人妻 亚洲 视频| 国产精品三级大全| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人福利小说| 国产精品国产av在线观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美高清成人免费视频www| 91久久精品国产一区二区三区| 久热这里只有精品99| 午夜激情久久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩av免费高清视频| 国产探花在线观看一区二区| 一级a做视频免费观看| av专区在线播放| 亚洲国产欧美人成| kizo精华| 日本av手机在线免费观看| 人妻一区二区av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在线播放无遮挡| 一级二级三级毛片免费看| 国产毛片在线视频| 久久97久久精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久午夜福利片| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 制服丝袜香蕉在线| 水蜜桃什么品种好| 亚洲真实伦在线观看| 性色av一级| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲伊人久久精品综合| 国产一区有黄有色的免费视频| 大码成人一级视频| 赤兔流量卡办理| 激情五月婷婷亚洲| 国产毛片在线视频| 亚洲国产精品成人综合色| 网址你懂的国产日韩在线| videossex国产| 色网站视频免费| 日本一二三区视频观看| 22中文网久久字幕| 性色av一级| av国产免费在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久成人免费电影| tube8黄色片| 亚洲国产欧美在线一区| 波多野结衣巨乳人妻| 舔av片在线| 麻豆成人av视频| 午夜亚洲福利在线播放| 波野结衣二区三区在线| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av日韩在线播放| 国产 精品1| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 久久久久久伊人网av| av在线老鸭窝| 有码 亚洲区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 色视频在线一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 性色avwww在线观看| 身体一侧抽搐| 人妻系列 视频| 久久国产乱子免费精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 日韩成人伦理影院| 久久6这里有精品| av福利片在线观看| 久久久久网色| 久久99蜜桃精品久久| 久久久久久久国产电影| 一本色道久久久久久精品综合| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久久国产a免费观看| 色5月婷婷丁香| 一二三四中文在线观看免费高清| av.在线天堂| 水蜜桃什么品种好| 日本色播在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 尾随美女入室| 亚洲精品影视一区二区三区av| 全区人妻精品视频| 少妇 在线观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲图色成人| 九色成人免费人妻av| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美zozozo另类| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精华霜和精华液先用哪个| 直男gayav资源| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲真实伦在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 色吧在线观看| 久久久欧美国产精品| 日本av手机在线免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产人妻一区二区三区在| 精品人妻熟女av久视频| 精华霜和精华液先用哪个| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲性久久影院| 天天躁日日操中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲成人中文字幕在线播放| av在线老鸭窝| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 岛国毛片在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| freevideosex欧美| 欧美成人午夜免费资源| 日韩av免费高清视频| 伦精品一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩一区二区三区影片| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲在线观看片| 舔av片在线| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品蜜桃在线观看| 国产男人的电影天堂91| 尾随美女入室| 性色avwww在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费av观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人毛片60女人毛片免费| 日韩一区二区三区影片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产老妇女一区| 乱系列少妇在线播放| 黄片wwwwww| 国产成人精品一,二区| 欧美一区二区亚洲| 欧美区成人在线视频| 下体分泌物呈黄色| 日韩伦理黄色片| 中文字幕久久专区| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲成人久久爱视频| 欧美bdsm另类| 午夜免费观看性视频| 国产成人免费无遮挡视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品婷婷| 国产欧美亚洲国产| 久久久久精品性色| 日韩精品有码人妻一区| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美精品一区二区大全| 国产91av在线免费观看| 夫妻午夜视频| 亚洲av二区三区四区| 久久精品夜色国产| 亚洲综合色惰| 亚洲无线观看免费| 国产在视频线精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 又爽又黄a免费视频| 我要看日韩黄色一级片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩制服骚丝袜av| 少妇的逼水好多| 六月丁香七月| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 听说在线观看完整版免费高清| 熟女电影av网| 成人二区视频| 亚洲av福利一区| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产av新网站| 熟女av电影| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品福利在线免费观看| 在线观看一区二区三区激情| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美精品一区二区大全| 亚洲图色成人| 国产精品精品国产色婷婷| 色网站视频免费| 久久精品久久久久久久性| 大码成人一级视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成年人午夜在线观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜视频国产福利| 精品久久久久久久末码| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人美女网站在线观看视频| 国产黄片视频在线免费观看| 男的添女的下面高潮视频| 久久精品国产a三级三级三级| 青春草亚洲视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品婷婷| 网址你懂的国产日韩在线| 三级国产精品片| 亚洲av免费在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 最近最新中文字幕免费大全7| 麻豆成人av视频| 在线免费十八禁| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av.av天堂| 天天一区二区日本电影三级| 51国产日韩欧美| 亚洲精品乱久久久久久| 国产成人freesex在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 七月丁香在线播放| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲精品第二区| 日韩三级伦理在线观看| 女人久久www免费人成看片| 三级国产精品片| 一级片'在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲成人一二三区av| 97在线视频观看| 成年女人看的毛片在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 深爱激情五月婷婷| 交换朋友夫妻互换小说|