乳酸克魯維酵母超量表達(dá)葡萄糖氧化酶的研究

李 娟,李國麗,翟立翔,李師翁,*,陳熙明

(1.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室,甘肅蘭州 730070;.中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

乳酸克魯維酵母超量表達(dá)葡萄糖氧化酶的研究

李 娟1,李國麗1,翟立翔1,李師翁1,*,陳熙明2

(1.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室,甘肅蘭州 730070;.中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

本研究應(yīng)用具有超量分泌表達(dá)能力的乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)、游離型載體pKDU7以及整合型表達(dá)載體pKLAC1,對具有5個氨基酸點突變的葡萄糖氧化酶(該突變酶的比活是野生型葡萄糖氧化酶的3.24倍)進(jìn)行分泌表達(dá)。最終獲得了一株可以超量分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的菌株,其最大產(chǎn)量為70±7 kU/L。這是現(xiàn)今已報道的分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶能力最高的乳酸克魯維重組菌株,為食品安全級的葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了新途徑。

葡萄糖氧化酶,乳酸克魯維酵母,表達(dá)

葡萄糖氧化酶能夠在有氧氣的條件下專一性地催化D-葡萄糖生成過氧化氫和葡萄糖酸。這類酶最早在黑曲霉中被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用。例如被用作面粉添加劑和食品保鮮劑[1],用來生產(chǎn)葡萄糖酸[2]以及作為腸道微生物菌群調(diào)節(jié)劑[3]。工業(yè)化生產(chǎn)中常用黑曲霉和青霉發(fā)酵來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶,然而在發(fā)酵過程中常會伴隨產(chǎn)生過氧化氫酶、淀粉酶等其他雜蛋白[4-5],給后期的純化工作帶來很大的困難,利用基因工程菌株重組表達(dá)有利于解決這一難題。前人已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了葡萄糖氧化酶[6],但其表達(dá)產(chǎn)物無翻譯后的加工與修飾過程,不能對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯。利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可對蛋白進(jìn)行翻譯,然而畢赤酵母并不是食品安全級酵母,不能應(yīng)用于食品行業(yè)。

乳酸克魯維酵母為美國FDA認(rèn)證的食品安全級酵母[7],其表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點:乳酸克魯維酵母表達(dá)的產(chǎn)物無需復(fù)雜的純化過程,可直接應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)中;發(fā)酵過程無產(chǎn)氣現(xiàn)象,不會發(fā)生爆罐;在發(fā)酵過程中所需的誘導(dǎo)劑是乳糖或半乳糖,所以更安全;可用來高密度發(fā)酵。然而該系統(tǒng)的缺點是蛋白表達(dá)量相對畢赤酵母發(fā)酵系統(tǒng)較低。前人利用畢赤酵母作為宿主對葡萄糖氧化酶進(jìn)行異源表達(dá)獲得40 kU/L葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量[8],而利用乳酸克魯維酵母為宿主對葡萄糖氧化酶進(jìn)行異源表達(dá)的葡萄糖氧化酶產(chǎn)量僅為2 kU/L[9]。

表1 不同表達(dá)載體的擴增條件

在乳酸克魯維酵母中有許多限制因子,如抑制分泌表達(dá)的基因KlSEL1,該基因的突變可以有效提升蛋白分泌表達(dá)能力5倍左右[10],所以該突變更有利于葡萄糖氧化酶的表達(dá)。另外在酵母中提高目的基因的拷貝數(shù)也可以有效提高蛋白的表達(dá)水平。本研究應(yīng)用具有超量分泌表達(dá)能力的乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)游離型載體pKDU7[11]和整合型表達(dá)載體pKLAC1,對具有5個氨基酸點突變的葡萄糖氧化酶(N2Y、K13E、T30V、I94V和K152R)進(jìn)行了分泌表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH52(菌株由本實驗室保存),乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)MD2/1菌株和游離型載體pKLDU7由威尼斯Vilniu大學(xué)生物技術(shù)研究所Kestuis Sasnauskas博士惠贈。pKLAC1載體購自NEB公司。

Pfu DNA Polymerase 大連寶生物(TaKaRa)生物工程有限公司;DNA片段回收試劑盒 百泰克生物工程公司;PCR引物 由上海生工生物工程有限公司合成;基因測序 由北京六合華大基因有限公司完成;限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶 購自NEB公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 DNA電泳儀JY3000 北京君逸電泳儀公司;SA-1000凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech上海吉泰依科賽生物科技有限公司;分析天平FA1004N 上海精科儀器有限公司;小型垂直蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司;氣浴恒溫振蕩器THZ-82B 江蘇正基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(1L):10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g NaCl。

YPD培養(yǎng)基(1L):20 g胰蛋白胨,10 g酵母提取物,20 g葡萄糖。

YPGal培養(yǎng)基(1L):20 g胰蛋白胨,10 g酵母提取物,20 g半乳糖。

YCB培養(yǎng)基(1L):5 mmol/L酰胺,1%葡萄糖,0.1% KH2PO4,0.05% MgSO4,0.01% NaCl,0.01% KCl,1 mmol/L精氨酸,1 mmol/L賴氨酸,微量元素及維生素。

YDFM培養(yǎng)基(1L):10 g硫酸銨,30 g蔗糖,1 mmol/L精氨酸,1 mmol/L賴氨酸,11.83 g KH2PO4,2.29 g K2HPO4,1 g MgSO4,0.33 g CaCl2,1 g NaCl,1 g KCl,微量元素及維生素[13]。

1.2.2 葡萄糖氧化酶基因的合成與整合型質(zhì)粒pKLACGOX的構(gòu)建 野生型葡萄糖氧化酶首先是在黑曲霉(Aspergillusniger)中發(fā)現(xiàn)并報道。該酶基因全長1749 bp,編碼583個氨基酸。根據(jù)Prodanovic R等的報道[12],葡萄糖氧化酶中5個氨基酸的點突變(N2Y、K13E、T30V、I94V和K152R)可提高該酶的活性3.24倍。因此,我們根據(jù)乳酸克魯維酵母的密碼子使用偏好,我們采用全基因合成的方式,對點突變后的葡萄糖氧化酶所對應(yīng)的DNA序列進(jìn)行了合成。

為構(gòu)建pKLACGOX表達(dá)載體,根據(jù)合成的葡萄糖氧化酶基因序列,設(shè)計引物pKLAC-F(5′-CACCTCGAGAAAAGATCCTATGGTATTGAAGC-3′)和pKLAC-R(5′-GTCGGTACCTTATTGCATACTT GCGTAATCTTCC-3′),在上下游引物中分別引入XhoI和KpnI酶切位點。以合成的葡萄糖氧化酶基因質(zhì)粒DNA為模板,使用pKLAC-F和pKLAC-R進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增條件見表1。用膠回收試劑盒回收擴增片段?；厥蘸蟮臄U增片段與PMD18T載體進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌后挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

測序驗證后的陽性克隆,在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴繁,并提取質(zhì)粒使用XhoI和KpnI進(jìn)行雙酶切,酶切后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對目的片段進(jìn)行檢測和回收。為使回收后的葡萄糖氧化酶片段插入pKLAC1載體,對pKLAC1載體同樣使用XhoI和KpnI進(jìn)行了雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后對載體片段進(jìn)行了回收?；厥蘸蟮钠咸烟茄趸钙魏蚿KLAC1載體使用T4連接酶16 ℃過夜連接后,轉(zhuǎn)化DH5a后使用菌落PCR方法鑒定陽性克隆。

1.2.3 游離型質(zhì)粒pKLDUGOX的構(gòu)建 用SacII限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pKLACGOX進(jìn)行酶切,將酶切后的較大片段(6430 bp)使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收待用。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將酶切后的大片段DNA轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母MD2/1中。在YCM培養(yǎng)基中篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。通過液體YPD對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng),并利用酵母DNA提取試劑盒提取DNA。以酵母基因組為模板,利用引物P1:GTCAGTGGGCCGAAATATG和P2:ATACAACATCG AAGAAGAGTCTTTCTTTAGG對其中整合的PLAC4-PBI-GOX進(jìn)行擴增。PCR擴增條件見表1。用膠回收試劑盒回收擴增片段。將游離型質(zhì)粒pKDU7用SmaI進(jìn)行酶切,37 ℃條件下1 h。將從酵母中擴增出的PLAC4-PBI-GOX片段和酶切好的質(zhì)粒pKDU7用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中,在含氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆。挑取陽性菌落擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒后分別進(jìn)行菌落PCR。PCR鑒定正確的陽性質(zhì)粒送往華大測序,用來確認(rèn)序列和讀碼框,最后驗證無誤的重組質(zhì)粒命名為pKLDUGOX。

1.2.4 整合型質(zhì)粒pKLACGOX的轉(zhuǎn)化 用SacII限制性內(nèi)切酶將pKLACGOX質(zhì)粒進(jìn)行線性化,并濃縮回收。挑取乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)MD2/1的單菌落,將其接種到10 mL的YPD培養(yǎng)基中,30 ℃搖菌過夜。使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)MD2/1中,在含有尿嘧啶的YCB培養(yǎng)基平板上30 ℃培養(yǎng)4 d后進(jìn)行鑒定。具體轉(zhuǎn)化方法見參考文獻(xiàn)[14]。由于受體菌乳酸克魯維酵母MD2/1既是尿嘧啶缺陷型,又是KlSEL1基因突變型,pKLAC1載體攜帶乙酰胺降解基因,因此只有線性化pKLACGOX片段整合到酵母基因組中才能在含有尿嘧啶的YCB平板上生長。挑取長出來的單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)好的菌一部分用來保存菌種,命名為MD2/1-pKLACGOX,另一部分用來提DNA。用同上轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pKLAC1轉(zhuǎn)到乳酸克魯維酵母(KlSEL1基因突變型)菌株MD2/1中,命名為MD2/1-pKLAC1菌株。

1.2.5 游離型質(zhì)粒pKLDUGOX的轉(zhuǎn)化 挑取MD2/1-pKLACGOX的單菌落,將其接種到10 mL的YPD培養(yǎng)基中,30 ℃搖菌過夜。之后轉(zhuǎn)化方法與將pKLACGOX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株MD2/1中相同。取200 μL菌液涂布于YCB培養(yǎng)基平板上,30 ℃培養(yǎng)4 d后進(jìn)行鑒定。由于受體菌MD2/1-pKLACGOX攜帶乙酰胺降解基因,pKDU7載體攜帶尿嘧啶合成代謝基因,因此只有轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆才能在不含尿嘧啶的YCB平板上生長。在YCB平板上生長出來的單菌落既是陽性轉(zhuǎn)化子。挑取長出來的單菌落在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),取一部分培養(yǎng)好的菌進(jìn)行菌種保存,命名為MD2/1-15BGOX,另一部分用來提DNA。用同上轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pKDU7轉(zhuǎn)化到MD2/1-pKLAC1菌株中,即為對照菌株,命名為MD2/1-15B。

1.2.6 乳酸克魯維酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將工程菌株MD2/1-15BGOX接種于20 mL YPGal的三角瓶中,30 ℃,220 r/min在搖床中進(jìn)行培養(yǎng),分別在0、24、48、72、96、120、144、168 h取上清1 mL離心,收集上清并保存。另外同樣將工程菌株MD2/1-15BGOX接種于20 mL YDFM為培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃,220 r/min在搖床中進(jìn)行培養(yǎng),每24 h補一次蔗糖,共補蔗糖40 g/L,之后再用終濃度為20 g/L的半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo),分別在0、24、48、72、96、120、144和168 h取上清1 mL離心,收集上清并保存。

1.2.7 不同誘導(dǎo)時間表達(dá)產(chǎn)物的分析和鑒定 將上清液進(jìn)行酶活測定和SDS-PAGE的分析,檢測重組蛋白的表達(dá)含量。根據(jù)誘導(dǎo)的不同時間測定葡萄糖氧化酶的活性,測定方法如下:在100 μL體系中加入10 μL 1 mol/L NaH2PO4,pH6.0,10 μL 100 mmol/L葡萄糖,0.75 mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.1 U辣根過氧化物酶以及10 μL葡萄糖氧化酶液體,并用去離子水補至100 μL。于30 ℃反應(yīng)30 min后加入134 μL 12 mol/L的硫酸反應(yīng),540 nm測定吸光值。不同時間酶活測定分別測3個平行。葡萄糖氧化酶酶活定義:pH6.0、30 ℃的條件下,每分鐘能把 1.0 μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2的酶量為一個單位。SDS-PAGE的分析方法詳見[15]。

1.2.8 不同溫度在不同時間下對葡萄糖氧化酶酶活影響的測定 首先將葡萄糖氧化酶液體各取100 μL分別放在37、42、50、60 ℃的水浴鍋中,在1、2、3、4 h后分別測其酶活,每個測3個平行。測定方法:同1.2.6。

1.2.9 pH對葡萄糖氧化酶酶活影響的測定 測定方法如下:在100 μL體系中加入10 μL1 mol/L的不同pH的緩沖液,10 μL 100 mmol/L葡萄糖,0.75 mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.1 U辣根過氧化物酶以及10 μL葡萄糖氧化酶液體,并用去離子水補至100 μL。于30 ℃反應(yīng)30 min后加入134 μL 12 mol/L的硫酸反應(yīng),540 nm測定吸光值,各測3個平行。不同pH的緩沖液為:3.0、4.0、5.0(50 mmol/L乙酸鹽);6.0、7.0、8.0(50 mmol/L 羥乙基哌嗪乙磺酸);9.0、10.0、11.0、12.0(50 mmol/L Tris)[7]。

1.2.10 不同NaCl濃度對葡萄糖氧化酶酶活影響的測定 測定方法如下:在100 μL體系中加入10 μL 1 mol/L NaH2PO4,pH6.0,10 μL 100 mmol/L葡萄糖,0.75 mg/mL鄰聯(lián)茴香胺,0.1 U辣根過氧化物酶以及10 μL葡萄糖氧化酶液體,并用不同鹽濃度溶液補至100 μL。于30 ℃反應(yīng)30 min后加入134 μL 12 mol/L的硫酸反應(yīng),540 nm測定吸光值,各測3個平行。不同NaCl濃度分別為:50、100、200、300、400、500、600、750、1000、1200、1500、2000 mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)每個3個平行,利用Origin 7.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖,并用SAS 8.01進(jìn)行統(tǒng)計分析,進(jìn)行t檢驗,以p<0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶基因表達(dá)片段的PCR擴增

通過Pfu DNA Polymerase獲得了大小約為1749 bp的擴增片段(圖1),這與黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列大小一致。

圖1 PCR擴增-葡萄糖氧化酶基因Fig.1 glucose oxidase gene after PCR amplification注：1-DNA Marker;2-目的基因PCR產(chǎn)物。

2.2 重組整合型質(zhì)粒pKLACGOX的鑒定

如圖2所示,葡萄糖氧化酶基因經(jīng)過PCR擴增后,與整合型表達(dá)載體pKLAC1連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pKLACGOX,目標(biāo)基因之后連接有GOX基因序列。將連接好的表達(dá)載體進(jìn)行PCR擴增鑒定,繼而進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果見圖3。將該陽性質(zhì)粒送交北京六合華大基因測序有限公司測序,結(jié)果顯示基因序列完整,無堿基突變,且重組表達(dá)載體的讀碼框正確,表達(dá)載體pKLACGOX構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pKLACGOX的結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic map of the recombinant plasmid pKLACGOX

圖3 質(zhì)粒pKLACGOX的酶切鑒定Fig.3 Identification of the plasmid pKLACGOX by endonuclease digestion注：M-DNA Marker;1-質(zhì)粒pKLACGOX; 2-質(zhì)粒pKLACGOX經(jīng)Xho I單酶切后的片段； 3-質(zhì)粒pKLACGOX經(jīng)Xho I/Kpn I酶切后的片段。

2.3 重組游離型質(zhì)粒pKLDUGOX的鑒定

如圖4所示,通過將整合有pKLACGOX質(zhì)粒的陽性酵母菌株的DNA上擴增獲得的PLAC4-PBI-GOX通過平末端連接整合入pKDU7中,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pKLDUGOX。將連接好的表達(dá)載體進(jìn)行PCR擴增鑒定,結(jié)果見圖5。將該陽性質(zhì)粒送交北京六合華大基因測序有限公司測序,結(jié)果顯示基因序列完整,無堿基突變,且重組表達(dá)載體的讀碼框正確,表達(dá)載體pKLDUGOX構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pKLDUGOX的結(jié)構(gòu)Fig.4 Genetic map of the recombinant plasmid pKLDUGOX

圖5 質(zhì)粒pKLDUGOX的PCR擴增鑒定Fig.5 Determination of the plasmid pKLDUGOX using PCR amplictiaon注：1-DNA Marker;2-用陽性轉(zhuǎn)化子為模板對插入片段擴增; 3-用陰性對照-質(zhì)粒pKLDU7為模板對插入片段擴增。

2.4 化學(xué)法轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母陽性的篩選

為了進(jìn)一步鑒定陽性菌株能否產(chǎn)葡萄糖氧化酶,我們在含有葡萄糖、乳糖、鄰聯(lián)茴香胺及辣根過氧化物酶的固體培養(yǎng)基中對兩種菌株進(jìn)行培養(yǎng),僅在含有葡萄糖氧化酶表達(dá)菌株處出現(xiàn)了棕色(圖6),而該顏色為表達(dá)的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖與氧氣形成的過氧化氫與鄰聯(lián)茴香胺受到辣根過氧化物酶偶聯(lián)催化形成的顯色反應(yīng)。

圖6 重組葡萄糖氧化酶菌株的顯色反應(yīng)鑒定Fig.6 Identification of the glucose oxidase recombinant strain using the chromogenic reaction注：左圖-對照菌株,右圖-陽性菌株。

2.5 葡萄糖氧化酶表達(dá)活性檢測及表達(dá)量分析

圖7 重組菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中葡萄糖氧化酶的酶活的變化Fig.7 The glucose oxidase activity induced by galactose during flask-shaking fermentation of the recombinant strain

為了進(jìn)一步了解工程菌株MD2/1-15BGOX對葡萄糖氧化酶重組表達(dá)的能力,將菌株MD2/1-15BGOX在不同誘導(dǎo)時期進(jìn)行取樣。圖7表明隨著誘導(dǎo)時間的延長發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶活性逐漸上升,在誘導(dǎo)72 h后葡萄糖氧化酶活性出現(xiàn)快速升高。在120 h后發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶活性達(dá)到最高為(70±7) kU/L。由t檢驗可知,p<0.05。圖7中不同字母表示處理間的差異具有顯著性,顯著性大小依次是A>B>C>D>E,標(biāo)有字母DE表示差異不顯著。圖8中,我們利用SDS-PAGE分析上清中蛋白表達(dá)量的變化,在葡萄糖氧化酶理論分子量66 kDa處并未出現(xiàn)高表達(dá)的特異條帶,然而在分子量>110 kDa(*)條帶處隨著誘導(dǎo)時間的延長條帶顏色逐漸加深,這與圖7呈現(xiàn)的結(jié)果一致。也與Marija Blazic[14]等人報道的用釀酒酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶的分子量的結(jié)果相符合。

圖8 搖瓶發(fā)酵液SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of the supernatant from the flask-shaking fermentation of the recombinant strain

為了去除由于培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物對乳酸克魯維酵母分泌表達(dá)蛋白的影響,我們使用了YDFM培養(yǎng)基對MD2/1-15BGOX進(jìn)行了培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)。YDFM是一種僅由蔗糖與硫酸銨為唯一碳氮源的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基。利用YDFM對MD2/1-15BGOX培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期,加入終濃度為20 g/L的半乳糖對葡萄糖氧化酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。盡管隨著誘導(dǎo)時間的延長發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶活性也在逐漸上升,但是相比在YPGal中葡萄糖氧化酶活性卻低得多,誘導(dǎo)120 h后上清的酶活僅有16 kU/L。通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)MD2/1-15BGOX在YDFM中表達(dá)蛋白的種類相對較少,僅在分子量>110 kDa處有一條特異條帶其余蛋白條帶均小于葡萄糖氧化酶預(yù)計蛋白分子量(圖8)。因此說明乳酸克魯維酵母表達(dá)的葡萄糖是糖基化程度較高的蛋白,且該蛋白具有良好的葡萄糖氧化酶活性。

2.6 pH、溫度和鹽濃度對葡萄糖氧化酶酶活的影響

我們研究了不同pH、不同溫度、不同NaCl濃度脅迫對葡萄糖氧化酶酶活的影響。從圖9中可以看出最大酶活在pH為4時,達(dá)(79.45±11) kU/L。葡萄糖氧化酶工作的正常pH范圍為4～7,這個結(jié)果與之前的報道是相符的[9,17]。在堿性pH下酶活很低,圖10表明,在37 ℃培養(yǎng)4 h期間,酶活都比較穩(wěn)定。然而隨著溫度的逐漸上升,葡萄糖氧化酶加速失活,Gouda MD[18]等人研究表明A. niger葡萄糖氧化酶在大于50 ℃后活性喪失。從圖11表明,隨著鹽濃度的升高,酶活逐漸降低,這說明高鹽對葡萄糖氧化酶活性具有強烈的抑制作用。

圖9 不同pH對葡萄糖氧化酶酶活的影響Fig.9 Effect of pH on the glucose oxidase activity

圖10 不同溫度對葡萄糖氧化酶酶活的影響Fig.10 Effect of temperature on the glucose oxidase activity

圖11 不同NaCl濃度對葡萄糖氧化酶酶活的影響Fig.11 Effect of NaCl concentrations on the glucose oxidase activity

3 結(jié)論與討論

葡萄糖氧化酶是一種重要的工業(yè)用酶,盡管前人曾利用乳酸克魯維酵母對葡萄糖氧化酶進(jìn)行了重組表達(dá),但最大表達(dá)量只有2 kU/L,且在這些重組表達(dá)的葡萄糖氧化酶中約有21%結(jié)合在酵母細(xì)胞壁上并未分泌至上清中[9]。相比前人的酵母表達(dá)系統(tǒng),本研究構(gòu)建的乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌葡萄糖氧化酶至發(fā)酵上清液中的效率高達(dá)(70±7) kU/L,是前人報道的35倍。對比分析表明本研究的表達(dá)系統(tǒng)具有高的表達(dá)效率的原因是:我們既利用了游離表達(dá)載體又利用了整合表達(dá)載體,在這兩種載體的共同存在下可以保證酵母表達(dá)過程中的高基因拷貝數(shù)及高穩(wěn)定性;我們利用了強的誘導(dǎo)表達(dá)啟動子Lac4,該啟動子是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)在乳酸克魯維酵母中啟動效率最高的誘導(dǎo)型啟動子[19]。SDS-PAGE的結(jié)果表明在66 kDa處尚未發(fā)現(xiàn)特異性的蛋白條帶,然而僅在>110 kDa處發(fā)現(xiàn)了特異蛋白條帶隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加。該結(jié)果與前人對乳酸克魯維酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶的研究結(jié)果相符,所以我們推測這條>110 kDa的特異蛋白條帶為糖基化后的葡萄糖氧化酶[7]。前人對黑曲霉中的葡萄糖氧化酶進(jìn)行直接提純研究,發(fā)現(xiàn)這些葡萄糖氧化酶具有非常高的比活且具有高分子量的糖基化修飾[8]。這也表明高分子量糖基化修飾葡萄糖氧化酶是影響高效率表達(dá)葡萄糖氧化酶的關(guān)鍵。此外,高pH、高溫、高鹽易造成酶的構(gòu)象的改變,從而使酶的催化功能減弱甚至喪失。

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Over-expression of glucose oxidase gene in the YeastKluyveromyceslactisKlSEL1 strain

LI Juan1,LI Guo-li1,ZHAI Li-xiang1,LI Shi-weng1,*,CHEN Xi-ming2

(1.School of Chemical and Biological Engineering,Lanzhou Jiaotong University;Key Laboratory of Extreme Environmental Microbial Resources and Engineering of Gansu Province,Lanzhou 730070,China;2.Northwest Institute of Eco-Environment and Resources,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

In this study,the glucose oxidase gene with five amino acid sites-directed mutagenesis was synthesized. The activity of this mutant enzyme was 3.24 times than that of the wild type enzyme. The episomal vector pKDU7 and integrative vector pKLAC1 in which the glucose oxidas gene was recombined was constructed. Using these two vectors,the glucose oxidase gene was successfully recombined intoK.lactisKlSEL1 strain and a recombinant strain with efficient secretory over-expression of glucose oxidase was obtained. The result of flask-shaking fermentation showed that the production of glucose oxidase reached 70±7 kU/L in the recombinant strain. This is the highest glucose oxidase-producing recombinantK.lactisstrain reported so far. This technology will provide a promising approach for the production and application of glucose oxidase in food industry.

glucose oxidase;Kluyveromyceslactis;expression

2016-09-28

李娟(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究，E-mail:18293130625@163.com。

*通訊作者:李師翁(1964-)，男，博士，教授，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究，E-mail:lishweng@mail.lzjtu.cn。

國家自然基金(31400437)資助。

TS202.3

A

1002-0306(2017)05-0168-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.023